Khóa luận

Khóa luận

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin gửi tới bố mẹ, anh chị cùng bạn bè, những người mà đãluôn quan tâm, ủng hộ và là chỗ dựa cho tôi trong suốt thời gian tôi làm khóa luậnnày, cũng như trong cuộc sống.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Phương Thuận - chủnhiệm bộ môn Hóa sinh - trường ĐH Khoa học tự nhiên Hà Nội, đã giúp đỡ hết sứctận tình để tôi hoàn thành khóa luận này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối tới TS Nguyễn Văn Đồng đã tận tìnhgiúp đỡ, hướng dẫn trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ to lớn, những ýkiến đóng góp quý báu, sự hướng dẫn tận tình của Ths Hà Văn Chiến trong quátrình tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm trọng điểm Côngnghệ tế bào thực vật - Viện Di truyền nông nghiệp về sự giúp đỡ nhiệt tình trongsuốt thời gian tôi thực hiện khóa luận.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường ĐH Khoa học Tự nhiên -ĐH Quốc Gia Hà Nội đã giúp đỡ nhiệt tình và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trongthời gian học tập cũng như khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với những giúp đỡ quý báu đó.

Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2010

Bùi Thúy Hiền

DNA : Deoxirionucleic Acid

FAO : Food and Agriculture Organization GFP : Green Fluorescent Protein

MS : Murashige and Skoog, 1962 α-NAA : α-Napthalene acetic acid

NPT II : Neomycin Phosphotransferase II PCR : Polymerase Chain Reaction Ti-plasmid : Tumor-Including Plasmid T-DNA : Transfer-DNA

USDA : United States Department of Agriculture Vir : virulence

Hình 6 Quy trình nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian biến nạp 30

Hình 7 Quy trình thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn 31

Hình 8 Quy trình chuyển gen vào giống đậu tương ĐT26 33

Hình 9 Biểu hiện gus ở thí nghiệm xác định chủng vi khuẩn A.tumefaciens 39

Hình 10 Ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch khuẩn (OD) đến tần 41

Hình 11 Ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến tỷ lệ mẫu sống 43

Hình 12 Đậu tương ĐT26 với thời gian biến nạp 43

Hình 13 Đậu tương ĐT26 sau thí nghiệm sử dụng kim gây 45

Hình 14 Ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm và trụ dưới 46

Hình 15 Các bước xây dựng quy trình tái sinh đậu tương sau chuyển gen 49

Hình 16 Điện di ADN tổng số tách từ lá cây thí nghiệm 50

Hình 17 Ảnh hưởng của hygromycin khi thử nghiệmvới mẫu lá cây thí nghiệm và cây đối chứng 50 Hình 18 Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen gus 51

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây 9

Bảng 2 Tình hình sản xuất đậu tương của 4 nước đứng đầu trên thế giới trong những năm gần đây 9 Bảng 3 Các nước nhập khẩu đậu tương hàng đầu Châu Á (nghìn tấn) 10

Bảng 4 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam những năm gần đây 10

Bảng 5 Hệ thống các gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker genes) và các gen chỉ thị sàng lọc (screenable marker genes) 16

Bảng 6 Nồng độ và thời gian khử trùng của Ethanol và NaClO 37

Bảng 7 Kết quả thí nghiệm thử nồng độ và thời gian khử trùng 37

Bảng 8 Kết quả biểu hiện của ĐT26 đối với các chủng vi khuẩn 39

Bảng 9 Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch 40 Bảng 10 Hiệu suất biến nạp vào đậu tương theo thời gian biến nạp 42

Bảng 11 Hiệu suất biến nạp vào đậu tương theo thời gian biến nạp 45

Bảng 12 môi trường MS (PH=5,6-5,8) 58

Bảng 13 Môi trường LB (PH = 7) 58

Bảng 14 Môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu 59

Chương I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu chung về đậu tương 4 1.1.1 Nguồn gốc 4 1.1.2 Phân loại 4 1.1.3 Vai trò của đậu tương 4

1.1.4 Sinh thái đậu tương 6 1.1.5 Đặc tính của cây đậu tương 6

1.1.5.1 Tính chịu lạnh61.1.5.2 Tính chịu hạn71.1.5.3 Tính chịu đựng và khả năng phục hồi 7

1.1.5.4 Biến động di truyền về phản ứng với yếu tố bất lợi 8

1.1.6 Đặc tính sinh học của giống đậu tương ĐT26 8

1.2 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam9 1.2.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới 9

1.2.2 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam 10

1.3 Vi khuẩn A.tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen ở thực vật 11 1.3.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn A tumefaciens 11

1.3.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 12

1.3.3 Cấu trúc và chức năng của T-ADN 13

1.3.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A tumefaciens 14

1.3.5 Các vector biến nạp thực vật không gây ung thư dựa trên Ti-plasmid 14 1.3.6 Các gen chỉ thị chọn lọc và sàng lọc 15 1.3.7 Hệ thống vector pCAMBIA 17

1.3.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp thông qua A.tumefaciens.19

1.4 Cây trồng biến đổi gen và cây đậu tương biến đổi gen21

1.4.1 Cây trồng biến đổi gen trên thế giới và việt nam 21 1.4.2 Cây đậu tương biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam 22

Chương II - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 242.1 Vật liệu nghiên cứu24

2.1.1 Các thiết bị thí nghiệm 24 2.1.2 Hóa chất và môi trường 24 2.1.3 Vi khuẩn 24

2.1.4 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Tạo nguồn vật liệu vô trùng 24

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaClO và thời gian khử trùngở giai đoạn khử trùng mẫu 242.2.2 Chuyển gen gus vào đậu tương 25Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn thích hợp nhất với ĐT26 25Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của OD dịch khuẩn đến khả năng biểu hiệngus của ĐT26 27

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu quả chuyểngen gus vào ĐT26 29

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm đến sựbiểu hiện của gen gus trên ĐT26 30Thí nghiệm 6: Xây dựng quy trình tái sinh cây chuyển gen 32Thí nghiệm 7: Phân tích cây chuyển gen T0 34

2.3 Các chỉ tiêu đánh giá35

Chương III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Tạo nguồn vật liệu vô trùng36

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaClO và thời gian khử

trùng ở giai đoạn khử trùng mẫu 36

3.2 Chuyển gen gus vào đậu tương 38 3.2.1 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn thích hợp nhất với ĐT2638 3.2.2 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của OD dịch khuẩn đến khả năng biểu hiện gus của ĐT26. 40 3.2.3 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu suất chuyển gen gus vào ĐT26 42

3.2.4 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm đến sự biểu hiện của gen gus trên ĐT26 44

3.2.5 Thí nghiệm 6: Xây dựng quy trình tái sinh cây chuyển gen 47

3.2.6 Thí nghiệm 7: Tách ADN và phân tích cây chuyển gen 49

MỞ ĐẦU

Đậu tương (Glycine max(L.) Merr) hay còn gọi là đậu nành, là cây công

nghiệp ngắn ngày có hiệu quả kinh tế và giá trị dinh dưỡng cao Khó có thể tìm thấy cây trồng nào có tác dụng nhiều mặt như cây đậu tương Là thức ăn có giá trị dinh dưỡng cao, rất giàu protein thực vật, chứa nhiều loại vitamin và chứa một lượng lớn axit béo chưa bão hòa rất tốt cho sức khỏe Trong công nghiệp, đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng,…nhưng chủ yếu đậu tương dùng để ép dầu Hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật Trong nông nghiệp, đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc, phân bón Ngoài ra, đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt, 1ha trồng đậu tương nếu sinh trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30-60kg N [10]

Tuy nhiên, với tình hình khí hậu trên trái đất đang biến đổi không ngừng, nhiệt độ trái đất càng ngày càng tăng cao, từ đó dẫn đến các thiên tai (lũ lụt, hạn hán, bệnh dịch,…) gây ảnh hưởng không nhỏ đến sự sinh trưởng, phát triển của các loại cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng Vì thế để tăng năng suất và chất lượng thì ngoài việc thực hiện chăm sóc, gieo trồng tốt còn phải tập trung nghiên cứu nhằm cải thiện các loại giống để chúng có thể cho năng suất cao, chống chịu được các điều kiện ngoại cảnh bất lợi tốt nhờ những ứng dụng to lớn của công nghệ sinh học hiện đại.

Trong hơn một thập niên vừa qua, công nghệ sinh học nói chung và cây trồng biến đổi gen nói riêng đã có những bước phát triển vượt bậc Từ khoảng 1 triệu ha đầu tiên năm 1996 trồng tại Châu Mỹ, đến tháng 12 năm 2009, toàn thế giới đã có 134 triệu ha cây trồng biến đổi gen [20], tăng 80 lần so với năm 1996 và tăng 9 triệu ha so với năm 2008 (125 triệu ha) Trong đó đậu tương biến đổi gen là loại cây biến đổi gen nổi bật nhất, có tới 69,7 triệu ha chiếm 52% trong tổng diện tích cây biến đổi gen toàn thế giới và chiếm tới 75% trong tổng diện tích 90 triệu ha trồng đậu tương trên thế giới [14]

Các đánh giá mới nhất về tác động của cây chuyển gen cho thấy trong khoảng thời gian từ năm 1996 đến năm 2008, lợi ích kinh tế trị giá 51,9 tỷ USD mà

(50%) và tăng năng suất thu hoạch bền vững (50%) Số sản lượng tăng thêm này nếu không sử dụng các giống cây chuyển gen thì sẽ cần thêm 62,6 triệu ha để tạo ra chúng Vì thế công nghệ sinh học giúp tiết kiệm diện tích trồng trọt, giảm được lượng thuốc trừ sâu ở mức 365 triệu kg, ứng với 8,4% tổng lượng thuốc trừ sâu sửu dụng trong nông nghiệp Chỉ tính riêng trong năm 2008, lượng khí CO2 được cây biến đổi gen hấp thụ là 14,4 tỷ kg, tương đương với lượng khí thải mà 7 triệu chiếc oto thải ra.

Nước ta là một nước nông nghiệp với đặc điểm nổi bật là mật độ dân số cao vào loại nhất thế giới, bình quân đất nông nghiệp trên đầu người chỉ đạt khoảng 765m2/người Diện tích đang ngày càng thu nhỏ lại, nhường chỗ cho thành thị, đường giao thông, khu dịch vụ và phát triển công nghiệp Ước tính hàng năm chúng ta mất 50000-70000 ha đất canh tác Trong khi đó biến đổi khí hậu toàn cầu, kéo theo sự xâm mặn nghiêm trọng, mưa gió bất thường gây ra hạn hán, lũ lụt, dịch bệnh đang đe dọa an ninh lương thực của đất nước Liên hợp quốc đã xếp Việt Nam vào một trong 8 nước có nguy cơ về an ninh lương thực ở Châu Á Đặc biệt, trong điều kiện mất đất canh tác, với mức tăng dân số như hiện nay, ngành nông nghiệp phải cung cấp thêm cho đất nước ít nhất 1 triệu tấn lương thực hàng năm

Đậu tương là loại cây trồng được quan tâm và chú trọng nhất hiện nay, theo thống kê đến tháng 03/2010 diện tích trồng đậu tương của nước ta ở thời điểm này là 123,9 nghìn ha [12], sản lượng bình quân là 20 tạ/ha [11] Tuy vậy nhưng hàng năm nước ta vẫn phải nhập khẩu một số lượng lớn đậu tương 2300 nghìn tấn (2009) [11], đứng thứ hai trên toàn Châu Á sau Indonesia Bên cạnh đó, cây trồng biến đổi gen nói chung và đậu tương biến đổi gen nói riêng đã được chính phủ Việt Nam cho phép trồng rộng rãi bắt đầu từ năm 2011.

Xuất phát từ thực tế đó trong thời gian thực tập tốt nghiệp, chúng tôi đã tiến

hành thực hiện đề tài “Bước đầu xây dựng quy trình chuyển gen gus vào giốngđậu tương ĐT26 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”

♦ Mục đích và yêu cầu của đề tài:

- Mục đích:

Xây dựng quy trình công nghệ chuyển gen gus có hiệu quả nhất để từ đó áp

dụng chuyển các gen khác như gen kháng hạn, gen kháng sâu bệnh, gen kháng thuốc diệt cỏ,…nhằm cải tạo giống đậu tương của Việt Nam.

- Yêu cầu: Trong khuôn khổ một bản đồ án tốt nghiệp, chúng tôi tập trung

nghiên cứu cụ thể các nội dung sau:

* Nghiên cứu tạo vật liệu vô trùng ban đầu

* Nghiên cứu quy trình biến nạp hiệu quả nhất, trong đó có:

 Xác định chủng vi khuẩn có khả năng chuyển gen hiệu quả nhất  Xác định mật độ quang (OD) của dung dịch khuẩn thích hợp nhất  Xác định thời gian biến nạp thích hợp nhất

 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp gây tổn thương nốt lá mầm đến hiệu quả biến nạp.

 Xây dựng quy trình tái sinh cây đậu tương chuyển gen  Phân tích cây chuyển gen T0

Chương I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về đậu tương

1.1.1 Nguồn gốc

Đậu tương là một trong những loại cây trồng mà loài người đã biết sử dụng và trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu tương cũng sớm được xác minh Những bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều công nhận rằng đậu tương có nguyên sản ở Châu Á và có nguồn gốc từ Trung Quốc Cây đậu tương được thuần hóa ở Trung Quốc qua nhiều triều đại tiền phong kiến và được đưa vào trồng trọt và khảo sát có thể trong triều đại Shang năm 1700-1100 trước B.Cds

1.1.2 Phân loại

Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành có tên khoa học là Glycine max(L.) Merr

theo khóa phân loại của Hymowitz, T and C.A Newell [19] căn cứ vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể, nó thuộc:

Bộ đậu : Fabales Họ đậu : Fabaceae Phân họ : Leguminosae Chi : Glycine

Đậu tương trồng có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 40 là loại cây trồng mang lại giá trị kinh tế cũng như giá trị dinh dưỡng cao.

1.1.3 Vai trò của đậu tương

Cây đậu tương là nguồn thực phẩm có giá trị kinh tế cao, giàu đạm, giàu chất

béo, giàu các chất khoáng và các vitamin Vì thế, cây đậu tương được gọi là “Ônghoàng trong các loại cây họ Đậu”, “vàng mọc trên đất”, “cây đỗ thần”,… Sở dĩ

được đánh giá như vậy bởi lẽ cây đậu tương mang lại những giá trị rất toàn diện:

- Giá trị thực phẩm

Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bình khoảng từ 35,5-40% (trong khi đó hàm lượng protein trong gạo chỉ 6,2-12%; ngô 9,8-13,2%; thịt bò 21%; thịt gà 20%; cá 17-20% và trứng 13-14,8%) , lipit từ

15-có hệ số đồng hóa cao, mùi vì thơm như axit linoleic chiếm 52-65%, oleic từ 25-36%, linolenolic khoảng 2-3% [2] giúp hạn chế lượng cholesterol trong máu, đề phòng xơ vữa động mạch và cao huyết áp, hidratcacbon từ 15-16% và nhiều loại vitamin quan trọng cho sự sống [4].

Đậu tương cũng chứa nguồn chất xơ hòa tan trong nước nên có tác dụng kích thích như động ruột, có lợi cho việc tiêu hóa và phòng ngừa bệnh ung thư ruột già Những người mắc bệnh tiểu đường nên sử dụng đậu tương bởi chất xơ hòa tan và protein trong đậu giúp điều chỉnh lượng đường trong máu rất tốt.

Theo bản thống kê, trên toàn thế giới có khoảng 1,2 vạn sản phẩm làm từ đậu tương Ở Nhật Bản, hàng năm dùng tới 460-500 vạn tấn đậu tương (bình quân mỗi người ăn khoảng 37-40 kg) trong đó có khoảng 80% dùng làm dầu ăn và thức ăn chăn nuôi, 20% dùng làm thực phẩm Ở Mỹ, người ta làm ra khoảng 2500 loại thực phẩm từ đậu tương Các sản phẩm được tiêu thụ trên thị trường gồm bột đậu nành đóng gói, đậu phụ, sữa đậu nành, sữa chua đậu nành,…

- Giá trị về mặt công nghiệp

Đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không, nhưng chủ yếu đậu tương dùng để ép dầu Hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật

- Giá trị về mặt nông nghiệp

♦ Làm thức ăn cho gia súc: Đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc 1kg hạt đậu tương tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi Toàn cây đậu tương (thân, lá, rễ, quả, hạt) có hàm lượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ như thân lá tươi có thể làm thức ăn cho gia súc rất tốt, hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của gia súc Sản phẩm phụ công nghiệp như khô dầu có thành phần dinh dưỡng khá cao: N 6,2% ; P2O5 0,7% ; K2O 2,4% Vì thế làm thức ăn cho gia súc rất tốt [2] ♦ Cải tạo đất: Đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt Trong hệ thống luân canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chi phí cho việc bón N Thân lá đậu tương dùng bón ruộng thay thay phân hữu cơ rất tốt bởi hàm lượng N trong thân chiếm 0,05% trong lá chiếm 0,19% [2].

1.1.4 Sinh thái đậu tương

Đậu tương Glycine max(L.) Merr có đặc điểm:

- Rễ đậu tương có rễ chính và rễ phụ Rễ chính có thể ăn sâu 30-50cm và có thể trên 1m Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ phụ tập trung nhiều ở tầng đất 7-8cm rộng 30-40cm2 [1] Trên rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần.

- Thân cây đậu tương thuộc thân thảo, có hình tròn, trên thân có nhiều lông nhỏ, thân trung bình có 14-15 lóng.Tùy theo giống và thời vụ mà chiều dài lóng có sự khác nhau thường biến động từ 3-10 cm Toàn thân có 1 lớp lông tơ ngắn, mọc dày bao phủ từ gốc lên đến ngọn, đến cả cuống lá

- Lá cây đậu tương có 3 loại lá:

* Lá mầm (lá tử diệp): lá mầm mới mọc có màu vàng hay xanh lục, khi

tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh

* Lá nguyên (lá đơn): Lá nguyên xuất hiện sau khi cây mọc từ 2-3 ngày

và mọc phía trên lá mầm Lá đơn mọc đối xứng nhau.

* Lá kép: Mỗi lá kép có 3 lá chét, có khi 4-5 lá chét Lá chét mọc sole, lá

kép thường có màu xanh tươi khi già biến thành màu vàng nâu.

- Hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, thuộc loại cánh bướm Màu sắc của hoa thay đổi tùy theo giống và thường có màu tím, tím nhạt hoặc trắng Hoa phát sinh ở nách lá, đầu cành và đầu thân Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có từ 1-10 hoa và thường có 3-5 hoa Hoa đậu tương thuốc loại hoa đồng chu lưỡng tính trong hoa có nhị và nhụy, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa có 10 nhị và 1 nhụy.

- Số quả đậu tương biến động từ 2-20 quả ở mỗi chùm hoa và có thể đạt tới 400 quả trên một cây Một quả chứa từ 1-5 hạt, nhưng hầu hết các giống thường từ 2-3 hạt Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, có chiều dàu từ 2-7cm hoặc hơn Quả có màu sắc biến động từ vàng đến trắng tới vàng sẫm hoặc đen.

- Hạt có nhiều hình dạng khác nhau: hình tròn, hình bầu dục, tròn det, Rốn hạt của các giống khác nhau thì có màu sắc và hình dạng khác nhau.

1.1.5 Đặc tính của cây đậu tương

1.1.5.1 Tính chịu lạnh

Nhiệt độ dưới 150C có ảnh hưởng xấu đến nảy mầm của hạt và sự hút nước Nhiệt độ dưới 13-150C, giảm ra hoa, đậu quả và ảnh hưởng tới quang hợp và toàn bộ máy quang hợp

Tổn thương do lạnh thường gây hại màng tế bào,do màng tế bào không có khả năng giữ cấu trúc của nó ở nhiệt độ thấp Các mô, chẳng hạn như hạt phấn đang lớn dễ nhạy cảm với nhiệt độ thấp hơn các mô khác và dẫn đến sự bất dục ở cây đậu tương [2].

1.1.5.2 Tính chịu hạn

Tránh hạn là cơ chế một số thời kỳ sinh trưởng phát triển nhạy cảm của cây đậu tương tránh và thoát các ảnh hưởng trực tiếp của khô hạn Việc tránh hạn đối với những vùng có khô hạn dài ngày thì rất khó thực hiện Ta chỉ có thể chọn thời vụ mà khô hạn xẩy ra ít nhất để hạn chế ảnh hưởng của nó tới sinh trưởng và năng suất cây Hướng chọn giống có tính giảm sự mất nước cho thấy có nhiều triển vọng Nên chọn những cây có bộ rễ sâu phân nhánh nhiều, do đó có thể hút nước từ tầng đất sâu và rộng.

Chịu hạn hoặc do giảm sự mất nước, hoặc cây chịu được sự mất nước Sự mất nước qua khí khổng phụ thuộc chủ yếu vào độ mở của khí khổng và sau đó là hướng lá và các yếu tố khác Khi hạn xảy ra, lỗ khí khổng lá đóng ngay lại, dẫn đến giảm sự bốc hơi nước và quang hợp, nhưng sự giảm bốc hơi nước mạnh hơn Giữa các giống có sự khác nhau về lớp phấn và lông trên lá Lớp phấn trên lá có tác dụng giảm sự bốc hơi [2].

1.1.5.3 Tính chịu đựng và khả năng phục hồi

Cho dù đặc tính giảm sự mất nước của cây tốt đến đâu chăng nữa, cây vẫn bị tổn thương hoặc chết do khô hạn kéo dài Có rất ít thông tin về khả năng phục hồi của cây đậu tương sau khi bị mất nươc nặng Cây bị lạnh trong thời gian ra hoa, thì hầu hết những hoa ra trong thời kỳ đó bị rụng và sau đó vài tuần cây có thể ra hoa và đậu quả nếu thời tiết ấm Thiếu nước trong giai đoạn sẽ làm giảm thời gian ra hoa Thiếu nước trong giai đoạn làm quả sẽ ảnh hưởng tới năng suất nhiều hơn so với thiếu nước trong giai đoạn ra hoa Qua các nghiên cứu người ta có thể dự đoán được giai đoạn nào cây bị ảnh hưởng nhiều do bất lợi (khô hạn, lạnh…) Tuy nhiên, bởi vì người ta khó có thể dự đoán khi nào bất lợi xảy ra, cho nên người nông dân khó có thể ứng dụng được những kết quả nghiên cứu đó nếu như điều kiện tưới

không có Tốt nhất, nên chọn giống có thời gian ra hoa dài và có khả năng phục hồi tốt sau khi bị hạn hoặc bị lạnh [2].

1.1.5.4 Biến động di truyền về phản ứng với yếu tố bất lợi

Ở đậu tương có những biến động di truyền cho nhiều đặc tính khác nhau, chẳng hạn như độ sâu và mật độ rễ, tập tính sinh trưởng hữu hạn và vô hạn, thời gian sinh trưởng, độ nhạy cảm với quang chu kỳ, tính chịu đựng nhiệt độ thấp, khả năng đâm sâu vào tầng đất cứng, khả năng chịu độc Al, Mn, chịu sự mất nước và ra hoa sau khi bị hạn nặng Người ta thấy rằng, mức độ biến động di truyền của những đặc tính này đủ để những nhà chọn giống có thể chọn ra được những giống có tính chống chịu cao, đối với hầu hết các yếu tố bất lợi làm giảm năng suất Vấn đề xác định đặc tính nào của cây trồng là quan trọng nhất, có liên quan tới khả năng chống chịu và năng suất, và tìm ra phương pháp để lựa chọn đúng.

Nếu những biến dị di truyền của một đặc tính nào đó có tồn tại trong vật liệu khởi đầu, việc tạo ra giống chống chịu không có gì khó khăn Tuy nhiên, khi một yếu tố bất lợi như khô hạn hoặc chịu lạnh, nó sẽ liên quan đến nhiều đặc tính quyết định khả năng chống chịu của cây như: rễ sâu, phân cành nhiều, chín sớm, điều chỉnh khí khổng tốt, chịu mất nước, hoặc sinh trưởng tốt sau khi bị hạn [2].

1.1.6 Đặc tính sinh học của giống đậu tương ĐT26- Nguồn gốc

Tác giả: Trần Đình Long, Trần Thị Trường, Nguyễn Thị Loan, Nguyễn Thị Chinh, Nguyễn Văn Thắng, Trần Thanh Bình và CTV Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.

Giống đậu tương ĐT26 được chọn từ tổ hợp lai ĐT2000 x ĐT12 Được công nhận cho sản xuất thử theo Quyết định số 111/QĐ-TT-CCN ngày 3 tháng 6 năm 2008.

- Những đặc điểm chính: Thời gian sinh trường trung bình từ 90-95 ngày.

Chiều cao cây 45-60 cm, hoa màu trắng, hạt vàng, rốn nâu đậm, quả chính có màu nâu, phần cành khá từ 2-3 cành/cây, có 30-35 quả chắc/cây, tỷ lệ quả 3 hạt 20-40% Khối lượng 100 hạt 18-19g Năng suất 21-29 tạ/ha, tùy thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh Giống thích hợp trong vụ xuân và vụ đông Giống ĐT26 nhiễm nhẹ bệnh gỉ sắt, chống đổ tốt

Với những đặc tính này, ĐT26 rất phù hợp với điều kiện sinh thái của Việt Nam, nên chúng tôi đã chọn ĐT26 làm đối tượng để chuyển gen.

1.2 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam

1.2.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới

Đậu tương là cây trồng lấy hạt, cây có dầu quan trọng bậc nhất trên thế giới, đứng hàng thứ 4 sau cây lúa mì, lúa nước và ngô Do có khả năng thích ứng rộng nên đậu tương được trồng khắp các châu lục, nhưng tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ trên 70%, tiếp đến là Châu Á

Bảng 1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây

Hiện nay, 4 nước sản xuất đậu tương lớn nhất thế giới là Mỹ, Brasil, Argentine và Trung Quốc, các nước này chiếm khoảng 90-95% tổng sản lượng đậu tương của thế giới Trong đó Mỹ là nước sản xuất, tiêu thụ và xuất khẩu đậu tương

(Nguồn: Bộ Nông Nghiệp Mỹ (USDA), 2009)

1.2.2 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam

Việt Nam có lịch sử trồng đậu tương lâu đời, một số tài liệu cho rằng cây đậu tương được đưa vào trồng ở nước ta từ thời vua Hùng và xác định rằng nhân dân ta trồng cây đậu tương trước cây đậu xanh và cây đậu [2].

Bảng 4 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam những năm gần đây

(Nguồn: Niêm giám thống kê 2009, Nhà Xuất Bản Thống Kê Hà Nội, 2010)

Hiện nay, diên tích gieo trồng đậu tương ở nước ta đã được mở rộng Tính đến tháng 4/2010 là 123,9 nghìn ha và được chia làm 6 vùng sản xuất chính, đó là: Miền núi Bắc Bộ 24,7%, Đồng bằng sông Hồng 17,5%, Đông Nam Bộ 26,2% (có diện tích lớn nhất) ; Đồng bằng sông Cửu Long 12,4% ; Tổng diện tích 4 vùng này

chiếm 80% diện tích trồng đậu tương cả nước, còn lại là đồng bằng ven biển miền Trung và Tây Nguyên [12].

Việt Nam đã đặt ra mục tiêu tăng sản lượng đậu tương lên đến 500 triệu tấn/năm vào năm 2010 Tuy nhiên, sản lượng đậu tương khó tăng nhanh trong những năm tới do năng suất còn thấp, chi phí cho hoá chất trừ sâu hại cao, làm hạn chế khả năng tăng năng suất và tăng mùa vụ và diện tích gieo trồng của đậu tương.

1.3 Vi khuẩn A.tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen ở thực vật

Hiện nay, có rất nhiều các phương pháp chuyển gen vào thực vật khác nhau như sử dụng súng bắn gen, dùng xung điện tế bào và mô thực vật, dùng vi tiêm, chuyển gen thông qua con đường ống phấn,… Tuy nhiên, phương pháp

chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn A.tumefaciens là phương pháp được sử dụng phổ

biến hiện nay Phương pháp này được sử dụng trong khóa luận này để chuyển gen vào đậu tương.

1.3.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn A tumefaciens

A.tumefaciens là loài vi khuẩn sống trong đất gây ra bệnh khối u hình chóp ở

các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm Chỉ rất ít thực vật một lá mầm thuộc

họ Liliaceae và Amaryllidaceae là dễ bị bệnh khối u hình chóp Sự sinh trưởng khối

u có thể tiếp diễn khi vắng mặt vi khuẩn và mô khối u có thể được sinh trưởng vô trùng bằng nuôi cấy mô trong các môi trường thiếu sự bổ xung auxin và cytokinie ngoại sinh mà bình thường là cần thiết để xúc tiến sự sinh trưởng của mô thực vật

in vitro Mô khối u tổng hợp amino acid và các dẫn xuất của đường được biết chung

là opine Loại opine tổng hợp trong khối u (ví dụ như nopaline, octopine,

agrocinopine, mannopine và agropine) phụ thuộc vào dòng Agrobacterium khởi đầu

sự hình thành khối u Octopine và nopaline là hai loại opine có nguồn gốc từ

arginine và dễ dàng phát hiện nhất trong mô khối u hình chóp Do đó nhiều dòng A.tumefaciens phổ biến được thiết kế theo kiểu octopine hoặc nopaline.

A tumefaciens có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách chuyển

một đoạn ADN của nó vào tế bào thực vật Khi ADN vi khuẩn được hợp nhất với nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của tế bào một cách có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sổi của quần thể vi khuẩn

Để khai thác và sử dụng A.tumefaciens như là một vector chuyển gen các

nhà khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hóa opine của T-ADN và

thay thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ

trái của ADN và các gen vir Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của

T-ADN Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật.

Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ A tumefaciens đã được kiểm tra

đối với sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen chuyển đặc biệt Tuy nhiên, một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp là loại mô được

biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức khởi đầu của vi khuẩn A tumefaciens sử

dụng, môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử dụng để chọn lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật.

1.3.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid

Trong thế giới động-thực vật đều tồn tại các thể plasmid Đó là các vòng DNA tự do sinh sản độc lập Ở vi khuẩn và động-thực vật, plasmid liên quan tới yếu tố giới tính của tế bào, đến khả năng chống chịu các loại kháng sinh,… Đặc điểm quan trọng của plasmid là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể nhưng cũng có thể tồn tại bên ngoài nhiễm sắc thể một cách độc lập.

Hình 1 Ti-Plasmid

Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng A tumefaciens gây độc, cókích thước khoảng 200-250 kb Chúng được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở

nhiệt độ dưới 300C Bằng phương pháp lai ADN-ADN và lập bản đồ chuỗi kép di hợp (heteroduplex mapping), người ta đã xác định được Ti-plasmid có 4 vùng tương đồng Kết quả phân tích di truyền cho thấy vùng T-ADN (transferred DNA) và vùng

gây độc (virulence) liên quan đến sự hình thành khối u trong khi hai vùng khác liên

quan đến sự tiếp hợp và sự tái bản của plasmid trong Agrobacterium.

Trong khi hình thành khối u, T-ADN được chuyển vào tế bào thực vật và hợp nhất với genome nhân T-ADN ổn định trong genome nhân Lai Ti-plasmid với ADN của khối u đã cho thấy T-ADN trong tế bào thực vật là tương ứng song song

với T-ADN trong Ti-plasmid của Agrobacterium Kết quả này chứng tỏ không có

sự sắp xếp lại vị trí của T-ADN trong lúc khối u được tạo thành Một hoặc nhiều bản sao của T-ADN có thể có mặt ở các đoạn lặp nối tiếp Chúng cũng có thể tách ra và liên kết với các vùng khác nhau của ADN thực vật Vị trí hợp nhất của T-ADN vào T-ADN thực vật là hoàn toàn ngẫu nhiên.

1.3.3 Cấu trúc và chức năng của T-ADN

T-ADN là một đoạn ADN có kích thước 25 kb, trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u Trong Ti-plasmid, vị trí của T-ADN được giới hạn bằng bờ phải (RB- Right Border) và bờ trái (LB-Left Border) Ngoài T-ADN, trên Ti-plasmid còn có các vùng ADN mã hóa cho

việc tái sinh plasmid, cho khả năng lấy nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu

hóa opine.

Ở Ti-plasmid dạng nopalin, T-ADN xâm nhập vào genom thực vật ở dạng một đoạn liên tục dài 22 kb Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopine, T-ADN là một đoạn gen liên tục dài 13 kb T-ADN mang rất nhiều gen như: (1) Các gen mã hoá những enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opine; (2) Các gen gây khối u

như tms1, tms2, tmsr mã hoá cho các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp

auxin và cytokinine.

Trong các vùng ADN của Ti-plasmid, ngoài T-ADN được nghiên cứu nhiều

hơn cả là vùng ADN phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir Sản phẩmhoạt động của các gen nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích của các hợp chấtphenol tiết ra từ vết thương là một loạt các protein đặc hiệu như virE2, virB, virD,virD2,… Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-ADN, bao bọc che chở các đoạn ADN này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an toàn

1.3.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A tumefaciens

Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hoá học dẫn dụ vi khuẩn như: AS, hydroxy-acetosyringon Dưới tác dụng của các hợp chất này,

A.tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T-ADN vào tế bàothực vật Quá trình này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir và RB, LB Cũng

chính các hợp chất này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng vir hoạt động và tăng cường biểu hiện.

Sự tiếp xúc của Agrobacterium với các hợp chất giải phóng từ mô thực vật bịtổn thương đã làm cho vùng vir của Ti-plasmid phiên mã Trong quá trình này mộtchất có hoạt tính hóa học cao và đặc trưng đã được nhận biết là AS Gen virA vàgen virC được biểu hiện ở vi khuẩn sinh trưởng sinh dưỡng mặc dù gen virC chỉđược phiên mã ở mức độ thấp Khi Agrobacterium gặp dịch rỉ của các tế bào thựcvật bị tổn thương, hoặc AS tinh khiết, sản phẩm của gen virA (có thể liên kết với

màng) sẽ nhận diện và tương tác với AS và truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế

bào này làm hoạt hóa sản phẩm của gen virC Sau đó protein virC đã biến đổi hoạthóa làm cho các gen virB, C, D và E không hoạt động và làm tăng cường sự phiênmã của gen virC.

Sự cảm ứng gen vir xảy ra nhờ sự xuất hiện các điểm đứt sợi đơn trong các trình tự biên 25 bp nằm ở mép của T-ADN và sự xuất hiện phân tử sợi đơn mạch

thẳng tương ứng với T-ADN Các sản phẩm của operon vir D có hoạt tính

endonuclease Bằng một cơ chế tương tự sự tiếp hợp của vi khuẩn, T-ADN được chuyển sang tế bào thực vật và xen một cách ổn định vào ADN nhân.

1.3.5 Các vector biến nạp thực vật không gây ung thư dựa trên Ti-plasmid

Nhiều vector biến nạp dựa trên Ti-plasmid đã được phát triển Các vector này không chứa bất kỳ trình tự ung thư nào và vì vậy tế bào thực vật có thể sinh trưởng bình thường sau khi chuyển ADN vào nhân của nó Các vector không gây

ung thư hiện đang sử dụng có thể được chia làm hai loại là cis và trans, dựa vào

việc có hay không các vùng T-ADN nằm ở mép các trình tự lặp lại trực tiếp 25 bp

trên cùng đơn vị tái bản (replicon) như các gen vir hoặc trên một plasmid phân tán.

Trước đây, loại vector thường được đề cập đến là vector liên hợp (co-intergrative vector), tuy nhiên gần đây vector nhị thể (binary vector) là phổ biến hơn.

♦ Cis vector

Đây là các vector có nguồn gốc từ Ti-plasmid kiểu dại mà gen onc trên

T-ADN đã được loại bỏ và trong một số trường hợp được thay thế bằng một đoạn ADN đặc hiệu có vùng tương đồng với một vector tạo dòng nhỏ mà chỉ có thể tái

bản ở E.coli Chiến lược vector này phụ thuộc vào sự liên hợp trong A.tumefaciensgiữa các vùng tương đồng trên Ti-plasmid đã sửa đổi (hỗ trợ mang gen vir) và mộtvector tạo dòng nhỏ ở E.coli (vector trung gian) mang gen marker chọn lọc sẽ hoạt

động chức năng trong các tế bào thực vật và các trình tự duy nhất cho việc xen DNA ngoại lai vào.

Vector trung gian mang trình tự ADN ngoại lai thường được đưa vào

A.tumefaciens bằng sự tiếp hợp với ADN ngoại lai đã ổn định trong T-ADN là kết

quả của tái tổ hợp tương đồng ♦ Vector nhị thể

Vector trans hoặc vector nhị thể được dựa trên các plasmid có thể tái bản ởcả E.coli và Agrobacterium, và các plasmid này có chứa các trình tự biên của

T-ADN Các vector này có thể được thiết kế sao cho các trình tự biên cạnh MCS (Multicloning site- trình tự tạo dòng) cho phép xen ADN ngoại lai vào và các marker cho phép chọn lọc trực tiếp các tế bào thực vật đã được biến nạp.

Plasmid có thể được thao tác ở trong E.coli và được chuyển vào qua sự tiếphợp với các dòng Agrobacterium mang plasmid có chứa vùng vir nhưng thiếu

T-ADN và các trình tự lặp 25 bp Các plasmid như thế thường là các thể đột biến mất đoạn đơn giản của Ti-plasmid octopine kiểu dại hoặc kiểu nopaline Việc chuyển ADN ngoại lai trên vector tạo dòng tế bào thực vật có thể được thực hiện do hoạt

động chức năng của vùng vir.

1.3.6 Các gen chỉ thị chọn lọc và sàng lọc

Các gen chỉ thị chọn lọc chung nhất mã hóa các protein khử độc các nhân tố ức chế trao đổi chất như các kháng sinh hoặc chất diệt cỏ Các gen chỉ thị sang lọc

thường được sử dụng là các gen β-glucuronidase (gus A), luciferase và gân đây hơn

là gen mã hóa protein phá thuỳnh quang màu xanh lục (green fluorescent) của sứa.

Gen chỉ thị thường dùng nhất là các gen gus A (β-glucuronidase), gen npt II(neomycin phosphotransferase), gen lux (luciferase), gen cat (chloramphenicolacetyltransferase), gen nos (nopaline synthase).

Gen npt II: Enzyme neomycin phosphotransferase (npt II) là một enzyme vi

sinh vật có trọng lượng phân tử khoảng 25 kD, xúc tác cho phản ứng phosphoryl hóa một số kháng sinh gốc aminoglycoside như neomycin, kanamycin và G148 Trong phản ứng này, nhóm γ phosphate của ATP được gắn vào phân tử chất kháng sinh làm nó trở nên bất hoạt do ngăn trở sự liên kết của kháng sinh với ribosome.

Bảng 5 Hệ thống các gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker genes) và các gen chỉ thịsàng lọc (screenable marker genes)

A Một số gen chỉ thị chọn lọc

Kí hiệu genEnzyme tương ứngChất dùng để chọn lọc

hyg Hygromycin phosphotransferase Hygromycin

gent Gentamycin acetyltransferase Gentamycin

aat Streptomycin phosphotransferase Streptomycin

bar Phosphinothricin acetyltransferase Phosphinothricin

B Một số gen chỉ thị sàng lọc

Kí hiệu genEnzyme tương ứngChất dùng để phát hiện

cat Chloramphenicol acetyltransferase Chloramphenicol đánh dấu

Gen bar: Gen bar là tên gọi của gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin

acetyltransferase (PAT), có tác dụng làm mất độc tính của phosphinothricin (PPT),

là hoạt chất chính của thuốc trừ cỏ như Bialaphos và Basta Gen bar được tạo dòngđầu tiên từ một dòng vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus Phương pháp đơn giản

nhất để kiểm tra sự có mặt của gen bar là phương pháp trực tiếp Mô, tế bào hoặc cây chuyển gen được đặt trên môi trường có các nồng độ phosphinithricin khác nhau (hoặc thuốc trừ cỏ tương ứng) và so sánh sinh trưởng của mô, tế bào hoặc cây đối chứng đặt trên cùng môi trường.

Gen gusA: là gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme glucuronidase

β-glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm phân giải có màu xanh chàm đặc trưng, dễ nhận biết β-glucuronide thường dùng nhất trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus A là X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide) Dung dịch X-gluc không màu dưới tác động của enzyme β-glucuronidase sẽ huyển sang màu xanh chàm đặc trưng.

Gen lacZ: Enzyme β-galctosidase (lacZ) trọng lượng phân tử 116 kD, pH tối

thích 7-7,5 được mã hóa do gen lacZ Gen lacZ ở E.coli được dùng rất phổ biến

trong công nghệ gen vi sinh và đã có sẵn các hệ thống phương pháp kiểm tra rất

nhạy với thuốc thử X-Gal Sự tồn tại hoạt động của lacZ trong tế bào thực vật đãđược khẳng định Vì vậy, trước khi kiểm tra sự có mặt của gen lacZ ngoại lai, cầnphải bất hoạt gen lacZ nội sinh bằng glutaradehyde.

Gen cat: Được phân lập và tạo dòng từ dòng vi khuẩn Tn9, là gen gây khả

năng kháng chloramphenicol ở vi khuẩn nói chung Gen cat đã được dùng rộng rãitrong công nghệ gen động vật và thực vật vì gen cat mã hoa cho enzyme

chloramphenicol acetyltransferase (CAT) Enzyme này xúc tác phản ứng acetyl hóa hai vị trí trên phân tử chloramphenicol và làm nó bất hoạt.

1.3.7 Hệ thống vector pCAMBIA

Hình 2 Cấu trúc chung của vector pCAMBIA

Vector pCAMBIA là vector nhị thể có nguồn gốc là vector pPZP [40] Đặc điểm chung của pCAMBIA:

- Số lượng bản copy trong E.coli cao

- Đơn vị sao chép pVS1 bền vững trong Agrobacterium

- Kích thước nhỏ, từ 7-12kb, phụ thuộc vào từng loại plasmid - Chọn lọc vi khuẩn bằng chloramphenicol hoặc Ka

- Chọn lọc thực vật bằng hygromycin B hoặc Ka

- Gen chỉ thị là gen gus

Hiện nay hệ thống pCAMBIA đã nhiều các vector khác nhau mang các gen

thích hợp với từng đối tượng thực vật, từng chủng A.tumefaciens và từng mục đích

sử dụng khác nhau Gồm có: p2300, p2201, p1300, p1301, p1302, p1303, p1304, p1305.1, p1305.2,…

Hình 3 Vector pCAMBIA1301

Trong khóa luận này chúng tôi sử dụng vector pCAMBIA1301 (hình 3), gen

chọn lọc thực vật là hptII (gen kháng hygromycin B), gen chọn lọc vi khuẩn là gen

gus first exon và gusA second exon phân cách nhau bởi đoạn intron Catalase, đoạnkết thúc chuỗi là NOS polyA, vị trí đa điểm là pUC18 -lacZa, dưới sự điều khiển

của promoter CaMV35S (Cauliflower Mosaic Virus) và được quy định bởi trình tự

CaMV35S polyA [23] Các chủng Agrobacterium được sử dụng là LBA4404,

EHA101, EHA105, AGL1, AGL0, GV3101.

1.3.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp thông qua A.tumefaciens

Sự thành công trong việc tạo ra thực vật chuyển gen phụ thuộc vào một loạt các yếu tố như tần số biến nạp, tác nhân chọn lọc hoặc sàng lọc và khả năng tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh từ các tế bào và mô mang gen chuyển nạp

Đối với phương pháp chuyển gen thông qua A.tumefaciens thì tần số biến

nạp phụ thuộc vào các yếu tố liên quan đến vi khuẩn và các yếu tố liên quan đến thực vật Các yếu tố liên quan đến vi khuẩn gồm: chủng vi khuẩn, mật độ vi khuẩn,

thời gian lây nhiễm, hoạt tính của gen vir, khả năng xâm nhập vào các câu chủ và

loại vector

- Ảnh hưởng của kiểu gen: nhìn chung, hiệu quả chuyển gen rất khác nhau giữa các kiểu gen của cùng một loài Đa số các báo cáo, tài liệu về chuyển gen chỉ đề cập đến ảnh hưởng của kiểu gen đến khả năng chuyển T-ADN hay phản ứng

nuôi cấy in vitro

- Ảnh hưởng của dạng mẫu mô đích: các dạng mô được sử dụng làm mô đích để biến nạp là mô sẹo phôi hóa, phôi non của hạt hay huyền phù tế bào Mẫu quá non hay quá già đều ảnh hưởng đến khả năng biến nạp Nếu mẫu non, sức sống kém dẫn đến tỷ lệ mẫu sống thấp, còn nếu mẫu quá già lúc này hệ gen thực vật ổn định dẫn đến việc tiếp nhận gen ngoại lai trở nên khó khăn hơn.

- Ảnh hưởng của chủng Agrobacterium và plasmid: Các nghiên cứu chuyểngen thành công thông qua A.tumefaciens cho thấy hiện tại chỉ có 3 chủng vi khuẩn

được sử dụng hiệu quả ở các loài cây một lá mầm đó là LBA4404, C58 đã bị bất hoạt và EHA101 và các chủng cải biên (EHA105 từ EHA101, AGL0 và AGL1 từ

EHA101) [15] Dạng Ti-plasmid của Agrobacterium cũng có vai trò trong quá trình

chuyển T-ADN vào tế bào thực vật Các nghiên cứu cho thấy, Ti-plasmid dạng

nopalin có hiệu quả hơn trong việc lây nhiễm Agrobacterium vào ngô so với

Ti-plasmid dạng octopin.

- Nhiệt độ: Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình đồng nuôi cấy đến hiệu

cho quá trình chuyển T-ADN có thể thay đổi đối với mỗi dạng mẫu mô biến nạp nhất định Nhiệt độ thích hợp cho chuyển gen bền vững cũng cần phải được đánh

giá với mỗi dạng mẫu mô đích và với mỗi chủng Agrobacterium biến nạp Ở các

loài cây một lá mầm nhiệt đồng nuôi cấy thường là 24-250C, một số trường hợp là 280C Ảnh hưởng của nhiệt độ thấp (dưới 230C) đến khả năng chuyển T-ADN và

chuyển gen bền vững đã được đánh giá Biểu hiện gen bền vững gen gus tạm thời

trong chuyển gen vào mô sẹo cây tỏi đạt được cao nhất ở 220C Tần số chuyển gen cao hơn đã nhận được ở phôi ngô non sau biến nạp được đồng nuôi cấy ở 200C so với 230C [18].

- Ảnh hưởng của thành phần môi trường lây nhiễm và đồng nuôi cấy: Thành phần môi trường cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiêu quả chuyển gen

Việc bổ sung AS chất kích thích sự hình thành các gen vir, đã có trong hầu

hết các quy trình chuyển gen ở cây một lá mầm Trong trường hợp không có AS,

mức độ biểu hiện tạm thời của gen gus rất thấp, không tái sinh được cây lúa và cây

hành chuyển gen

Gần đây, việc sử dụng L-Cys bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy đã cải thiện hiệu suất chuyển gen của 3 dòng ngô [18]

- Ảnh hưởng của các chất kháng sinh để loại bỏ Agrobacterium: Các chất

kháng sinh như: cefotaxime, Car, timentin thường được sử dụng loại bỏ vi khuẩn

sau khi đồng nuôi cấy trong các nghiên cứu chuyển gen thông qua Agrobacterium

[32] Hiện nay, Car đang được sử dụng chủ yếu trong các thí nghiệm chuyển gen

thông qua Agrobacterium vào ngô và lúa ở nồng độ 100 mg/ [15] Và đối với đậu

tương là Cefotaxime 200mg/l, Car 250mg/l [31]

- Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn: Mật độ vi khuẩn Agrobacterium cao

thường gây chết tế bào thực vật giảm khả năng tái sinh của các tế bào sau khi biến nạp, dẫn tới giảm tần số chuyển gen bền vững Tuy nhiên, mật độ vi khuẩn lây nhiễm cao là cần thiết đối với chuyển gen vào các loài, các mẫu mô khó, tần số chuyển gen có thể được cải thiện bằng cách lây nhiễm thời gian ngắn, rửa mẫu sau khi lây nhiễm hoặc bổ sung các chất kìm hãm vi khuẩn vào môi trường đồng nuôi cấy [38].

Trong hầu hết các trường hợp, nếu quá trình chuyển T-ADN hiệu quả sẽ dẫn đến khả năng chuyển gen bền vững cao Mặc dù vậy, trong nhiều điều kiện quá trình chuyển T-ADN tăng đã không có kết quả trong chuyển gen bền vững Nguyên

nhân có thể là do thiếu sự tương tác giữa quá trình chuyển T-ADN và chuyển gen bền vững Để có được sự phối hợp giữa chuyển T-ADN và chuyển gen bền vững thì các điều kiện lây nhiễm, đồng nuôi cấy phải thích hợp cho việc chuyển T-ADN và tái sinh cây chuyển gen [15]

1.4 Cây trồng biến đổi gen và cây đậu tương biến đổi gen

1.4.1 Cây trồng biến đổi gen trên thế giới và việt nam

Trong những năm qua, các phương pháp biến nạp gen ở thực vật đã có rất nhiều tiến bộ Hiện nay, các phòng thí nghiệm công nghệ gen đang bắt tay vào việc cải thiện các đặc điểm di truyền cho một số loài cây trồng có giá trị nhờ các công cụ của sinh học tế bào và sinh học phân tử Trong một vài trường hợp đặc biệt (lúa, lúa mì, ngô, bông) các phương pháp biến nạp gen bị giới hạn bởi genotype Một số các cây trồng quan trọng khác, cần thiết cho nhu cầu sử dụng của người dân ở các nước đang phát triển hiện cũng ít được chú ý.

- Trên thế giới:

Về tình hình trồng cây biến đổi gen trên thế giới, có thể nói diện tích trồng cây biến đổi gen đã tăng lên nhanh chóng, từ 1 triệu ha ở Mỹ năm 1996 đến tháng 12 năm 2009 đã tăng lên 134 triệu ha [20]

Trong năm 2009 vừa qua, diện tích trồng 4 loại cây biến đổi gen chủ lực là ngô, bông, đậu tương và cải dầu đã đạt mức kỷ lục trên toàn thế giới Trong tổng số 25 nước trồng cây biến đổi gen có 16 nước đang phát triển và 9 nước công nghiệp 8 nước đứng đầu danh sách ứng dụng cây biến đổi gen đều có diện tích trồng các giống cây này trên 1 triệu ha, trong đó lớn nhất là Hoa Kỳ (64 triệu ha), Braxin (21,4 triệu ha), Argentina (21,3 triệu ha), Ấn Độ (8,4 triệu ha), Canada (8,2 triệu ha), Trung Quốc (3,7 triệu ha), Paraguay (2,2 triệu ha) và Nam Phi (2,1 triệu ha) Tổng diện tích đất trồng cây biến đổi gen cộng dồn qua các năm từ 1996 đến 2009 đã đạt 949,9 triệu ha Hàng tỷ tấn sản phẩm đã làm ra và tiêu thụ [35] Đáng chú ý là gần 1 nửa diện tích đất trồng cây biến đổi gen trên thế giới (46%) nằm ở các nước đang phát triển Diện tích này có tiềm năng vượt các nước công nghiệp trước năm 2015 Cây trồng biến đổi gen đang có những đóng góp rất to lớn cho mục tiêu xóa đói giảm nghèo và sẽ đóng góp lớn hơn trong tương lai [36]

Theo dự đoán của ISAAA đưa ra trong năm 2005, các ứng dụng cây biến đổi gen sẽ tăng gấp đôi vào năm 2015 so với năm 2006, cả về số nước trồng, diện tích

trồng và số người trồng Theo đó, tới năm 2015 sẽ có 40 nước, 20 triệu người dân trồng cây biến đổi gen trên 200 triệu ha Trong thời gian tới sẽ có thêm nguồn cung cấp các giống cây biến đổi gen mới một cách liên tục và không ngừng mở rộng, để đáp ứng nhu cầu trên toàn thế giới, đặc biệt là nhu cầu của các nước đang phát triển ở châu Á, Mỹ Latinh và châu Phi Và đặc biệt là đậu tương, loại cây mang lại các giá trị dinh dưỡng cũng như giá trị kinh tế rất cao.

- Ở Việt Nam:

Hiện nay, nghiên cứu tạo giống cây trồng biến đổi gen vẫn còn mới mẻ ở Việt Nam Chỉ sau năm 2000, nước ta mới có một vài đề tài nghiên cứu đầu tiên về tạo giống cây trồng biến đổi gen Tuy nhiên, các loại cây biến đổi gen vẫn chưa được mở rộng gieo trồng ở Việt Nam, mà mới trong phạm vi phòng thí nghiệm và trồng thử nghiệm

Năm 2005, Ban Bí Thư đã ra Chỉ thị số 50-CT/TW về đẩy mạnh phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học phục vụ sự nghiệp công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước Tháng 01 năm 2006, Thủ tướng Chính phủ đã phê duyệt “Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020”, trong đó dự kiến đến năm 2011 nước ta sẽ trồng rộng rãi cây trồng biến đổi gen, đến năm 2020 diện tích cây biến đổi gen ở một số cây trồng chọn lọc sẽ chiếm 30-50% tổng diện tích.

1.4.2 Cây đậu tương biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam

Đậu tương là một loại cây trồng lâu đời, loại cây đem lại lợi ích kinh tế to lớn trên thế giới Hạt đậu tương có chứa tỷ lệ amino acid không thay thế nhiều hơn ở cả thịt, do vậy đậu tương là một trong những loại cây trồng lương thực quan trọng nhất trên thế giới hiện nay.

Đậu tương được biến đổi gen để mang các tính trạng như khả năng chống chịu thuốc diệt cỏ và có hàm lượng oleic acid cao Những cố gắng đầu tiên ở cây đậu tương biến nạp gen tập trung ở việc tái sinh cây từ protoplast và nuôi cấy dịch huyên phù phát sinh phôi Mặc dù có những thành công ban đầu, tiến triển của công việc này vẫn còn chậm và việc thu hồi các cây chuyển gen vẫn đang còn gặp nhiều khó khăn Công nghệ chuyển gen ở đậu tương đã có triển vọng hơn nhờ sự phát triển và tối ưu hóa của kỹ thuật bắn gen Thực tế cây đậu tương đã được sử dụng như một cây mô hình để phát triển kỹ thuật cho nhiều loài cây trồng khó áp dụng

chuyển gen nhờ Agrobacterium Phương thức này dựa vào sự phát sinh chồi từ lámầm của giống Peking chọn lọc cho tính mẫm cảm với Agrobacterium Các mẫu lámầm được xâm nhiễm với Agrobacterium mang plasmid kanamycin và có hoạt tínhgusA, hoặc kháng Ka và chống chịu glyphosate Có thể biến nạp gen hiệu quả vào

protoplast đậu tương bằng các phương thức thông dụng nhưng rất khó tái sinh được cây Để biến nạp gen vào các giống đậu tương khác nhau người ta đã phối hợp hai yếu tố: genotype đơn giản- phương thức tái sinh cây độc lập (dựa trên cơ sở sự tăng của cụm chồi từ vùng chung quanh mô phân sinh của trụ phôi) với sự tăng gia tốc của vi đạn có phóng điện để phân phối ADN ngoại lai Hàng trăm cây đậu tương có nguồn gốc độc lập đã thu được và kết quả biến nạp đã cho nhiều genotype khác nhau Nói chung các dòng đậu tương chuyển gen có nhiều bản sao của gen biến nạp (số bản sao khoảng từ 1-50, nhưng thường thay đổi từ 2-10) Phân tích Southern blot ở thế hệ sau của các bản sao gen thực vật cho thấy tất cả các bản sao cùng tách rời, như thể mỗi thể biến nạp sơ cấp chỉ hiện diện một kết quả biến nạp độc lập và có thể sự tái tổ hợp thống nhất đã không xuất hiện thường xuyên.

- Thế giới: Lần đầu tiên diện tích trồng đậu tương biến đổi gen chiếm tới trên

75% trong tổng diện tích 90 triệu ha trồng đậu tương trên toàn thế giới [13] Tính trạng kháng thuốc diệt cỏ cũng là tính trạng phổ biến nhất ở đậu tương, chiếm tới 62% Cây biến đổi gen đa tính trạng cũng ngày càng được áp dụng rộng rãi, chiếm 21% tổng diện tích trồng cây biển đổi gen toàn thế giới, được trồng ở 11 nước, trong đó có 8 nước đang phát triển [20].

- Việt Nam: Cho tới nay, đã có một số các thử nghiệm để tối ưu hóa quá trình

chuyển gen cũng như tái sinh sau chuyển gen của đậu tương như: nghiên cứu của Tran Thi Cuc Hoa et al sử dụng giống đậu PC 19 là giống được trồng phổ biến ở Việt Nam làm đích chuyển gen Việc biến nạp vào nốt lá mầm thông qua vi khuẩn

A.tumefaciens mang vector nhị hợp pZY 102/pTF 102 mang gen bar, gen gusA và

gen kháng glufosinat, thu được tần số chuyển gen ở thế hệ T0 là 1-3% [35] Một nghiên chuyển gen vào đậy tương khác của Trần Thị Cúc Hòa với đích chuyển gen là nốt là mầm các giống đậu tương MTĐ 176, KL 202, Maverick, Williams 82

thông qua A.tumefaciens thu được hiệu suất chuyển gen là 1-5% [6], trong đó MTĐ

176 và KL202 là 2 giống đậu tương Việt Nam Hy vọng rằng, trong tương lai nước ta có thể nâng cao diện tích trồng cây đậu tương biến đổi gen giúp tăng năng suất, tiết kiệm nước, đất, thuốc trừ sâu,…và có khả năng chống chịu điều kiện bất lợi

Chương II - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Các thiết bị thí nghiệm

Các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm này là : Tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ lạnh, tủ ổn nhiệt, cân điện tử, máy khử trùng, bộ pipette, bình nuôi cấy, đĩa Petri, que cấy khuẩn hoặc que chang, dao và panh, đèn cồn.

2.1.2 Hóa chất và môi trường

Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm này là: Ethanol, NaClO, Ka, Hygromycin, AS, 2,4-D, BAP, IAA, Agar.

Các môi trường được sử dụng trong thí nghiệm là: LB, MS, C1, C2, C3, C4, C5, C6 (xem thành phần các loại môi trường ở phần phụ lục).

2.1.3 Vi khuẩn

Chủng vi khuẩn được sử dụng là: A.tumefaciens AGL1 và GV3101 Cả haichủng đều mang vector pCAMBIA 1301 có gen gus làm chỉ thi sàng lọc, gen kháng

kanamycin làm chỉ thị chọn lọc vi khuẩn, gen kháng hygromycin làm chỉ thị chọn lọc thực vật

Hai chủng có nguồn gốc từ phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế bào thực vật, viện Di truyền nông nghiệp.

2.1.4 Đối tượng nghiên cứu

Thí nghiệm sử dụng dòng đậu tương ĐT26 có nguồn gốc từ Viện Di truyền Nông nghiệp

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tạo nguồn vật liệu vô trùng

♦♦ Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaClO và thời gian khửtrùng ở giai đoạn khử trùng mẫu.

- Nguyên tắc: Sử dụng các dung dịch khử trùng có khả năng xâm nhập và len

lỏi vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt hạt đậu để có thể khử sạch hạt khỏi nấm và

vi khuẩn (bởi vì hạt đậu tương được thu hoạch từ đồng ruộng nên chứa nhiều các loại vi khuẩn và nấm)

- Chỉ tiêu đánh giá: mẫu có tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, sinh trưởng và phát triển bình thường.

- Hóa chất: Ethanol, NaClO, nước cất vô trùng.

- Tiến hành: khử trùng hạt được tiến hành trong tủ cấy vô trùng và theo quy trình khử trùng hạt được cải tiến từ quy trình của Xue R.G et al (2006)[31].

* Ngâm hạt với nước cất vô trùng trong 30 phút (hạt được bỏ trong bình tam giác 250ml với số lượng 20-25 hạt).

* Lắc hạt với ethanol 70% trong 3 phút * Rửa hạt bằng nước cất vô trùng 1 lần.

* Lắc hạt với NaClO với các nồng độ 10%; 12,5%; 15%; 20% trong thời gian 5; 10; 13,5 phút.

* Rửa hạt bằng nước cất vô trùng 5-6 lần (rửa đến khi hết bọt) * Dùng dao và panh tách bỏ lớp vỏ ngoài của hạt.

* Cấy hạt vào môi trường nảy mầm MS, cho hạt nảy mầm trong 2-3 ngày - Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6-10 đĩa, mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26

2.2.2 Chuyển gen gus vào đậu tương

Trong các thử nghiệm chuyển gus vào đậu tương ở khóa luận này, chúng tôi chọn vị trí làm đích chuyển gen trên hạt đậu tương là nốt lá mầm và trụ dưới lá mầm của hạt dựa vào nghiên cứu của Xue R.G et al.[31], Tran Thi Cuc Hoa et al.

[35] X-gluc được sử dụng để nhuộm gus, được chuẩn bị theo quy trình của Olhoft

et al [30].

♦♦ Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn thích hợp nhất với ĐT26

- Nguyên tắc: vi khuẩn A.tumefaciens có khả năng tiếp cận với genome thực

vật và có thể chuyển đoạn ADN ngoại lai vào trong genome thực vật Tuy nhiên, mỗi chủng có cách tiếp cận bằng các cách khác nhau và vào các vị trí khác nhau trên cơ thể thực vật

- Chỉ tiêu đánh giá: Xác định chủng vi khuẩn mang gen gus mà có thểchuyển gen gus sang hạt đậu đang nảy mầm thành công với tỷ lệ sống của hạt cao

- Vật liệu: Hạt đậu tương 2-3 ngày tuổi khử trùng đạt tiêu chuẩn ở thí nghiệm

1, vi khuẩn A.tumefaciens chủng AGL1, GV3101 chứa vector pCAMBIA1301, môi

trường LB, AS, Ka, môi trường C1 và C2, X-gluc - Tiến hành:

* Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen

Chủng A.tumefaciens AGL1 và GV3101được cấy trên đĩa thạch LB có

chứa Ka, nuôi trong tủ 280C qua đêm Sau đó đem bảo quản trong tủ 40C (sử dụng 2-3 tháng kể từ ngày nuôi).

Nuôi phục hồi A.tumefaciens AGL1 và GV3101 từ đĩa thạch đã chuẩn bị ở

trên vào dung dịch LB có chứa AS 200mg/l, Ka 200mg/l từ 4-6h trong tủ lắc 280C cho đến khi đạt nồng độ OD = 0,6-1 thì được sử dụng cho biến nạp.

* Chuẩn bị mẫu thực vật cho chuyển gen

Hạt đậu 2-3 ngày tuổi đạt yêu cầu ở thí nghiệm 1, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm Sau khi cắt xong, ngâm vào dung dịch C1.

 Tiến hành chuyển gen (được tóm tắt như hình 4):

Cho nốt lá mầm cùng với 1 lá mầm của hạt đã cắt ở trên tiếp xúc trực tiếp với dịch khuẩn AGL1 và GV3101 trong 60 phút.

Sau đó, rửa lại mẫu với dung dịch C1 và đồng nuôi cấy trên môi trường C2 Sau 5 ngày đồng nuôi cấy đem mẫu rửa với nước, sau đó bỏ mẫu vào ống falcon 50ml ngâm mẫu trong dung dịch X-gluc ở tủ 370C trong 48h.

Sau nhuộm gus 48h, rửa mẫu 4-5 lần với ethanol 96% với mục đích loại bỏ

diệp lục của lá, sau đó quan sát và chụp ảnh mẫu.

- Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6-10 đĩa, mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26.