Giáo trình các phương pháp phân tích

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI NGUYỄN THỊ ÁNH HƯỜNG PHẠM THỊ NGỌC MAI GIÁO TRÌNH CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÀ NỘI - 2019 LỜI MỞ ĐẦU Hóa học phân tích khoa học nghiên cứu phương pháp xác định thành phần cấu tạo (định tính) hàm lượng (định lượng) nhiều thành phần vật chất (mẫu phân tích), đáp ứng nhu cầu ngày đa dạng phức tạp ngành khoa học, kỹ thuật đời sống Cùng với phát triển khoa học cơng nghệ, nhiều phương pháp phân tích từ đơn giản đến phức tạp, tương ứng xác định mức hàm lượng khác (từ lượng lớn đến lượng siêu vết) chất phân tích đời Trong đó, phương pháp phân tích (còn gọi phương pháp phân tích cơng cụ, phương pháp phân tích đại) phát triển sở ngun tắc hóa lý cơng nghệ sinh học, sử dụng phổ biến rộng rãi nhằm xác định lượng vết, siêu vết chất phân tích Các phương pháp đóng vai trò quan trọng nhiều lĩnh vực phân tích môi trường, y sinh, pháp y, thực phẩm, dược phẩm,… Cuốn sách “Các phương pháp phân tích” đời khn khổ chương trình phát triển hồn thiện học liệu cho mơn học thuộc chương trình đào tạo chuyên ngành liên ngành Trường Đại học Mở Hà Nội Với mục đích giới thiệu kiến thức bản, số khả ứng dụng phương pháp đại thường dùng phân tích, đặc biệt phân tích mơi trường, sinh học thực phẩm, sách biên soạn với nội dung nhóm phương pháp phân tích chia thành chương tương ứng: - Chương Giới thiệu chung phương pháp phân tích: giới thiệu chung, bước q trình phân tích, phân loại phương pháp phân tích, thơng số quan trọng để đánh giá phương pháp phân tích, phương pháp chuẩn hóa - Chương Các phương pháp phân tích quang học: giới thiệu chung, đại cương phương pháp phân tích quang học, phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ phân tử, phương pháp phân tích quang phổ huỳnh quang phân tử, phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử, phương pháp phân tích quang phổ phát xạ nguyên tử, phương pháp phân tích phổ hồng ngoại - Chương Các phương pháp phân tích sắc kí: giới thiệu chung, đại cương phương pháp phân tích sắc kí, phương pháp phân tích sắc kí khí, phương pháp phân tích sắc ký lỏng, phương pháp phân tích sắc ký ion phương pháp sắc kí khác - Chuơng Phương pháp điện di mao quản: nguyên tắc phương pháp, sở lí thuyết phương pháp điện di mao quản, mao quản sử dụng CE, dòng điện di thẩm thấu, kĩ thuật bơm mẫu, số detector thông dụng CE, ứng dụng CE - Chuơng Các phương pháp phân tích điện hóa: giới thiệu chung, điện cực, phương pháp đo thế, phương pháp đo độ dẫn - Chuơng Phương pháp hấp thụ miễn dịch gắn enzym: giới thiệu chung, kháng nguyên - kháng thể, nguyên tắc phương pháp, kỹ thuật ELISA, ưu nhược điểm ứng dụng phương pháp ELISA Cuốn sách hy vọng hữu ích cho bạn sinh viên trình học tập, cho đồng nghiệp, nhà nghiên cứu công việc Trong trình biên soạn chắn khơng tránh khỏi thiếu sót Chúng tơi mong nhận ý kiến đóng góp chuyên gia, bạn bè đồng nghiệp bạn sinh viên để sửa chữa bổ sung cho lần tái sau Nhóm tác giả Phạm Thị Ngọc Mai Nguyễn Thị Ánh Hường DANH MỤC VIẾT TẮT Kí hiệu viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AAS Atomic absorption spectroscopy Phổ hấp thụ nguyên tử Ab Antibody Kháng thể AES Atomic emission spectroscopy Phổ phát xạ nguyên tử Ag Antigen Kháng nguyên AOAC Association of analytical chemists Hiệp hội nhà hóa phân tích ATR Attenuated total reflectance (đo) Giảm tổng độ phản xạ BA Benzoic acid Acid benzoic CCE Chiral Capillary Electrophoresis Điện di mao quản tách đồng phân đối quang CE Capillary Zone Electrophoresis Điện di mao quản CEC Capillary Electrochromatography Sắc kí điện mao quản CGE Capillary Gel Electrophoresis Điện di mao quản gel CIEF Capillary Isoelectric Focusing Điện di mao quản điểm đẳng điện CITP Capillary Isotachophoresis Điện di mao quản đẳng tốc độ CRM Certified reference material Mẫu chuẩn so sánh CTAB Cetyltrimethylammonium bromide Cetyltrimethylammonium bromua CZE Capillary Zone Electrophoresis Điện di mao quản vùng Kí hiệu viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt DSCE Dynamic Sieving Capillary Electrophoresis Điện di mao quản rây động học E Enzyme Enzyme ECD Electron capture detector Detector cộng kết điện tử EDL Electrodeless discharge lamp Đèn phóng điện khơng điện cực ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Hấp thụ miễn dịch gắn enzyme EOF Electro-osmotic flow Dòng điện di thẩm thấu ESI Electrospray ionization Ion hóa phun điện tử F-AAS Flame atomic absorption spectroscopy Phổ hấp thụ nguyên tử lửa FID Flame ionization detector Detector ion hóa lửa FT-IR Fourier transformationInfrared Hồng ngoại chuyển hóa Fourier GC Gas chromatography Sắc kí khí GC-MS Gas chromatography-Mass spectrometer Sắc kí khí - khối phổ GF-AAS Graphite atomic absorption spectroscopy Phổ hấp thụ nguyên tử dùng cuvet graphit HCL Hollow cathode lamp Đèn catot rỗng HPCE High performance Capillary Electrophoresis Điện di mao quản hiệu cao HPLC High performance liquid chromatography Sắc kí lỏng hiệu cao IC Ion chromatography Sắc kí ion Kí hiệu viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ICP Inductively coupled plasma Plasma cảm ứng cao tần ICP-MS Inductively coupled plasmaMass spectrometry Khối phổ plasma cảm ứng cao tần ICP-OES Inductively coupled plasmaPhổ phát xạ plasma cảm ứng Optical emission spectroscopy cao tần ID Inner diameter Đường kính IR Infrared Hồng ngoại LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng MCEKC Micellary Capillary ElectroKinetic Chromatography Sắc ký điện động học mixen MFS Molecular fluorescence spectroscopy Phổ huỳnh quang phân tử MS Mass spectrometer Khối phổ MW Molecular weight Trọng lượng phân tử PA p-aminobenzoic acid Acid p-aminobenzoic PAH Polycyclic aromatic hydrocarbon Hydrocacbon đa vòng thơm PH p-hydroxybenzoic acid Acid p-hydroxybenzoic PLOT Porous layer open tubular (cột) ống hở phủ lớp xốp RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SCOT support-coated open tubular (cột) ống hở chứa chất nhồi phủ pha tĩnh SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SDS Sodium dodecyl sulfate Sodium dodecyl sulfate Kí hiệu viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt Chế độ theo dõi ion chọn lọc SIM Selective ion monitoring TCD Thermal conductivity detector Detector độ dẫn nhiệt TFE Tetra fluoro ethylene Tetra fluoro ethylen THF Tetrahydrofuran Tetrahydrofuran TLC Thin layer chromatography Sắc kí lớp mỏng TP Terephthalic acid Acid terephthalic UV-VIs Ultraviolet-Visible Tử ngoại-nhìn thấy WCOT Wall-coated open tubular (Cột) ống hở có thành phủ pha tĩnh MỤC LỤC Nội dung Trang Chương 1: Giới thiệu chung phương pháp phân tích 1.1 Giới thiệu chung 1.2 Các bước trình phân tích 1.3 Phân loại phương pháp phân tích 1.4 Các thơng số quan trọng để đánh giá phương pháp phân tích 1.5 Các phương pháp chuẩn hóa 12 1.5.1 Khái niệm đường chuẩn 12 1.5.2 Phương pháp đường chuẩn (ngoại chuẩn) 12 1.5.3 Phương pháp nội chuẩn 13 1.5.4 Phương pháp thêm chuẩn 14 Câu hỏi ôn tập 16 Tài liệu tham khảo 17 Chương 2: Các phương pháp phân tích quang học 18 2.1 Giới thiệu chung 18 2.2 Đại cương phương pháp phân tích quang học 18 2.2.1 Ánh sáng xạ điện từ 18 2.2.2 Tương tác vật chất với ánh sáng 20 2.2.3 Sự xuất phổ 23 2.2.4 Phân loại phương pháp phân tích quang học 24 2.2.5 Các thành phần thiết bị đo phổ 25 2.2.5.1 Nguồn lượng 25 2.2.5.2 Bộ phận phân giải quang học -chọn lọc bước sóng 26 2.2.5.3 Bộ phận phát tín hiệu (Detector) 30 2.2.5.4 Bộ phận xử lí tín hiệu 32 2.3 Phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ phân tử 32 2.3.1 Sự hình thành phổ hấp thụ phân tử 32 2.3.2 Độ hấp thụ quang độ truyền qua 33 2.3.3 Định luật hấp thụ quang Lambert-Beer 34 2.3.3.1 Nội dung định luật 34 2.3.3.2 Tính cộng tính độ hấp thụ quang 36 2.3.3.3 Những nguyên nhân làm sai lệch định luật Lambert-Beer 37 2.3.4 Sơ đồ thiết bị 41 2.3.4.1 Thiết bị quang phổ chùm tia 41 2.3.4.2 Thiết bị quang phổ hai chùm tia 42 2.3.4.3 Thiết bị quang phổ mảng diot 43 2.3.4.4 Cuvet đựng mẫu 44 2.3.5 Ứng dụng thực tế 45 2.3.5.1 Ứng dụng môi trường 45 2.3.5.2 Ứng dụng y sinh 47 2.3.5.3 Ứng dụng công nghiệp 48 2.3.5.4 Ứng dụng pháp y 48 2.4 Phương pháp phân tích quang phổ huỳnh quang phân tử 2.4.1 Sự hình thành phổ phát quang 49 49 2.4.1.1 Phổ huỳnh quang lân quang 50 2.4.1.2 Hồi phục thông qua huỳnh quang 50 2.4.1.3 Hồi phục thông qua lân quang 52 2.4.1.4 Phổ hồi phục phổ phát xạ 53 2.4.2 Trang thiết bị đo phổ phát quang phân tử 53 2.4.2.1 Thiết bị đo huỳnh quang 53 2.4.2.2 Thiết bị đo lân quang 55 2.4.3 Phạm vi ứng dụng 56 2.4.3.1 Thuốc thử huỳnh quang 57 2.4.3.2 Phân tích chất vơ 58 2.4.3.3 Phân tích chất hữu 58 2.5 Phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử 60 2.5.1 Nguyên tắc phương pháp 61 2.5.2 Định luật hấp thụ ánh sáng nguyên tử tự 61 2.5.3 Sơ đồ thiết bị 62 2.5.3.1 Nguồn đơn sắc 63 2.5.3.2 Q trình ngun tử hóa mẫu 65 2.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng 71 2.5.5 Ứng dụng thực tế 72 2.6 Phương pháp phân tích quang phổ phát xạ nguyên tử 73 2.6.1 Cơ sở lí thuyết phương pháp 73 2.6.2 Trang thiết bị phương pháp 74 2.6.3 Các nguồn lượng kích thích phổ 75 2.6.3.1 Ngọn lửa đèn khí 75 2.6.3.2 Plasma cao tần cảm ứng (ICP) 75 2.6.4 Các yếu tố ảnh hưởng 76 2.6.4.1 Ảnh hưởng phổ 77 2.6.4.2 Ảnh hưởng hóa học 77 2.6.4.3 Ảnh hưởng ion hóa 77 2.6.5 Phạm vi ứng dụng phương pháp 78 2.7 Phương pháp phân tích phổ hồng ngoại 79 2.7.1 Sự xuất phổ hồng ngoại 80 2.7.2 Trang thiết bị phương pháp 82 2.7.2.1 Thiết bị quang phổ hai chùm tia 82 2.7.2.2 Thiết bị quang phổ chuyển hóa Fourier 82 2.7.3 Các kĩ thuật chuẩn bị mẫu 83 2.7.4 Ứng dụng phương pháp 85 Câu hỏi ôn tập 87 Bài tập 88 Tài liệu tham khảo 89 Chương 3: Các phương pháp phân tích sắc kí 90 3.1 Giới thiệu chung 90 3.2 Đại cương phương pháp phân tích sắc kí 90 3.2.1 Khái niệm sắc kí 90 3.2.2 Cơ sở lí thuyết phương pháp sắc kí 91 I-Ag + Ab*E W + S  Đo tín hiệu W Trong đó: Ag: Kháng ngun mục tiêu (chất phân tích) Ab: Kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên mục tiêu *E: Enzyme gắn với kháng thể I: Pha rắn (đĩa, giếng) để gắn thụ động kháng nguyên S: Bổ sung chất để phát triển màu tạo phát quang +: Bổ sung thuốc thử ủ Đo tín hiệu: Sử dụng thiết bị quang phổ phù hợp, thiết kế riêng cho việc đo ELISA W: Loại bỏ phần không liên kết dung dịch rửa * Các bước thực hiện: (1) Cố định kháng nguyên mục tiêu (chất phân tích) vào giếng (2) “Rửa” (3) Thêm kháng thể có gắn enzyme (4) “Rửa” (5) Thêm chất để phát triển màu tạo phát quang (6) Đo tín hiệu, ghi nhận thay đổi (màu, huỳnh quang,…) Các bước thực kỹ thuật ELISA trực tiếp sử dụng kháng thể đánh dấu minh họa hình 6.3 209 Hình 6.3 Các bước thực kỹ thuật ELISA trực tiếp sử dụng kháng thể đánh dấu 6.4.2 Kỹ thuật ELISA gián tiếp Trong kỹ thuật ELISA gián tiếp, kháng nguyên mục tiêu (chất phân tích) phủ cố định vào pha rắn (đĩa, giếng) cách hấp phụ thụ động Thêm dung dịch rửa để bão hòa tất vị trí khơng liên kết, gắn kết kháng thể (đặc hiệu với kháng nguyên mục tiêu) Kháng thể thứ cấp liên hợp enzyme thêm vào để liên kết với kháng thể Sau đó, thêm chất vào để tạo thay đổi màu sắc phát quang có cường độ tương ứng với lượng kháng nguyên (chất phân tích) có mẫu phân tích Tương tự ELISA trực tiếp, ELISA gián tiếp sử dụng hiệu sàng lọc kháng thể, định lượng protein lập đồ epitope Kháng thể thứ cấp làm tăng cường tín hiệu kháng thể chính, làm cho kỹ thuật ELISA gián tiếp nhạy ELISA trực tiếp Tuy nhiên, tạo tín hiệu cao có khả làm giảm tín hiệu phân tích tổng thể Do đó, tương tự phương pháp phân tích nào, cần tối ưu hóa quy trình phân tích trường hợp điều kiện cụ thể để thu hiệu phân tích tốt Mơ hình “phản ứng” kỹ thuật ELISA gián tiếp minh họa sau: I-Ag W + Ab W + Anti-Ab*E W 210 + S  Đo tín hiệu Trong đó: Ag: Kháng ngun mục tiêu (chất phân tích) Ab: Kháng thể chính, đặc hiệu với kháng nguyên mục tiêu Anti-Ab: kháng thể thứ cấp *E: Enzyme gắn với kháng thể I: Pha rắn (đĩa, giếng) để gắn thụ động kháng nguyên S: Bổ sung chất để phát triển màu tạo phát quang +: Bổ sung thuốc thử ủ Đo tín hiệu: Sử dụng thiết bị quang phổ phù hợp, thiết kế riêng cho việc đo ELISA W: Loại bỏ phần không liên kết dung dịch rửa * Các bước thực hiện: (1) Cố định kháng nguyên mục tiêu (chất phân tích) vào giếng (2) “Rửa” (3) Thêm kháng thể chính, đặc hiệu với kháng nguyên mục tiêu (4) “Rửa” (5) Thêm kháng thể thứ cấp có gắn enzyme (6) “Rửa” (7) Thêm chất để phát triển màu tạo phát quang (8) Đo tín hiệu, ghi nhận thay đổi (màu, huỳnh quang,…) Các bước thực kỹ thuật ELISA gián tiếp minh họa hình 6.4 211 Hình 6.4 Các bước thực kỹ thuật ELISA gián tiếp 6.4.3 Kỹ thuật ELISA bánh kẹp (sandwich) Kỹ thuật ELISA sandwich gián tiếp sử dụng hiệu nhằm phát định lượng kháng nguyên mục tiêu (chất phân tích) Theo đó, hai thành phần quan trọng kỹ thuật kháng thể bắt giữ (đặc hiệu) kháng thể phát hiện, kháng thể liên kết với epitope khác kháng nguyên mục tiêu Độ đặc hiệu độ nhạy ELISA sandwich phụ thuộc nhiều vào chất lượng kháng thể (ái lực gắn kết, độ ổn định,…) Do đó, việc lựa chọn cặp kháng thể phù hợp, đáp ứng yêu cầu thường khó Trong đó, kháng thể đơn dòng mang lại nhiều lợi so với kháng thể đa dòng, bao gồm việc xác định epitope liên kết, độ đặc hiệu độ tin cậy ELISA sandwich có nhiều ưu điểm như: mẫu khơng cần phải làm trước phân tích, độ đặc hiệu cao độ tin cậy cao cần phải liên kết với hai kháng thể riêng biệt, độ nhạy tăng từ ba đến năm lần (hoặc nhiều hơn) so với ELISA trực tiếp gián tiếp Ngoài ra, ELISA sandwich kỹ thuật lý tưởng để xác định diện kháng nguyên mục tiêu mẫu chưa biết mẫu thực phẩm, môi trường lâm sàng Mơ hình “phản ứng” kỹ thuật ELISA sandwich trực tiếp minh họa sau: 212 I-Ab W + Ag + W AB*E W + S  Đo tín hiệu Trong đó: Ag: Kháng ngun Ab: Kháng thể chính, đặc hiệu với kháng nguyên AB: Kháng thể từ loài khác so với Ab Anti-Ab: kháng thể thứ cấp *E: Enzyme gắn với kháng thể I: Pha rắn (đĩa, giếng) để gắn thụ động kháng nguyên S: Bổ sung chất để phát triển màu tạo phát quang +: Bổ sung thuốc thử ủ Đo tín hiệu: Sử dụng thiết bị quang phổ phù hợp, thiết kế riêng cho việc đo ELISA W: Loại bỏ phần không liên kết dung dịch rửa * Các bước thực hiện: (1) Cố định kháng thể vào giếng (2) “Rửa” (3) Thêm kháng nguyên (4) “Rửa” (5) Thêm kháng thể thứ cấp có gắn enzyme (6) “Rửa” (7) Thêm chất để phát triển màu tạo phát quang (8) Đo tín hiệu, ghi nhận thay đổi (màu, huỳnh quang,…) Các bước thực kỹ thuật ELISA sandwich minh họa hình 6.5 213 Hình 6.5 Các bước thực kỹ thuật ELISA sandwich 6.4.4 Kỹ thuật ELISA cạnh tranh “Cạnh tranh” có ý nghĩa hai chất phản ứng cố gắng liên kết với chất thứ ba Các thử nghiệm cạnh tranh định việc bổ sung đồng thời hai hợp phần cạnh tranh ELISA cạnh tranh bao gồm kỹ thuật cạnh tranh kháng thể kháng nguyên, trực tiếp gián tiếp Theo đó, kỹ thuật ELISA cạnh tranh kháng thể trực tiếp thực cách hấp phụ kháng nguyên lên pha rắn (đĩa, giếng) Sau rửa hợp phần kháng nguyên không hấp phụ, thêm kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên liên hợp (đánh dấu) enzyme Lượng kháng thể thêm tạo liên kết trước cho vừa đủ với lượng kháng nguyên sẵn có Tương tác kháng nguyên kháng thể (giống với ELISA trực tiếp) bị phá vỡ kháng thể đánh dấu trộn với kháng thể khác (kháng thể cạnh tranh) có khả phản ứng với kháng nguyên liên kết pha rắn Các kháng thể cạnh tranh thêm vào với khoảng nồng độ pha loãng định Do đó, thay xảy với tất số kháng thể liên kết với kháng nguyên ban đầu Sau rửa thực phản ứng, thay đánh giá giảm cường độ màu tương ứng (so với giếng đối chứng không chứa kháng thể 214 cạnh tranh) Kỹ thuật ELISA cạnh tranh kháng thể trực tiếp ngày có tầm quan trọng phân tích y sinh Trong kỹ thuật này, kháng thể từ loài sử dụng làm kháng thể cạnh tranh Mơ hình “phản ứng” kỹ thuật ELISA cạnh tranh kháng thể trực tiếp minh họa sau: I-Ag + Ab*E + S  Đo tín hiệu W W + Ag khoảng pha loãng phù hợp Trong đó: Ag: Kháng nguyên Ab: Kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên *E: Enzyme gắn với kháng thể I: Pha rắn (đĩa, giếng) để gắn thụ động kháng nguyên S: Bổ sung chất để phát triển màu tạo phát quang +: Bổ sung thuốc thử ủ Đo tín hiệu: Sử dụng thiết bị quang phổ phù hợp, thiết kế riêng cho việc đo ELISA W: Loại bỏ phần không liên kết dung dịch rửa * Các bước thực hiện: (1) Cố định (hấp phụ thụ động) kháng nguyên vào giếng (2) “Rửa” (3) Thêm kháng thể cạnh tranh mức độ pha loãng khác (4) (Tùy chọn bước “Rửa” sau ủ với AB) (5) Thêm kháng thể có gắn enzyme (đã tạo liên kết trước để tối ưu cho trình phát triển màu) (6) “Rửa” (7) Thêm chất để phát triển màu tạo phát quang (8) Đo tín hiệu, ghi nhận thay đổi (màu, huỳnh quang,…) 215 Các bước thực kỹ thuật ELISA cạnh tranh kháng thể trực tiếp minh họa hình 6.6 A: Quá trình tạo liên kết kháng nguyên kháng thể “đánh dấu” B: Thêm kháng thể cạnh tranh vào liên kết “kháng nguyên-kháng thể” thực trước Hình 6.6 Các bước thực kỹ thuật ELISA cạnh tranh kháng thể trực tiếp 6.5 Ưu nhược điểm ứng dụng phương pháp ELISA 6.5.1 Ưu điểm Phương pháp hấp thụ miễn dịch gắn enzyme (ELISA), lần đề xuất Engvall Perlmann, phương pháp phân tích nhanh, chọn lọc đặc hiệu (nhạy) để phát định lượng kháng nguyên cách sử dụng kháng thể đánh dấu (gắn) enzyme Các ưu điểm phương pháp ELISA liệt kê ngắn gọn, bao gồm: • Cho kết đáng tin cậy • Thời gian phân tích nhanh 216 • Độ chọn lọc cao • Cho phép phân tích chất khơng thể phân tích phương pháp sắc kí 6.5.2 Nhược điểm Phương pháp hấp thụ miễn dịch gắn enzyme (ELISA) cần thiết sử dụng tương tác đặc hiệu (như khóa chìa khóa) sinh học, phổ biến kháng nguyên - kháng thể Điều dẫn đến số nhược điểm liên quan đến việc khó khăn tạo kháng thể đặc hiệu với chất cần phân tích, cơng tác bảo quản hợp phần sinh học điều kiện thích hợp nghiêm ngặt, giá thành phương pháp cao,… cụ thể sau: • Do số nguyên nhân (ví dụ: phân tử sinh học có cấu trúc giống kháng nguyên, kháng thể sử dụng nghiên cứu cụ thể) làm cho khả nhận biết phân tử không đặc hiệu làm ảnh hưởng đến kết phân tích • Khoảng tuyến tính phương pháp ELISA thường hẹp, dẫn đến khó khăn định lượng chất phân tích khoảng nồng độ khác nhau, thường mẫu có nồng độ cao, khơng xác Khi đó, mẫu cần điều chỉnh khoảng làm việc phù hợp tương ứng cách pha loãng làm giàu • Kit phản ứng cần có giếng chứa lượng kháng thể để đảm bảo độ lặp lại, điều khó thiết lập Tuy nhiên, với phát triển khoa học công nghệ, nhiều kit thương phẩm cho chất lượng tốt đồng • Kit phản ứng cần bảo quản nhiệt độ thấp, cần trì điều kiện bảo quản theo khuyến cáo nhà sản suất trình vận chuyển lưu giữ trước sử dụng • Chi phí phân tích tương đối cao khó khăn việc sản xuất kháng thể đặc hiệu, trình bảo quản vận chuyển, hạn sử dụng hợp phần sinh học 217 6.5.3 Ứng dụng Phương pháp hấp thụ miễn dịch gắn enzyme (ELISA) sử dụng thường quy phòng thí nghiệm Bên cạnh đó, ELISA sử dụng nhiều lĩnh vực y tế công nghiệp thực phẩm cơng cụ chẩn đốn lâm sàng kiểm soát chất lượng Một số ứng dụng cụ thể phương pháp ELISA liệt kê bao gồm: • Phân tích hoocmon, vitamin, metabolit, chuẩn đốn (ACTH, FSH, T3, T4, glucagon, insulin, Testosteron, vitamin B12, prostagladin, glucocorticoids,…) • Phân tích độc tố thực phẩm, mơi trường (thuốc trừ sâu), thuốc chữa bệnh: barbatitute, morphine, digoxin • Phân tích chuẩn đốn để phát bệnh truyền nhiễm: HIV, hepatitis, A, B,… * Ví dụ quy trình xét nghiệm HIV huyết người: • Các bước thực hiện: (1) Mẫu huyết người (được pha loãng mức độ phù hợp: khoảng 400 lần) (2) Cho dịch huyết (đã pha loãng) vào giếng cố định kháng nguyên HIV (3) Rửa thành phần khác huyết Nếu huyết có kháng thể HIV giữ lại (4) Thêm kháng thể thứ cấp đặc hiệu với kháng thể HIV (5) Rửa Kháng thể thứ cấp có gắn enzyme giữ lại bề mặt có kháng thể HIV (6) Thêm chất đặc hiệu với enzyme kháng thể thứ cấp (7) Đo thay đổi màu sắc độ hấp thụ quang (8) So sánh kết với kết mẫu huyết người bình thường, cao mẫu huyết dương tính với HIV 218 Câu hỏi ơn tập Trình bày khái niệm đặc điểm kháng nguyên, kháng thể Trình bày nguyên tắc phương pháp hấp thụ miễn dịch gắn enzyme (ELISA) Trình bày bước thực phương pháp phân tích miễn dịch ELISA So sánh kỹ thuật ELISA trực tiếp Trình bày kỹ thuật ELISA gián tiếp So sánh kỹ thuật ELISA sandwich So sánh kỹ thuật ELISA cạnh tranh So sánh đặc điểm kỹ thuật ELISA Trình bày ứng dụng phương pháp ELISA Tài liệu tham khảo Helmut Gunzler and Alex Williams (2001), “Handbook of analytical techniques”, Wiley-VCH, Germany D Kealey et al (2002), “Analytical Chemistry”, BIOS Scientific Publishers Limited., UK John R Crowther (1995), “Methods in Molecular Biology 42: ELISA – Theory and Practice”, Humana Press Robert Hnasko (2015), “Methods in Molecular Biology 1318: ELISAMethods and Protocols”, Humana Press Douglas A Skoog (2014), “Fundamentals of analytical chemistry”, nineth edition, Brooks/Cole., USA R Kellner et al (1998), “Analytical Chemistry”, Wiley-VCH 219 Phụ lục A: Quy định AOAC độ chụm độ thu hồi Phụ lục A1 Độ chụm tối đa chấp nhận nồng độ khác TT Hàm lượng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD (%) 100 100 % 1,3 10 10–1 10 % 1,8 10–2 1% 2,7 0,1 10–3 0,1 % 3,7 0,01 10–4 100 ppm 5,3 0,001 10–5 10 ppm 7,3 0,0001 10–6 ppm 11 0,00001 10–7 100 ppb 15 0,000001 10–8 10 ppb 21 10 0,0000001 10–9 ppb 30 220 Phụ lục A2 Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác theo AOAC TT Hàm lượng (%) Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi (R%) 100 100 % 98 - 102 10 10–1 10 % 98 - 102 10–2 1% 97 - 103 0,1 10–3 0,1 % 95 - 105 0,01 10–4 100 ppm 90 - 107 0,001 10–5 10 ppm 80 - 110 0,0001 10–6 ppm 80 - 110 0,00001 10–7 100 ppb 80 - 110 0,000001 10–8 10 ppb 60 - 115 10 0,0000001 10–9 ppb 40 - 120 221 Phụ lục B: Đáp số số tập B1 Bài tập chương Tần số (f): 5,34.1014 (Hz); Năng lượng (E): 3,538.10–19 Độ truyền qua (T): 5,37% 9,12.10–6 M a) 6,97.10–5 M b) 6,97.10–4 M c) 0,1 mg a) 78.730 M–1.cm–1 b) 1,98.10–6 M [Cr3+]: 8,859.10–3 M, [Co2+]: 0,0359.10–3 M B1 Bài tập chương N = 15.683 đĩa lý thuyết H = 0,777 mm 3819 đĩa lý thuyết N = 112 đĩa lý thuyết H = 0,89 mm R = 1,15 N = 2.057 đĩa lý thuyết 222 H = 0,12cm N = 2819 đĩa lý thuyết B1 Bài tập chương a) 0,108V b) 0,496V a) 0,03V b) -0,159V a) 1,289V b) 0,394V a) 0,1494V b) 0,728V 1,242 V 0,068 V 223 ... chung phương pháp phân tích 1.1 Giới thiệu chung 1.2 Các bước trình phân tích 1.3 Phân loại phương pháp phân tích 1.4 Các thơng số quan trọng để đánh giá phương pháp phân tích 1.5 Các phương pháp. .. đại cương phương pháp phân tích sắc kí, phương pháp phân tích sắc kí khí, phương pháp phân tích sắc ký lỏng, phương pháp phân tích sắc ký ion phương pháp sắc kí khác - Chuơng Phương pháp điện... chung phương pháp phân tích: giới thiệu chung, bước q trình phân tích, phân loại phương pháp phân tích, thơng số quan trọng để đánh giá phương pháp phân tích, phương pháp chuẩn hóa - Chương Các phương