Giáo trình các phương pháp phân tích

LỜI MỞ ĐẦU Hóa học phân tích là khoa học nghiên cứu về các phương pháp xác định thành phần cấu tạo định tính và hàm lượng định lượng của một hoặc nhiều thành phần của vật chất mẫu phân t

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ ÁNH HƯỜNG PHẠM THỊ NGỌC MAI

GIÁO TRÌNH CÁC PHƯƠNG PHÁP

PHÂN TÍCH

HÀ NỘI - 2019

LỜI MỞ ĐẦU

Hóa học phân tích là khoa học nghiên cứu về các phương pháp xác định thành phần cấu tạo (định tính) và hàm lượng (định lượng) của một hoặc nhiều thành phần của vật chất (mẫu phân tích), đáp ứng nhu cầu ngày càng đa dạng và phức tạp của các ngành khoa học, kỹ thuật và đời sống Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, nhiều phương pháp phân tích từ đơn giản đến phức tạp, tương ứng xác định ở các mức hàm lượng khác nhau (từ lượng lớn đến lượng siêu vết) của chất phân tích

đã được ra đời Trong đó, các phương pháp phân tích (còn có thể được gọi là các phương pháp phân tích công cụ, các phương pháp phân tích hiện đại) được phát triển trên cơ sở nguyên tắc của hóa lý hoặc công nghệ sinh học, đang được sử dụng phổ biến và rộng rãi nhằm xác định lượng vết, siêu vết của chất phân tích Các phương pháp này đóng vai trò rất quan trọng trong nhiều lĩnh vực như phân tích môi trường,

y sinh, pháp y, thực phẩm, dược phẩm,…

Cuốn sách “Các phương pháp phân tích” được ra đời trong khuôn khổ chương trình phát triển và hoàn thiện học liệu cho các môn học thuộc chương trình đào tạo chuyên ngành và liên ngành của Trường Đại học Mở Hà Nội Với mục đích giới thiệu những kiến thức cơ bản, cũng như một số khả năng ứng dụng của các phương pháp hiện đại thường dùng trong phân tích, đặc biệt là phân tích môi trường, sinh học và thực phẩm, cuốn sách này được biên soạn với các nội dung chính là các nhóm phương pháp phân tích được chia thành các chương tương ứng:

- Chương 1 Giới thiệu chung về các phương pháp phân tích: giới thiệu chung, các bước của quá trình phân tích, phân loại các phương pháp phân tích, các thông số quan trọng để đánh giá phương pháp phân tích, các phương pháp chuẩn hóa

- Chương 2 Các phương pháp phân tích quang học: giới thiệu chung, đại cương về các phương pháp phân tích quang học, phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ phân tử, phương pháp phân tích quang phổ huỳnh quang phân tử, phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử, phương pháp

phân tích quang phổ phát xạ nguyên tử, phương pháp phân tích phổ hồng ngoại

- Chương 3 Các phương pháp phân tích sắc kí: giới thiệu chung, đại cương về các phương pháp phân tích sắc kí, phương pháp phân tích sắc kí khí, phương pháp phân tích sắc ký lỏng, phương pháp phân tích sắc ký ion và các phương pháp sắc kí khác

- Chuơng 4 Phương pháp điện di mao quản: nguyên tắc của phương pháp, cơ

sở lí thuyết của phương pháp điện di mao quản, mao quản sử dụng trong CE, dòng điện di thẩm thấu, các kĩ thuật bơm mẫu, một số detector thông dụng trong CE, ứng dụng của CE

- Chuơng 5 Các phương pháp phân tích điện hóa: giới thiệu chung, điện cực, phương pháp đo thế, phương pháp đo độ dẫn

- Chuơng 6 Phương pháp hấp thụ miễn dịch gắn enzym: giới thiệu chung, kháng nguyên - kháng thể, nguyên tắc của phương pháp, các kỹ thuật ELISA,

ưu nhược điểm và ứng dụng của phương pháp ELISA

Cuốn sách hy vọng sẽ hữu ích cho các bạn sinh viên trong quá trình học tập, cũng như cho các đồng nghiệp, các nhà nghiên cứu trong công việc của mình Trong quá trình biên soạn chắc chắn sẽ không tránh khỏi những thiếu sót Chúng tôi mong nhận được những ý kiến đóng góp của các chuyên gia, bạn bè đồng nghiệp và các bạn sinh viên để sửa chữa và bổ sung cho những lần tái bản sau

Nhóm tác giả

Phạm Thị Ngọc Mai và Nguyễn Thị Ánh Hường

DANH MỤC VIẾT TẮT

Kí hiệu

viết tắt

AAS Atomic absorption

ATR Attenuated total reflectance (đo) Giảm tổng độ phản xạ

CCE Chiral Capillary

Sắc kí điện mao quản

CGE Capillary Gel Electrophoresis Điện di mao quản gel

CIEF Capillary Isoelectric Focusing Điện di mao quản điểm đẳng

điện CITP Capillary Isotachophoresis Điện di mao quản đẳng tốc độ CRM Certified reference material Mẫu chuẩn so sánh

CTAB Cetyltrimethylammonium

bromide

Cetyltrimethylammonium bromua

CZE Capillary Zone

Electrophoresis

Điện di mao quản vùng

Kí hiệu

viết tắt

DSCE Dynamic Sieving Capillary

Immunosorbent Assay

Hấp thụ miễn dịch gắn enzyme

EOF Electro-osmotic flow Dòng điện di thẩm thấu ESI Electrospray ionization Ion hóa phun điện tử

F-AAS Flame atomic absorption

spectroscopy

Phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa

FID Flame ionization detector Detector ion hóa ngọn lửa FT-IR Fourier transformation-

HCL Hollow cathode lamp Đèn catot rỗng

HPCE High performance Capillary

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

IC Ion chromatography Sắc kí ion

Kí hiệu

viết tắt

ICP Inductively coupled plasma Plasma cảm ứng cao tần

ICP-MS Inductively coupled

plasma-Mass spectrometry

Khối phổ plasma cảm ứng cao tần

ICP-OES Inductively coupled

plasma-Optical emission spectroscopy

Phổ phát xạ plasma cảm ứng cao tần

LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

MCEKC Micellary Capillary

Electro-Kinetic Chromatography

Sắc ký điện động học mixen

MFS Molecular fluorescence

spectroscopy

Phổ huỳnh quang phân tử

MW Molecular weight Trọng lượng phân tử

PA p-aminobenzoic acid Acid p-aminobenzoic

PAH Polycyclic aromatic

hydrocarbon

Hydrocacbon đa vòng thơm

PH p-hydroxybenzoic acid Acid p-hydroxybenzoic

PLOT Porous layer open tubular (cột) ống hở phủ lớp xốp RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SCOT support-coated open tubular (cột) ống hở chứa chất nhồi

phủ pha tĩnh

SD Standard deviation Độ lệch chuẩn

SDS Sodium dodecyl sulfate Sodium dodecyl sulfate

Kí hiệu

viết tắt

SIM Selective ion monitoring Chế độ theo dõi ion chọn lọc TCD Thermal conductivity detector Detector độ dẫn nhiệt

TFE Tetra fluoro ethylene Tetra fluoro ethylen

TLC Thin layer chromatography Sắc kí lớp mỏng

TP Terephthalic acid Acid terephthalic

UV-VIs Ultraviolet-Visible Tử ngoại-nhìn thấy

WCOT Wall-coated open tubular (Cột) ống hở có thành phủ pha

tĩnh

MỤC LỤC

Chương 1: Giới thiệu chung về các phương pháp phân tích 1

1.4 Các thông số quan trọng để đánh giá phương pháp phân tích 7

1.5.2 Phương pháp đường chuẩn (ngoại chuẩn) 12

Chương 2: Các phương pháp phân tích quang học 18

2.2 Đại cương về các phương pháp phân tích quang học 18

2.2.2 Tương tác của vật chất với ánh sáng 20

2.2.4 Phân loại các phương pháp phân tích quang học 24 2.2.5 Các thành phần cơ bản của thiết bị đo phổ 25

2.2.5.2 Bộ phận phân giải quang học -chọn lọc bước sóng 26 2.2.5.3 Bộ phận phát hiện tín hiệu (Detector) 30

2.3 Phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ phân tử 32 2.3.1 Sự hình thành phổ hấp thụ phân tử 32 2.3.2 Độ hấp thụ quang và độ truyền qua 33

2.3.3 Định luật hấp thụ quang Lambert-Beer 34

2.3.3.2 Tính cộng tính của độ hấp thụ quang 36 2.3.3.3 Những nguyên nhân làm sai lệch định luật

2.5 Phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử 60

2.5.2 Định luật cơ bản về sự hấp thụ ánh sáng của nguyên tử

tự do

61

2.6 Phương pháp phân tích quang phổ phát xạ nguyên tử 73

2.6.3 Các nguồn năng lượng kích thích phổ 75

2.7.2.1 Thiết bị quang phổ hai chùm tia 82 2.7.2.2 Thiết bị quang phổ chuyển hóa Fourier 82

Chương 3: Các phương pháp phân tích sắc kí 90

3.2 Đại cương về các phương pháp phân tích sắc kí 90

3.2.2 Cơ sở lí thuyết của phương pháp sắc kí 91

3.2.3 Phân loại các phương pháp phân tích sắc ký 92

3.2.3.2 Phân loại theo cách thực hiện 92

3.2.4 Các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký 94

3.3.2 Các loại khí mang dùng trong sắc kí khí 106

3.3.5 Ứng dụng của phương pháp phân tích sắc kí khí 120

3.6.1.2 Ưu nhược điểm của sắc kí lớp mỏng 143 3.6.1.3 Hiệu quả tách của sắc kí lớp mỏng 143 3.6.1.4 Tính giá trị Rf của chất phân tích 145 3.6.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến Rf 145

4.2 Cơ sở lí thuyết của phương pháp điện di mao quản 154

Chuơng 5 Các phương pháp phân tích điện hóa 177

5.4.3 Phương pháp chuẩn độ đo độ dẫn điện 193 5.4.3.1 Chuẩn độ đo độ dẫn điện theo phản ứng axit-bazơ 194 5.4.3.2 Chuẩn độ đo độ dẫn điện theo phản ứng tạo phức 195 5.4.3.3 Chuẩn độ đo độ dẫn điện theo phản ứng tạo kết

Chuơng 6 Phương pháp hấp thụ miễn dịch gắn enzym 201

6.2.1 Kháng nguyên 202

6.4.3 Kỹ thuật ELISA bánh kẹp (sandwich) 211

6.5 Ưu nhược điểm và ứng dụng của phương pháp ELISA 216

Chương 1 Giới thiệu chung về các phương pháp phân tích

1.1 Giới thiệu chung

Mục tiêu của chương này nhằm giới thiệu các khái niệm chung nhất liên quan đến phân tích công cụ, bao gồm các bước của một quá trình phân tích, phân loại các phương pháp phân tích theo tín hiệu đo, ưu nhược điểm của từng phương pháp, các thông số được sử dụng để đánh giá một qui trình phân tích, cũng như các phương pháp đường chuẩn, thêm chuẩn được sử dụng trong phân tích công cụ

Hóa học phân tích nghiên cứu việc tách, nhận biết và định lượng thành phần hóa học của các mẫu vật liệu tự nhiên và tổng hợp Phân tích định tính cung cấp các thông tin để định dạng các thành phần trong mẫu, còn phân tích định lượng cho thông tin về hàm lượng của một hoặc nhiều thành phần của mẫu

Hóa học phân tích có rất nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau của cuộc sống, trong công nghiệp, y tế cũng như trong các ngành khoa học Để chẩn đoán và điều trị bệnh cho bệnh nhân, mỗi ngày cần xác định hàm lượng O2, CO2 trong hàng nghìn mẫu máu tại các bệnh viện Để đánh giá được mức

độ ô nhiễm không khí, cần xác định được hàm lượng các chất gây ô nhiễm như NOx, CO, CO2, các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi (VOC) trong không khí Để đánh giá được giá trị dinh dưỡng của thực phẩm, cần xác định được hàm lượng protein hoặc các vitamin Để đạt được các tính chất mong muốn như độ cứng,

độ bền ăn mòn, độ dẻo, cần phân tích thành phần của thép trong quá trình sản xuất để điều chỉnh kịp thời hàm lượng của các nguyên tố thêm vào như C, Ni, Cr,… Việc theo dõi hàm lượng mercaptan trong khí ga cung cấp cho gia đình cho phép đảm bảo việc cảnh báo rò rỉ ga trong quá trình sử dụng Để đảm bảo bón phân cho đất trồng trọt phù hợp với cây trồng và vụ mùa, cần phân tích các chỉ tiêu dinh dưỡng của cây và đất trồng,…

Các phép đo định lượng cũng đóng vai trò rất quan trọng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như hóa học, hóa sinh, địa chất học, vật lí học và các ngành khoa học khác Tốc độ phản ứng được tính bằng cách đo chính xác nồng độ chất tại các khoảng thời gian khác nhau Các nhà địa chất học nhận biết các nguồn thủy tinh từ núi lửa (khí núi lửa, đá núi lửa) thông qua việc đo nồng độ

các nguyên tố vi lượng trong mẫu lấy tại các địa điểm khác nhau Thông tin này cũng cho phép lần theo dấu vết các con đường buôn bán hàng hóa và vũ khí làm bằng đá núi lửa từ thời cổ đại Vai trò của hóa học phân tích trong công nghiệp và các lĩnh vực khác được minh họa trong Hình 1.1

Hình 1.1 Vai trò của hóa học phân tích đối với các ngành khoa học khác

1.2 Các bước của quá trình phân tích

Quá trình phân tích thường bắt đầu từ việc đặt các câu hỏi không mang tính phân tích như “Nước này có an toàn để uống không?”, hoặc “Môi trường không khí nơi làm việc của công nhân có đảm bảo điều kiện an toàn vệ sinh lao động không?”, Người phân tích sẽ chuyển các câu hỏi này thành các yêu cầu phân tích cụ thể, sau đó sẽ lựa chọn hoặc phát triển các qui trình phân tích phù hợp

Khi kết thúc quá trình phân tích, người phân tích phải chuyển các kết quả này lại thành các khái niệm mà ai cũng có thể hiểu được Một trong các đặc điểm quan trọng của kết quả phân tích là độ tin cậy của kết quả, để trả lời những câu hỏi như: Độ không đảm bảo đo thống kê của kết quả là bao nhiêu? Nếu lấy cùng một mẫu theo các cách khác nhau kết quả có giống nhau hay

không? Có thật sự tìm thấy một lượng rất nhỏ (lượng vết) của chất phân tích không, hay đó là sự nhiễm bẩn?

Một quá trình phân tích thường gồm những bước sau:

Bước 1: Xác định vấn đề

Trong bước này, người phân tích cần trả lời được các câu hỏi sau:

- Cần phân tích cái gì, trong đối tượng mẫu nào?

- Định tính hay định lượng? Ai sẽ dùng thông tin, khi nào, để làm gì?

- Cần độ chính xác như thế nào?

- Kinh phí phân tích

Bước 2: Lựa chọn phương pháp

Sau khi đã có câu trả lời cho các câu hỏi đặt ra ở bước 1, người phân tích

sẽ lựa chọn phương pháp phân tích phù hợp, dựa trên các tiêu chí sau:

- Loại mẫu, lượng mẫu

- Khoảng nồng độ chất trong mẫu, nền mẫu, các chất có thể gây ảnh hưởng đến quá trình phân tích

- Độ chính xác

- Thiết bị đo sẵn có

- Thời gian, tốc độ, chi phí,

- Phương pháp có sẵn (tốt nhất nên dùng phương pháp tiêu chuẩn)

Bước 3 Chọn mẫu đại diện

Kết quả phân tích chỉ đúng khi chọn đúng mẫu đại diện, có nghĩa là mẫu được chọn phản ánh trung thành đại diện cho đối tượng cần phân tích

Bước 4 Chuẩn bị mẫu

Phụ thuộc vào trạng thái ban đầu của mẫu phân tích và phương pháp phân tích lựa chọn, có thể có các cách xử lý mẫu khác nhau như:

- Phân huỷ mẫu

- Tách hoặc che các chất gây ảnh hưởng bằng các phương pháp khác nhau: chiết lỏng – lỏng, chiết pha rắn, cộng kết, sắc kí, dùng chất che,

- Làm giàu nếu nồng độ chất phân tích quá nhỏ hoặc pha loãng nếu nồng độ chất phân tích quá lớn, phù hợp với khoảng làm việc của phương pháp phân tích lựa chọn

- Tạo môi trường phù hợp

Bước 5 Giai đoạn đo

Tiến hành xác định nồng độ các chất có trong mẫu phân tích bằng phương pháp (thiết bị) phân tích phù hợp Chuẩn hóa phương pháp và xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp: giới hạn phát hiện của phương pháp, giới hạn định lượng, độ đúng, độ lặp lại,…

Bước 6 Đánh giá kết quả phân tích:

- Xử lí thống kê số liệu

- Báo cáo kết quả kèm theo thông tin về độ chính xác

1.3 Phân loại các phương pháp phân tích

Các phương pháp phân tích thường được chia thành 2 loại là các phương pháp phân tích hóa học và các phương pháp phân tích công cụ

- Các phương pháp phân tích hóa học dựa trên các phản ứng hóa học, bao gồm phương pháp trọng lượng và phương pháp chuẩn độ (hay còn gọi là phân tích thể tích) Nhóm các phương pháp này có ưu điểm là trang thiết bị đơn giản, chi phí thấp, độ chính xác cao nhưng lại có nhược điểm là chỉ xác định được nồng độ lớn (> 10-4 M) và tốn nhiều thời gian

- Các phương pháp phân tích công cụ sử dụng các thiết bị để đo các tín hiệu vật lí của mẫu phân tích, ví dụ như độ hấp thụ quang, độ dẫn điện, Các đại lượng này thường tỷ lệ với nồng độ của chất phân tích, nhờ đó sẽ xác định được nồng độ của chất Các phương pháp phân tích công cụ tuy đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, độ chính xác không cao bằng phương pháp hóa học, nhưng lại tiết kiệm được thời gian phân tích và đặc biệt là có thể xác định được lượng rất nhỏ của chất phân tích (có thể xuống tới pg)

Ngày nay, các phương pháp phân tích công cụ đang dần dần thay thế các phương pháp hóa học truyền thống Với các phương pháp này, người phân tích

có thể mở rộng phạm vi phân tích, có thể phân tích mẫu mà không phá hủy mẫu, định lượng chất phân tích trong các nền mẫu phức tạp, nghiên cứu cấu

trúc của các hợp chất hữu cơ, động học phản ứng, và thậm chí cả hóa sinh học của các phân tử sống

Các phương pháp phân tích công cụ thường được phân loại thành nhóm các phương pháp sau:

- Phương pháp quang học: dựa trên việc đo các tín hiệu quang của chất phân tích dưới tác động của ánh sáng như độ hấp thụ quang, cường độ tia phát xạ, Trong đó, các phương pháp tiêu biểu gồm: phương pháp phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis), phổ hấp thụ nguyên tử (AAS), phổ phát xạ nguyên tử (AES), phổ huỳnh quang phân tử (MFS), phổ hồng ngoại (IR),…

- Phương pháp điện hóa: dựa trên việc đo các tín hiệu điện gây nên bởi phản ứng hóa học như điện thế, dòng điện, điện lượng,… Các phương pháp điện hóa thường gặp gồm có phương pháp đo điện thế, phương pháp cực phổ, phương pháp Von-Ampe hòa tan, phương pháp điện lượng,…

- Phương pháp sắc kí: tách chất dựa trên sự tương tác khác nhau của các chất tan với pha tĩnh và pha động khi được pha động mang theo chảy qua pha tĩnh

- Ngoài ra còn một số phương pháp khác như phương pháp miễn dịch học, động học, phương pháp phóng xạ, ,

Một số phương pháp phân tích công cụ thường gặp được tóm tắt trong Bảng 1.1, cùng với khoảng nồng độ chất có thể phát hiện tương ứng với mỗi phương pháp

Bảng 1.1 Các phương pháp phân tích công cụ thường gặp

Kĩ thuật Phá hủy

mẫu

Siêu vết (< 1 ppm)

Vết (1 ppm - 0,1%)

Lượng nhỏ (0,1 - 10

%)

Lượng lớn (> 10 %)

Kĩ thuật Phá hủy

mẫu

Siêu vết (< 1 ppm)

Vết (1 ppm - 0,1%)

Lượng nhỏ (0,1 - 10

%)

Lượng lớn (> 10 %)

Phổ hồng ngoại

(IR)

Kĩ thuật Phá hủy

mẫu

Siêu vết (< 1 ppm)

Vết (1 ppm - 0,1%)

Lượng nhỏ (0,1 - 10

%)

Lượng lớn (> 10 %)

1.4 Các thông số quan trọng để đánh giá phương pháp phân tích

Để đảm bảo có thể áp dụng một phương pháp phân tích trong thực tế với kết quả đáng tin cậy, cần đánh giá phương pháp thông qua một số thông số quan trọng như: độ đúng, độ chụm, độ nhạy, độ tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

* Độ đúng: sự giống nhau giữa giá trị thực nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị

mong đợi Độ đúng có thể biểu diễn qua sai số tuyệt đối và sai số tương đối

trong đó S là sai số tuyệt đối, x là giá trị trung bình và µ là giá trị thực

Sai số tương đối: S% = S

Để đánh giá độ đúng có thể thực hiện theo những cách sau:

1 Phân tích mẫu chuẩn được chứng nhận (CRM - certified reference material) hay mẫu chuẩn so sánh là mẫu có nền tương tự với nền mẫu cần

phân tích

2 So sánh với kết quả đo của một hoặc nhiều phương pháp phân tích khác

3 Phân tích mẫu trắng đã được thêm (spike) một lượng đã biết của chất phân tích Nền mẫu trắng phải giống với nền của mẫu phân tích Nếu phân tích thành phần chính, cần làm lặp 3 lần với 3 mức nồng độ thêm vào lớn gấp

từ 0,5 lần đến 1,5 lần so với giá trị dự đoán của chất trong mẫu cần phân tích Nếu phân tích các tạp chất (lượng nhỏ), lượng thêm vào cần bao trùm được toàn bộ khoảng nồng độ dự đoán

4 Nếu không thể chuẩn bị được mẫu trắng có cùng thành phần nền với mẫu

cần phân tích, khi đó có thể tiến hành phương pháp thêm chuẩn và đánh

giá qua hiệu suất thu hồi

Thêm chuẩn (spike) là phương pháp phổ biến nhất để đánh giá độ đúng của phương pháp do không phải lúc nào cũng có sẵn mẫu chuẩn so sánh, cũng như không phải lúc nào cũng tìm được phương pháp phân tích thứ hai để đối chứng Thêm chuẩn đảm bảo nền mẫu gần như không thay đổi, và được thực hiện bằng cách thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử hoặc mẫu trắng, phân tích các mẫu thêm chuẩn này, làm lặp lại n lần, sau đó tính độ thu hồi theo công thức:

R% = Cm+c −Cm

Cc × 100 (1.3) Trong đó: R%: Độ thu hồi (%)

Cm+c: Nồng độ chất phân tích trên nền mẫu thêm chuẩn Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

Độ thu hồi ở các nồng độ khác nhau có kỳ vọng khác nhau Thông thường, độ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng cho phép của Hiệp hội các nhà hóa phân tích (AOAC) ở nồng độ chất tương ứng (xem Phụ lục A)

* Độ chụm (độ lặp lại): sự giống nhau giữa các giá trị thực nghiệm được làm

lặp lại nhiều lần Độ lặp lại được thể hiện bằng độ lệch chuẩn SD hoặc độ lệch chuẩn tương đối RSD %

tb x

SD

Trong đó xtb giá trị trung bình số học của tập hợp các giá trị xi

n là số lần thí nghiệm lặp lại

Độ chụm thiết bị (precision): là độ lặp lại khi cùng một lượng mẫu phân tích

được đo lặp lại (thường là 10 lần) trên một thiết bị Sự biến động về giá trị của các lần đo có nguồn gốc từ sự biến động về lượng mẫu và đáp ứng của thiết bị

Độ chụm giữa các lần phân tích (Intra-assay precision): phân tích một mẫu

vật liệu đồng nhất vài lần trong ngày bởi cùng một người trên cùng một thiết

bị Mỗi lần phân tích là độc lập với nhau, do đó độ chụm giữa các lần phân tích

cho biết độ lặp lại của phương pháp phân tích Độ chụm giữa các lần phân tích thường lớn hơn so với độ chụm thiết bị Ví dụ, độ chụm thiết bị là 1% thì độ chụm giữa các lần phân tích có thể là 2%

Độ chụm trung gian (Intermediate precision), trước kia còn được gọi là ruggedness, là sự biến động về giá trị đo khi mẫu được phân tích bởi nhiều

người khác nhau trên các thiết bị đo khác nhau trong các ngày khác nhau, nhưng trong cùng một thí nghiệm

Độ chụm liên phòng (Interlaboratory precision), còn được gọi là độ tái lặp, thu

được khi phân tích cùng một mẫu bởi nhiều người khác nhau trong các phòng thí nghiệm khác nhau Độ chụm liên phòng sẽ tăng khi nồng độ chất phân tích giảm

Nếu phân tích theo một tiêu chuẩn hoặc một quy trình chính thống có công bố RSD (%) thì RSD (%) tính được phải nhỏ hơn hoặc bằng RSD (%) cho phép

Nếu phân tích theo một tiêu chuẩn, một quy trình chính thống không công

bố thì RSD (%) tính được thường được so sánh với RSD (%) cho phép ở nồng

độ chất tương ứng theo AOAC (phụ lục A) Gía trị RSD (%) tính được phải nhỏ hơn giá trị trong bảng ở khoảng hàm lượng tương ứng Giá trị này thay đổi theo nồng độ chất phân tích Nồng độ chất phân tích càng thấp thì kết quả càng dao động nhiều (không chụm), nghĩa là RSD% càng lớn

Ví dụ 1.1

Để đánh giá độ lặp lại và độ thu hồi khi xác định Aspartam bằng phương pháp HPLC trong thực phẩm, dung dịch chuẩn Aspartam ở mức nồng độ 40 ppm được thêm vào mẫu thử được chọn là mẫu thạch Mỗi mẫu thử được đo lặp lại

6 lần và lấy giá trị trung bình Kết quả thu được (ppm) của 6 lần đo lặp như sau:

tb x

* Độ nhạy (Sensitivity): Khả năng phát hiện sự thay đổi của tín hiệu khi có sự

thay đổi lượng chất Cách đơn giản nhất để xác định độ nhạy của phương pháp

là đo độ dốc của đường chuẩn trong khoảng nồng độ quan tâm Độ nhạy xác

định theo cách này được gọi là độ nhạy đường chuẩn Do độ chính xác giảm

tại các giá trị nồng độ thấp, khả năng phân biệt sự khác nhau giữa các giá trị

nồng độ nhỏ cũng giảm, khi đó độ nhạy được biểu diễn dưới dạng độ nhạy phân tích, tính bằng độ nhạy đường chuẩn chia cho độ lệch chuẩn của quá

trình phân tích mẫu

* Độ đặc hiệu: Khả năng phương pháp phân tích có thể phân biệt được chất

phân tích với các thành phần còn lại có trong mẫu

* Độ tuyến tính: Đo mức độ tín hiệu tỷ lệ tuyến tính với hàm lượng chất (đường

chuẩn có phải là một đường thẳng hay không?), thường hay được đánh giá qua hệ số tương quan R2 R2 càng gần 1, độ tuyến tính càng cao Ngoài ra, độ tuyến tính còn được đánh giá qua mức độ đường chuẩn cắt gốc gần giá trị 0

Khoảng tuyến tính (linear range): khoảng nồng độ mà tín hiệu tỷ lệ tuyến tính

với nồng độ (Hình 1.2)

Khoảng động học (dynamic range): khoảng nồng độ có thể đo được tín hiệu

của chất phân tích

Hình 1.2 Khoảng động học và khoảng tuyến tính

*Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện là lượng nhỏ nhất của chất phân tích mà vẫn khác đáng

kể so với mẫu trắng.Giới hạn định lượng là lượng nhỏ nhất của chất phân tích

mà phương pháp phân tích có thể định lượng được

Có nhiều cách để xác định LOD, trong đó một trong các cách phổ biến là thêm chuẩn vào mẫu phân tích với nồng độ thấp (gần giá trị LODước lượng), phân tích lặp lại nhiều lần Giá trị LOD, LOQ được xác định từ độ lệch chuẩn

SD theo công thức dưới đây:

LOD = 3.SD (1.6) LOQ = 10.SD (1.7)

Có thể đánh giá LOD đã tính được thông qua việc tính R:

R = xtb/LOD (1.8) với xtb là giá trị trung bình

Nếu 4 ≤ R ≤ 10, nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy Nếu R < 4, phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm một lượng nhỏ chất chuẩn vào dung dịch thử đã dùng, làm lại thí nghiệm và tính lại

R Nếu R > 10, phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoặc pha loãng dung thử

đã dùng, làm lại thí nghiệm và tính lại R

1.5 Các phương pháp chuẩn hóa

1.5.1 Khái niệm đường chuẩn

Đường chuẩn xác định mối quan hệ giữa tín hiệu phân tích và nồng độ của chất phân tích

Đường chuẩn được xây dựng từ các hóa chất chuẩn, hay còn được gọi là chất chuẩn Có thể pha chất chuẩn từ các hóa chất tinh khiết nếu có sẵn, hoặc các dung dịch có nồng độ đã được chuẩn lại bằng các phương pháp định lượng truyền thống Thông thường, chất chuẩn được pha riêng không liên quan đến dung dịch phân tích (phương pháp ngoại chuẩn)

Ví dụ, khi xác định nồng độ As trong nước ngầm bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS), trước hết cần dựng đường chuẩn là đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ quang vào nồng độ của dung dịch chuẩn As Trong một số trường hợp, để giảm thiểu ảnh hưởng của các thành phần khác trong nền mẫu, có thể sử dụng cách thêm chuẩn vào dung dịch phân tích (phương pháp thêm chuẩn, phương pháp nội chuẩn) hoặc bằng cách biến đổi nền mẫu cho phù hợp

1.5.2 Phương pháp đường chuẩn (ngoại chuẩn)

Trong phương pháp ngoại chuẩn, cần pha một dãy các dung dịch chuẩn, không liên quan đến mẫu phân tích Thông thường, cần pha từ 3 dung dịch chuẩn trở lên Dựng đồ thị sự phụ thuộc của tín hiệu đo vào nồng độ dung dịch

chuẩn Đồ thị này được gọi là đường chuẩn (calibration curve), hay còn được gọi là đường làm việc (working curve) Đường chuẩn thường phải tuyến tính ít nhất trong khoảng nồng độ của chất phân tích Ví dụ của đường chuẩn cho tín hiệu độ hấp thụ quang của phosphat theo nồng độ chất phân tích được cho trong Hình 1.3

Hình 1.3 Đường chuẩn xác định phosphat bằng phương pháp quang phổ

hấp thụ phân tử (UV-Vis) sử dụng thuốc thử xanh molypden

Để tìm được phương trình toán học biểu diễn đường hồi qui tốt nhất đi qua các điểm chuẩn, thường sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu Đo tín hiệu của mẫu, có thể tính được nồng độ của chất phân tích trong mẫu từ phương trình đường chuẩn

1.5.3 Phương pháp nội chuẩn

Trong phương pháp nội chuẩn, một lượng đã biết của một chất tham chiếu được thêm vào mẫu phân tích, mẫu chuẩn và mẫu trắng Khi đó, tín hiệu đáp ứng không phải là tín hiệu của chất phân tích mà là tỉ lệ tín hiệu phân tích trên tín hiệu chất tham chiếu Đường chuẩn được dựng với trục y là tỉ lệ của 2 tín hiệu và trục x là nồng độ chất chuẩn Hình 1.4 minh họa cách sử dụng chất nội chuẩn cho tín hiệu đo dạng pic

Phương pháp nội chuẩn có thể bù trừ được một số nguồn sai số gây ảnh hưởng đến cả chất phân tích lẫn chất nội chuẩn theo cùng một mức độ Ví dụ, nếu nhiệt độ cùng ảnh hưởng đến chất phân tích và chất nội chuẩn với cùng một mức độ, việc lấy tỉ lệ 2 tín hiệu sẽ bù trừ lại được các biến động về nhiệt

y = 0,5605x - 0,0182R² = 0,9994

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6

C (ppm)

độ Một chất nội chuẩn tốt cần phải có tính chất hoá học và vật lí tương tự với chất phân tích

Ví dụ, trong phương pháp phát xạ ngọn lửa khi xác định Na thường sử dụng Li làm chất nội chuẩn (Hình 1.4) Đồ thị đường chuẩn biểu diễn tỉ lệ tín

hiệu của Na/tín hiệu Li theo nồng độ của Na

Hình 1.4 Minh họa phương pháp nội chuẩn Một lượng nội chuẩn cố định được thêm vào mẫu, mẫu chuẩn và mẫu trắng Đường chuẩn biểu diễn tỉ lệ tín hiệu chất phân tích/tín hiệu chất nội chuẩn theo nồng độ chất phân tích

Chất nội chuẩn không được phép chứa các chất ảnh hưởng khác với chất phân tích Hóa chất dùng để pha chất nội chuẩn cũng không được phép chứa lượng nhỏ của chất phân tích Nồng độ của chất nội chuẩn thêm vào trong mẫu phân tích phải nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn Việc tìm được chất nội chuẩn phù hợp vì vậy không phải dễ dàng

1.5.4 Phương pháp thêm chuẩn

Phương pháp thêm chuẩn được sử dụng khi không thể pha được dung dịch ngoại chuẩn có nền và thành phần giống với mẫu phân tích Khi đó, một lượng đã biết của dung dịch chuẩn chất phân tích sẽ được thêm (spike) vào

mẫu Thể tích thêm chuẩn thường rất nhỏ so với tổng thể tích chung và nồng

độ chất ko thay đổi sau khi thêm lượng chuẩn mới

Trong phương pháp thêm chuẩn một điểm cần lấy 2 dung dịch mẫu Một dung dịch được đo như bình thường, một dung dịch được thêm vào một lượng chuẩn đã biết Nồng độ chất phân tích được tính từ tín hiệu của dung dịch mẫu

và dung dịch mẫu thêm chuẩn

Trong phương pháp thêm chuẩn nhiều điểm, thêm các lượng chất chuẩn khác nhau vào các dung dịch mẫu, sau đó dựng đường thêm chuẩn nhiều điểm Đường thêm chuẩn nhiều điểm bảo đảm mối quan hệ tuyến tính giữa tín hiệu

và nồng độ chất phân tích (Hình 1.5)

Phương pháp thêm chuẩn 1 dung dịch, tổng thể tích thay đổi cũng là một trong các phương pháp thêm chuẩn phổ biến, đặc biệt hay được sử dụng trong phân tích Von-Ampe Trong phương pháp này, chúng ta lần lượt thêm các thể tích chất chuẩn tăng dần vào cùng dung dịch mẫu Ví dụ minh họa về đồ thị thêm chuẩn của phương pháp thêm chuẩn một dung dịch được cho trong Hình 1.6

Hình 1.5 Đồ thị thêm chuẩn 1 dung dịch, tổng thể tích thay đổi

Hình 1.6 Thêm chuẩn với thể tích không đổi

Nhược điểm lớn của phương pháp thêm chuẩn là tốn nhiều thời gian để chuẩn bị và đo các mẫu thêm chuẩn Ưu điểm chính là bù trừ được các ảnh hưởng phức tạp của nền mẫu mà người phân tích còn chưa biết

Câu hỏi ôn tập

1 Trình bày vai trò của Hóa phân tích trong khoa học và trong đời sống Lấy một ví dụ minh họa cụ thể

2 Trình bày và phân tích các bước của một quá trình phân tích

3 Các phương pháp phân tích công cụ có thể được phân loại theo những nhóm nào?

4 Trình bày các thông số quan trọng để đánh giá phương pháp phân tích và công thức tính: độ chụm, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

5 Phân biệt khái niệm độ chụm giữa các lần phân tích, độ chụm trung gian và

độ chụm liên phòng

6 Trình bày nguyên tắc của các phương pháp đường chuẩn (ngoại chuẩn), nội chuẩn và thêm chuẩn

7 Yêu cầu của chất nội chuẩn

8 So sánh ưu nhược điểm của phương pháp ngoại chuẩn và thêm chuẩn

Tài liệu tham khảo

1 Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học &

vi sinh vật, Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật

2 D A Skoog, D M West, E J Holler, S R Crouch (2014), Fundamentals

of Analytical Chemistry, Brooks/Cole Publisher, 9th edition

3 D T Harveys (1999), Modern Analytical Chemistry, Mc Graw-Hill, 1srtedition

4 D C Harris (2010), Quantitative Chemical Analysis, W H Freeman and

Company, 8th edition

Chương 2 Các phương pháp phân tích quang học

2.1 Giới thiệu chung

Mục tiêu của chương này là giới thiệu về các phương pháp phân tích quang học, dựa trên cơ sở tương tác của vật chất với các bức xạ tử ngoại, nhìn thấy và hồng ngoại Các phương pháp này được gọi là phương pháp quang học

do đều sử dụng các bộ phận quang học để phân tán và hội tụ bức xạ

Tuy có nhiều phương pháp khác nhau, tất cả các phương pháp quang học đều có một số đặc điểm chung đặc biệt là về cấu tạo thiết bị Do vậy, chương này trước hết sẽ giới thiệu về các điểm chung giữa các phương pháp như nguyên tắc sự tạo thành phổ, các bộ phận cấu tạo chung của các thiết bị đo quang: nguồn bức xạ, nguồn kích thích, bộ phận chọn lọc bước sóng, bộ phận nhận biết tín hiệu (detector),… Sau đó sẽ đi sâu hơn vào giới thiệu đặc điểm cụ thể cùng các ứng dụng thực tế của một số phương pháp quang học phổ biến như:

- Phương pháp phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis)

- Phương pháp phổ huỳnh quang phân tử

- Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)

- Phương pháp phổ phát xạ nguyên tử (AES)

- Phương pháp phổ hồng ngoại

Bằng cách so sánh và tìm ra mối liên hệ với các phương pháp tương tự, người học sẽ có thể dễ dàng hiểu được khi tiếp cận với một phương pháp quang học mới

2.2 Đại cương về các phương pháp phân tích quang học

Các phương pháp phân tích quang học dựa trên việc nghiên cứu sự tương tác của ánh sáng với chất cần nghiên cứu hoặc sự phát ra ánh sáng dưới một tác động vật lý nào đó

Ví dụ: Khi chiếu ánh sáng vào một dung dịch sẽ xảy ra các hiện tượng

như: khúc xạ, quay mặt phẳng ánh sáng phân cực (do tính chất toàn khối của dung dịch); sự hấp thụ hoặc phát huỳnh quang (do tính chất của các tiểu phân: các nguyên tử, phân tử)

2.2.1 Ánh sáng và bức xạ điện từ

Ánh sáng là một dạng bức xạ điện từ Các bức xạ điện từ bao gồm: ánh sáng nhìn thấy, các tia tử ngoại, hồng ngoại, tia Rơntgen (tia X), tia , sóng radio, Các bức xạ điện từ đều có bản chất hai mặt là vừa có tính chất sóng, vừa có tính chất hạt

Theo tính chất sóng, các bức xạ điện từ là những dao động có hai thành

phần điện trường và từ trường lan truyền theo một phương

𝜗 = 𝐶

Trong đó: υ là tần số (Hz); C là tốc độ ánh sáng (cm/s); λ là bước sóng

(nm)

Theo quan điểm hạt, bức xạ điện từ là các hạt mang năng lượng, được

gọi là photon, lan truyền theo phương z với vận tốc ánh sáng Các dạng bức xạ điện từ khác nhau sẽ có năng lượng khác nhau

m = h/c2 = h/c (2.2) trong đó, h là hằng số Plank và h = 6,625.10-34 J.sec

Khi lan truyền, sóng điện từ mang theo năng lượng E Mối liên hệ giữa

E và  được biểu diễn theo phương trình sau:

Năng lượng (E) của ánh sáng tỉ lệ thuận với tần số và tỉ lệ nghịch với bước sóng Bức xạ điện từ có bước sóng càng ngắn thì mức năng lượng càng cao

Sóng điện từ được chia thành các vùng (dải) phổ tương ứng khác nhau theo độ dài sóng Phổ của sóng điện từ được trải dài từ tia , tia X, tử ngoại, khả kiến, hồng ngoại, vi sóng, truyền hình, truyền thanh Sóng điện từ có bản chất giống nhau, chỉ khác nhau về độ dài bước sóng (Bảng 2.1)

STT Tên bức xạ Vùng của  Tên gọi của phổ

2.2.2.Tương tác của vật chất với ánh sáng

Tương tác giữa vật chất và ánh sáng có thể xảy ra dưới nhiều dạng

Hấp thụ và phát xạ photon: tương ứng với việc mất đi và tạo thành

photon, liên quan đến sự chuyển mức năng lượng của các cấu tử hóa học

Hình 2.1 Sự hấp thụ và phát xạ photon

Phát quang: tương ứng với sự tạo thành photon, gây ra dosự chuyển

mức năng lượng của vật chất sau khi bị kích thích bởi ánh sáng, bao gồm huỳnh

quang và lân quang

Hình 2.2 Sự phát huỳnh quang và lân quang

Tán xạ ánh sáng: sóng ánh sáng khi gặp các hạt có kích thước nhỏ hơn

bước sóng thì sẽ bị đổi hướng một cách ngẫu nhiên, lan truyền theo tất cả các hướng Các loại tán xạ ánh sáng bao gồm có tán xạ Rayleigh, tán xạ Brilouin, tán xạ Raman Các hiện tượng liên quan đến tán xạ ánh sáng gồm có phản xạ, khúc xạ và nhiễu xạ

Hình 2.3 Sự tán xạ ánh sáng

Các hiện tượng tán xạ ánh sáng liên quan chủ yếu đến các tính chất khối của vật liệu, còn các hiện tượng hấp thụ, phát xạ và phát quang chủ yếu liên quan đến các đặc tính về mức năng lượng của phân tử và nguyên tử Nội dung của chương này sẽ chỉ tập trung vào các tương tác của ánh sáng với các mức năng lượng của phân tử và nguyên tử, loại tương tác nào cụ thể sẽ xảy ra phụ

thuộc chủ yếu vào năng lượng của ánh sángsử dụng

Sự hấp thụ ánh sáng

Theo thuyết lượng tử, mỗi hạt sơ cấp (nguyên tử, ion, phân tử) có một

hệ các trạng thái năng lượng Trạng thái năng lượng thấp nhất gọi là trạng thái

cơ bản Ở nhiệt độ thường, hầu hết các hạt sơ cấp đều ở trạng thái cơ bản Khi

một photon ánh sáng (một bức xạ ánh sáng có tần số ) va chạm với hạt sơ cấp, hạt sẽ hấp thụ photon khi photon này có năng lượng đúng bằng hiệu các mức năng lượng của trạng thái cơ bản (E0) và 1 trạng thái năng lượng cao hơn (Ei) của hạt Khi đó năng lượng của photon được chuyển sang cho hạt sơ cấp (nguyên tử, ion, phân tử) và hạt này sẽ chuyển lên mức trạng thái năng lượng

cao hơn gọi là trạng thái kích thích

M + h M*

E = Ei – E0 = hSau một thời gian rất ngắn (10-6 –10-9 giây) hạt ở trạng thái kích thích sẽ

phục hồi, trở về trạng thái cơ bản ban đầu

M*  M + nhiệt

Đặc tính hấp thụ photon của một chất được mô tả bởi phổ hấp thụ của

chất đó Phổ hấp thụ là đường biểu diễn sự biến đổi của độ hấp thụ theo ,  hay

Sự hấp thụ của phân tử

Năng lượng của một phân tử (Etổng) bao gồm năng lượng của điện tử Ee, năng lượng của chuyển động dao động Ev và năng lượng của chuyển động quay Er:

Etổng = Ee + Ev + Er (Trong đó Ee >> Ev >> Er) Ứng với mỗi mức dao động lại có một số mức năng lượng của chuyển động quay (không thể hiện trên hình vẽ) Trên hình vẽ có thể thấy, sự hấp thụ các bức xạ tử ngoại UV có năng lượng lớn dẫn đến sự chuyển mức năng lượng lên mức năng lượng cao E2, sự hấp thụ các bức xạ khả kiến (Vis) dẫn đến sự

chuyển mức năng lượng lên mức năng lượng thấp hơn E1, còn sự hấp thụ năng

lượng các bức xạ hồng ngoại IR chỉ dẫn đến sự thay đổi các mức năng lượng

dao động, phân tử vẫn ở trạng thái điện tử cơ bản

Sự phục hồi (giải phóng năng lượng và trở về trạng thái cơ bản): các

mũi tên hình sóng lượn ngắn giữa các mức năng lượng dao động biểu diễn sự

chuyển mức năng lượng dao động do các phân tử chất phân tích đang ở trạng

thái kích thích va chạm với các phân tử dung môi trong môi trường và chuyển

năng lượng cho các phân tử này Đây là sự phục hồi không bức xạ Sự chuyển

mức dao động này xảy ra dễ dàng nên các phân tử ở trạng thái dao động kích

thích chỉ tồn tại trong thời gian rất ngắn (10–15 giây) Sự phục hồi không bức

xạ từ một mức năng lượng điện tử cao xuống một mức điện tử thấp rất ít khi

xảy ra (mũi tên lượn sóng dài giữa hai mức năng lượng điện tử), vì vậy các

phân tử ở trạng thái kích thích này tồn tại lâu hơn (10–6 đến 10–9 giây) Sự phát

huỳnh quang là sự phục hồi có bức xạ

Giản đồ chuyển mức năng lượng thể hiện trong hình 2.4

Hình 2.4 Giản đồ chuyển mức năng lượng

2.2.3 Sự xuất hiện của phổ

Phổ hấp thụ: Phổ hấp thụ được sinh ra do sự hấp thụ năng lượng ánh

sáng của các nguyên tử, phân tử khi có bức xạ kích thích phù hợp chiếu vào

chúng Trong quá trình này nguyên tử hay phân tử nhận năng lượng để chuyển

từ mức năng lượng cơ bản (thấp) lên mức năng lượng cao Tương ứng với nguyên tử ở trạng thái khí ta có phổ hấp thụ nguyên tử (AAS), còn với phân tử

ở trong dung dịch ta có phổ hấp thụ phân tử (UV,Vis, IR,.)

Phổ phát xạ: Phổ phát xạ được sinh ra do sự giải phóng năng lượng mà

nguyên tử, hay phân tử đã nhận vào, khi chúng đã bị kích thích bằng các nguồn năng lượng phù hợp để trở về trạng thái cơ bản bền vững (qui luật tự nhiên).Ví

dụ, sự phát xạ của các nguyên tử kim loại khi bị kích thích trong ngọn lửa đèn khí, trong hồ quang điện hay nguồn cao tần cảm ứng (ICP), tạo ra phổ phát xạ của các kim loại

Phổ huỳnh quang: Là một dạng phổ phát xạ của vật chất (nguyên tử,

phân tử), khi chúng bị kích thích bằng chùm sáng có năng lượng thích hợp Nhưng ở đây, sau khi bị kích thích, các nguyên tử, phân tử ở trạng thái năng lượng cao suy biến ngay xuống mức năng lượng thấp hơn, sau đó mới phát xạ Dạng phổ phát xạ này được gọi là phổ huỳnh quang Với nguyên tử ở trạng thái khí ta có phổ huỳnh quang nguyên tử, còn với phân tử trong dung dịch ta có phổ huỳnh quang phân tử

Phổ tia X: Là phổ phát xạ của vật chất (nguyên tử, vật rắn, ) khi chúng

bị kích thích bằng chùm tia X Đây là phổ do các điện tử nội (lớp electron trong cùng K, L) của nguyên tử quyết định Khi bị kích thích, các điện tử ở lớp K nhảy lên lớp L năng lượng caohơn (trạng thái bị kích thích không bền), sau đólại nhảy về lớp K và giải phóng năng lượng chúng đã nhận để tạo ra các tia bức xạ, đó là phổ tia X

2.2.4 Phân loại các phương pháp phân tích quang học

Có thể phân loại các phương pháp phân tích quang học theo các cách khác nhau:

 Phân loại dựa theo tương tác của ánh sáng với chất phân tích, khi đó sẽ

có nhóm các phương pháp hấp thụ, phát xạ, huỳnh quang,

 Phân loại theo đặc điểm của áng sáng sử dụng, tương ứng có nhóm phương pháp hấp thụ UV-Vis, phương pháp hồng ngoại, phương pháp tia X,

 Phân loại dựa trên dạng tồn tại của chất phân tích, tương ứng có phương pháp phân tử hay nguyên tử,

Hiện nay có rất nhiều phương pháp phân tích quang học được sử dụng, tuy nhiên phổ biến nhất là các phương pháp sau:

 Phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis)

 Phương pháp phân tích quang phổ huỳnh quang phân tử (MFS)

 Phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)

 Phương pháp phân tích quang phổ phát xạ nguyên tử (AES)

 Phương pháp phân tích phổ hồng ngoại (IR)

Trong các phần sau, chúng tôi sẽ tập trung vào giới thiệu nguyên lý cơ bản và đặc điểm của các phương này

2.2.5 Các thành phần cơ bản của thiết bị đo phổ

Nhìn chung, các thiết bịphân tích quang học đều có một số thành phần

cơ bản như nguồn năng lượng, bộ phận phân giải quang học, detector đo tín hiệu, bộ phận xử lí tín hiệu có chức năng hiển thị tín hiệu Các bộ phận cơ bản này sẽ được giới thiệu dưới đây, các thiết kế cụ thể cho từng thiết bị sẽ được

mô tả chi tiết hơn trong từng phương pháp

2.2.5.1 Nguồn năng lượng

Tất cả các dạng quang phổ đều yêu cầu nguồn năng lượng Trong phổ hấp thụ và tán xạ, nguồn năng lượng là các photon Phổ phát xạ và phát quang

sử dụng năng lượng nhiệt, bức xạ (photon), hoặc năng lượng hóa học để đưa chất phân tích (nguyên tử, phân tử) lên trạng thái kích thích phù hợp

Nguồn bức xạ điện từ

Nguồn bức xạ điện từ phải cung cấp được tín hiệu đầu ra mạnh và ổn định Các nguồn bức xạ điện từ có thể chia thành 2 loại là nguồn liên tục và nguồn vạch Nguồn liên tục phát ra bức xạ trên một dải bước sóng rất rộng, với biến độ về cường độ tương đối trơn tru Trong khi đó nguồn vạch chỉ phát ra bức xạ tại một số bước sóng chọn lọc Bảng 2.2 liệt kê một số nguồn bức xạ điện từ hay gặp trong thực tế

Bảng 2.2 Các nguồn bức xạ điện từ phổ biến

Đèn H2 và D2 Nguồn liên tục từ 160-380 nm Hấp thụ phân tử

Đèn W Nguồn liên tục từ 320-2400 nm Hấp thụ phân tử

Đèn Xe arc Nguồn liên tục từ 320-2400 nm Phát quang phân tử Đèn Nernst Nguồn liên tục từ 0,4-20 µm Hấp thụ phân tử

Nguồn Vùng bước sóng Dùng cho

Đèn globar Nguồn liên tục từ 1-4 µm Hấp thụ phân tử

Dây Nichrome Nguồn liên tục từ 0,75 – 20 µm Hấp thụ phân tử

Đèn catot rỗng Nguồn vạch trong vùng UV-Vis Hấp thụ nguyên tử

Đèn hơi Hg Nguồn vạch trong vùng UV-Vis Phát quang phân tử Laser Nguồn vạch trong vùng UV-

Vis/IR

Hấp thụ nguyên tử và phân tử, phát quang và tán xạ

Nguồn năng lượng nhiệt

Nguồn năng lượng nhiệt phổ biến nhất là ngọn lửa và plasma Thông qua việc đốt hỗn hợp gồm một chất nhiên liệu và một chất oxi hóa, ngọn lửa có thể tạo ra nhiệt độ lên tới 2000 - 3400K Plasma, tạo thành từ các khí bị ion hóa,

có thể cung cấp nhiệt độ lên tới 6000 - 10 000K

Nguồn năng lượng hóa học

Các phản ứng sinh nhiệt cũng có thể tạo thành nguồn năng lượng Trong phương pháp hóa phát quang, chất phân tích được chuyển lên trạng thái năng lượng cao hơn nhờ phản ứng hóa học, khi trở về trạng thái năng lượng thấp, chúng sẽ phát ra bức xạ đặc trưng

Khi phản ứng hóa học xảy ra dưới tác dụng của enzyme, quá trình phát

ra bức xạ được gọi là sinh phát quang Các “thanh phát quang” và ánh sáng nhấp nháy phát ra từ đom đóm là các ví dụ về hóa phát quang và sinh phát quang

2.2.5.2 Bộ phận phân giải quang học - chọn lọc bước sóng

Trước kia, trong phương pháp so màu Nessler cổ điển phân tích amoniac, mẫu và các dung dịch chuẩn ammoniac được đặt trong các ống dài, đáy phẳng Sau khi thêm thuốc thử để tạo màu, đánh giá cường độ màu của dung dịch bằng cách cho ánh sáng tự nhiên đi qua đáy ống nghiệm Bằng cách so sánh màu của dung dịch đo với màu của dung dịch chuẩn chúng ta có thể xác định được nồng

độ của ammoniac trong mẫu Tuy nhiên phương pháp này chỉ áp dụng được khi dung dịch mẫu chỉ chứa một chất có khả năng hấp thụ ánh sáng Nếu trong