PHAN HAI
CO SO KHOA HOC
Trang 3Chương mười một
CẤU TRÚC AXIT NUCLEIC,
VAI TRO LUU GIU MAT MA DI TRUYEN CUA DNA Axit nucleic là những hợp chất có phân tử lượng rất lớn, nó có trong tất cả các tế bào sống ở trạng thái tự do hoặc dưới dạng liên kết với protein để tạo thành nucleoprotein Virut - có cấu trúc từ một phân tử axit nucleic rất quan trọng vì nó lưu giữ các thông tin di truyền đồng thời nó giúp thể hiện các thơng tin di truyền đó
Axit nucleic được tạo ra do quá trình trùng hợp các nucleotit cho nên cũng có thể gọi axit nucleic là polinucleotit Ngoài chức năng trùng hợp để tạo thành axit nucleic, nueleotit cịn đóng vai trò rất quan trọng quá trình trao đổi chất trung gian,
đó là những hợp chất chứa nhiều năng lượng ATP, NAD”, NADP”, FAD, CoA )
Nueleotit được cấu tạo từ 3 thành phần chính là : - pốc kiểm nitơ dị vòng
- đường pentoza - axit phosphoric
Đường pentoza gồm 2 loại là :
Riboza và Desoxi riboza
Từ đó ta có 2 loại axit nucleic là :
1 Axit desoxiribonucleic (DNA hay là ADN) tìm thấy trong chromosom của nhân tế bào động vật và thực vật Đối với các lồi procariơt như là vi khuẩn tảo xanh da trời cũng có DNA trong các chromosom
Người ta cịn tìm thấy DNA trong mitochondri của tế bào động, thực vật cũng như cloroplast ở các loại thực vật quang hợp
2 Axit ribonuclic (RNA hay ARN) tìm thấy chủ yếu trong xitoplasma của
tế bào Người ta phân biệt có 5 loại RNA đó là :
* RNA ribosom RNA khởi động
RNA vận chuyển RNA Khác
Trang 4Chúng tham gia vào quá trình thể hiện các thông tin đi truyền Một số virut thực vật, động vật và bacterophage chỉ bao gồm một gen là phân tử RNA
I DUONG PENTOZA
Trong phan tit RNA c6 chita B-D-riboza, con trong phân tử DNA có chứa
B-2-desoxiriboza O oO HOH,C OH - HOH,C OH H H H HY H H H H OH OH OH H B-D-Riboza B-2-desoxi-D-Riboza
Cả hai loại đường đều thuộc dạng D và B
II GỐC NITƠ (GỐC KIỀM)
Các gốc nitơ đều xuất phát từ hai loại gốc nitơ dị vòng là purin và pirimidin
1 Gốc purin
Có hai loại gốc purin tìm thấy trong phân tử DNA và RNA, đó là adenin và guanin
T” i
NZ Hy ‘Or \ "é) —Ä
é FY —_ NH H,NS NH
N N
Purin - Adenin Guanin
Người ta cịn tìm thấy một số gốc purin khác nhất là trong phân tử RNA thông tinvận chuyển tRNA với số lượng nhỏ Cho đến ngày nay người ta biết có khoảng 50 loại gốc hiếm thuộc hai loại purin và pirimidin Đối với purin ví dụ như :
ĩ O lỊ HN N HạC-N N N ~ | > ; NH H, ~ À NH N Hipoxanthin 5-methil-guanin 2 Gốc pirimidin
Từ gốc pirimidin có ba loại là xitosin, uraxil và thimin Trong phan tit DNA
Trang 5Trong phân tử RNA có xitosin và uraxil NH, N NZ _ | 4 Ñ O Pirimidin Xitosin Xitosin O I H H3 Trong d DNA H Thimin O I HN Trong O= RNA | H Uraxil
Người ta tìm thấy một số gốc bất bình thường trong phân tử DNA của
bacteriophage như là 5-hydroximethil xitosin thay cho vi tri xitosin -
im
N CH;OH
H
5-hydroximethyl xitosin III NUCLEOSIT
Khi một gốc nitơ kết hợp với một phân tử đường riboza hay desoxiriboza sẽ
tạo ra một ribonucleosit hay một desoxiribonucleosit
NH,
Adenosin (Adenosin ribonucleosit)
NH, N oN N HOH,C H OH H
Trang 6Bang sau đây tóm tắt tên của những nucleosit :
Bảng 11.1 : Các loại nucleosit chính
Gốc Nitơ Ribonucleosit Desoxiribonucleosit
Adenin Adenosin Desoxiadenosin
Guanin Guanosin Desoxiguanosin
Uraxil Uridin : -Desoxiuridin
Xitosin Xitidin 'Đesoxixitidin -
Thimin Ribothimidin Desoxithimidin
IV NUCLEOTIT
Khi một nucleosit tác động với một phân tử axit phosphoric sẽ tạo thành một nucleotit Theo thành phần đường pentoza, người ta phân biệt 2 loại
nucleotit 14 ribonucleotit va desoxiribonucleotit
Khi thuỷ phán một hỗn hợp nucleotit bằng các phương pháp khác nhau có thể nhận được các kết quả như sau :
Thuỷ phân bằng
axit yếu
Gốc nitơ-pentoza-phosphat _ ——————————>Øốc nitơ + pentoza-phosphat
Nucleotit —————— Géc nito-pentoza + phosphat
Thuy phan bang =
kiém yéu - N
Nucleosit Bảng 11.2: Bảng tóm tắt các nucleotit
Gốc nitơ | Ribonucleosit-5'-monophosphat Desoxiribonucleosit -5'- monophosphat
Adenin Adenin 5'monophosphat =AMP Desoxiadenosin 5'monophosphat = dAMP ,
Guanin Guanosin 5’monophosphat = GMP_ | Desoxiguanosin 5’monophosphat = d@MP
Uraxil Uridin-5'-monophosphat = UMP Desoxiuridin S'monophosphat = dUMP
Xitosin Xitidin 5'monophosphat = CMP Desoxixitidin S'monophosphat = dCMP
Thimin Thymin ribosit 5'monophosphat Desoxithimidin 5'monophosphat = dTMP (rất hiếm)
Trang 7
V CAU TRUC BAC MOT CUA AXIT NUCLEIC
Trong phân tử DNA và RNA, các nucleotit liên kết với nhau qua cầu
diestephosphat ở vị trí cacbon số 3 của đường pentoza và vị trí cacbon số 5 của
phân tử đường pentos tiếp theo Kết luận này dựa trên kết quả thực nghiệm sau :
- Khi trung hoà một phân tử axit nucleic nhận thấy mỗi phân tử axit
phosphoric chỉ có một chức năng axit tự do
- Khi dùng enzim thuỷ phân axit nucleic tuỳ thuộc vào loại enzim ta có thể thu được một hỗn hợp nucleosit 5'monophosphat hoặc nucleosit 3'monophosphat
Mạch polinucleotit được cấu tạo theo thứ tự một phân tử đường pentoza, tiếp
đến một axit phosphoric, tiếp theo là đường pentoza rồi axit phosphoric Cấu trúc này đặc trưng cho cả DNA và RNA Các phân tử DNA và RNA chỉ khác nhau về độ dài của mạch polinucleotit Dưới đây là một đoạn trinucleotit của phân tử RNA
Trang 8Các gốc nitơ tham gia vào mạch polinucleotit cũng tương tự như thứ tự các axit amin trong mạch polipeptit, nó rất quan trọng quyết định bản chất của phân
tử DNA hay RNA
XÁC ĐỊNH THỨ TỰ CÁC NUCLEOTIT
Xác định thứ tự các gốc nitơ trong một phân tử RNA và DNA cịn khó khăn
hơn việc xác định thứ tự các axit amin trong mạch protein Để nghiên cứu cấu
trúc bậc một của axit nucleic người ta phải thuỷ phân chúng 1 Thuỷ phân RNA và DNA
A Thuỷ phân bằng kiềm
Phân tử RNA có thể bị thuỷ phân bằng kiểm bởi sự cắt đứt mối liên kết giữa
nhóm phosphat và nguyên tử cacbon số 5 của phân tử đường pentoza bên cạnh
Hỗn hợp thu được sau thuỷ phân là những nucleotit 3'phosphat
OH
wih rs HỆ pes Ap +Gp + Up + Cp
Phân tử DNA bền vững với việc thuỷ phân bằng kiểm
B Thuỷ phân bằng ribonucleaza tuyến tụy
Đó là một enzim endonucleaza, nó cắt mạch phosphodiester bên trong mạch
của phân tử RNA giống như thuỷ phân bằng kiểm, phân tử DNA cũng có khả
năng kháng enzim này Vị trí cắt mạch xảy ra ở nucleotit bên cạnh cacbon 3' là một gốc nitơ thuộc nhóm pirimidin
Xitosin As Uraxil Uraxil Guanin Xitosin 2)
\ NÌNG af 3) số
Vl sử NA Su Ribo nucleaza
—* Cp+ApUp+Up + GpCp + Up
C Thuy phan bang nucleaza T,
Enzim này cắt mối liên kết phosphadieste của phân tử RNA khi bên cạnh vị trí cacbon 3' là các nucleotit có gốc kiểm là guanin
Trang 9Xitosin Adonin Guanin Uraxi Uraxil Xitosin Uraxi
NHI bebe ye mma
—» pCpApGp + UpUpCpGp
D Thuy phan bang ribonucleaza U,
N6 ciing 14 mét enzim endonucleaza phân cách mối liên kết phosphodieste của phân tử RNA ở những vị trí cacbon 3' mà nucleotit bên cạnh, có gốc nitơ là adenin hay guanin Người ta dùng enzim này để cắt tiếp các sản phẩm thu được
sau khi thuỷ phân bang ribonucleaza T,
E Thuỷ phân bằng phosphodiesteraza của noc déc ran
Khác với những enzim ở trên, nó phân cắt mối liên kết giữa axit phosphoric với cacbon 3' của đường pentoza Sản phẩm tạo ra là nucleosit 5'-monophosphat Mat khác nó là exonucleaza, nó tấn cơng phân tử oligo và polinucleotit từ đầu 3'
Và giải phóng ra nueleosit -5'- monophosphat Adenin Uraxil Guanin Xitosin
A, ae 3 } “hệ 3 Phosphodiesteraza
7 PO Ba Py fp —_————> pA+ pU + pG + pC
sò mo Xe ON
Enzim này tác động lên cả DNA và RNA
E Thuỷ phân bằng phosphodiesteraza của lá lách
Đây cũng là một exonucleaza, nó tấn cơng RNA và DNA từ đầu 5' và giải phóng một cách tuần tự nucleosit 3' monophosphat `
G Tac dụng của phosphataza kiêm cia E.coli
Phosphataza kiểm của E.coli cũng như các phosphataza khác nó chỉ có thể
cắt phân tử axit phosphoric ra khỏi một đầu của phân tử RNA hay DNA Guanin Uraxil Xitosin Adenin
Trang 10H Tac dộng của desoxiribonucleaza (=DNaza)
Những DNaza đầu tiên được phát hiện thường khơng mang tính đặc trưng
như RNaza Người ta nghiên cứu nhiều về hai loại endonucleaza sau :
- DNaza (I) tuyến tụy phân giải DNA tao ra oligodesoxiribonucleotit 5” monophosphat
- DNaza axit (II) phan giai DNA tao ra oligodesoxiribonucleotit 3’
monophosphat
Gần đây người ta phát hiện ra các enzim "endonucleaza han chế” có trong
nhiều loại vi khuẩn làm nhiệm vụ phân giải tất cả các phân tử DNA thêm nhập từ bên ngoài vào vi khuẩn Những enzim này phân cắt phân tử DNA mot cách rất đặc biệt Ví dụ 3 loại endonucleaza sử dụng hiện nay lấy từ vi khuẩn E.coli Eco
R1, Haemophilus aegitus (Hae III) va Haemophilus influenzae (Hind MI) va vi
trí nó cắt mạch AC Ỷ Eco RI GAATTC CTTAAG Ỹ L Hae III GGCC CCGG † ‡
Hind III AAGCTT
TTCGAA
t
2 Xác định thứ tự các nucleotit trong phân tử RNA
Có ba phương pháp để xác định cấu trúc bậc một của phân tử RNA
a) Thuỷ phân bằng enzim ribonucleaza tuyến tụy, nucleaza T¡, nucleaza U; hoặc các loại nucleaza khác Số oligonucleotit thu được sẽ tiếp tục định tính
bằng phương pháp sắc ký trên cột Phương pháp này đòi hỏi một số lượng mẫu
đủ lớn song lại cho phép định tính được các nucleotit Các tiểu phần thu được sau sắc ký cột đem soi trên máy quang phổ tử ngoại
Cũng có thể dùng phương pháp điện di 2 chiều trên giấy xelluloza - axetat,
trên gel policriamit Số lượng mẫu khi dùng phương pháp này cần ít song phân
tử RNA ở đây phải được đánh dấu bằng ””P, kỹ thuật đánh dấu rất dé dàng với vi
khuẩn, song với động vật bậc cao thì quả là một vấn để phức tạp Phân tử RNA sau khi được đánh dấu, dùng kỹ thuật thuỷ phân một phần hay tồn phần, sau đó
Trang 11dùng dung dịch thuỷ phân để đưa vào điện di hai chiều Những mach
oligonucletit ngắn có thể định tính dựa vào vị trí của chúng trên sắc điện di đồ
b) Phương pháp dùng 32p đánh dấu ở đâu cacbon 5' để xác định thứ tự các nucleotit trong những mạch polinucleotit có độ dài vừa phải hoặc phân tử tRNA
Trước tiên đánh dấu phân tử RNA nhờ enzim polinucleotitkinaza và ATP có
3*'Py, sau đó dùng RNaza tuyến tuy, nucleaza Tạ hay U;¿ thuỷ phân, sau đó dùng
dung dịch thuỷ phân để chạy điện di trên gel poliacrilamit để định tính các
nucleotit
c) Dùng một sợi RNA tổng hợp từ virut in vitro làm mẫu, dùng 4 loại
nucleotit có đánh dấu để theo dõi thứ tự của chúng trong quá trình sinh tổng hợp
sợi bổ sung
3 Xác định thứ tự các nucleotit trong phân tử DNA
Về nguyên tắc cũ¿:g tương tự như việc xác định thứ tự các nucleotit trong
RNA Điều khác nhau ìà, với những đoạn ngắn RNA người ta dùng các enzim để
phân cắt Còn với :hững đoạn ngắn DNA người ta dùng thuỷ phân bằng hoá
chất Những đoạn ngắn này thu được do dùng enzim endonucleaza hạn chế để
cắt các phân tử DNA Những đoạn ngắn DNA được đánh dấu bằng *?P, sau đó
được tiến hành với 4 phản ứng hoá học sau :
- Xử lý với dimethilsunfat, dưới tác động của nhiệt, phân tử guanin tách
khỏi mạch polinucleotit, ta nhận được những đoạn nucleotit có điểm tận cùng của mạch là G
- Xử lý với dimethilsunfat trong mối trường axit làm các gốc purin tạo ra những đoạn nueleotit có tận cùng trong mạch là A và G So sánh với những đoạn xử lý theo phương pháp trước để biết thứ tự các nucleotit có tận cùng A tiếp đến G
- Xử lý với hydrazin trong môi trường NaCl 1M cho phép xác định những
đoạn nucleotit kết thúc bằng C
- Xử lý với hydrazin (không trong môi trường muối) cho phép cắt những
đoạn có tận cùng bằng C và T So sánh với kết quả cất theo phương pháp trên cho phép định vị cho T
Sản phẩm của 4 phản ứng trên sẽ được phân tích bằng điện di để tách các
đoạn nueleotit khác nhau tuỳ theo kích thước của chúng Những đoạn càng ngắn
Trang 12VI CAU TRUC BAC HAI CUA DNA
Rất nhiều quan sát trên dung dịch DNA nhận thấy rằng, phân tử DNA sau
khi tách khỏi tế bào có cấu trúc hình như khác với cấu trúc vốn có của nó trong
nhân tế bào Sau khi xử lý nhiệt, phân tử DNA có cấu trúc một sợi đơn giản Rất
có thể phân tử DNA phải có cấu trúc bậc hai
Các loại DNA
Khoảng cách các gốc kiểm
cho một t
Chiều dài một tur helic
Hình thái Ngắn và rộng | Dài hơn và | Dài và mảnh
` mảnh hơn
Năm 1953 hai nhà khoa học người Mỹ là Crick và Watson đã đề xuất một mơ hình cấu trúc bậc hai của phân tử DNA có tính đến tất cả những tính chất của nó
Hai ông đã dựa vào những kết quả nghiên cứu nhiều năm trước đó của các
nhà khoa học như :
- Kết quả phân tích số lượng gốc nitơ cho thấy Trong phân tử DNA có : Số lượng ademin = Số lượng thimin
Số lượng guanin = Số lượng xitosin
A G Do dé: == =1 T Cc Tổng các gốc purin bằng tổng số các gốc pirimidin : (A+G)=(C+T) „ A+T | ;
Song tỷ lệ Gic thì rất khác nhau ở những phân tử DNA khác nhau, nó đặc trưng cho lồi, nó lớn hơn 1 khi phân tử DNA giàu A + T, và nhỏ hơn 1 khi
phân tử giàu G + C
- Wilkins dùng tia X để nghiên cứu phân tử DNA đã đi đến kết luận rằng `
phân tử DNA có cấu trúc hình xoắn (helic)
Trang 13
Hinh 11.1 So 6 cau tric DNA
- Kết quả thực nghiệm cho thấy mạch polidesoxirinucleotit được duy trì nhờ có mối liên kết
hydro
Từ những kết quả trên
Crick va Watson đã cho rằng
phân tử DNA được cấu tạo từ
hai mạch polidesoxinucleotit quấn quanh nhau tạo thành một
hình xoắn kép
Các gốc nitơ nằm trên một
mặt phẳng vng góc với trục
của hình xốn Khoảng cách
giữa các gốc nitơ trong cùng
một mạch là 3,4A° Một bước xoắn có chiều dài là 34A”
Những gốc nita cha hai sợi liên kết với nhau bằng mối liên kết hydro Giữa A và T là hai
mối liên kết, giữa G và C là ba
mối liên kết hydro Nhờ số
lượng lớn mối liên kết như vậy làm cho phân tử DNA có cấu
trúc hình xoắn vững chắc, nhờ
các gốc nitơ đối nhau là adenin
với thimin, guanin với xitosin
A G
Trên mơ hình này có thể hiểu được tại sao ` 1
cũng đi theo chiều ngược lại
C
Vì rằng nếu phân tử Adenin có trong mạch này thì địi hỏi phân tử
thimin ở kia, tương tự như vậy với guamin và xitosin Thứ tự các gốc nitơ
Trang 143
Cấu trúc phan tit DNA bao gồm 2 sợi xoắn vào nhau theo mơ hình của Crick và Watson ngày nay tìm thấy ở thực khuẩn thể (bacteriophage), vi khuẩn, động
vật và thực vật Tuy nhiên cũng có những ngoại lệ, ví dụ, vào năm 1959
Sinsheimer tìm thấy phân tử DNA của bacteriophage _ (X174 chỉ bao gồm có
một sợi xốn Khi thâm nhập vào tế bào vi khuẩn DNA của @X174 mới tiến
hành nhân đôi (replication) thành phân tử DNA bao gồm 2 sợi xoắn
Một số virut có phân tử DNA chỉ gồm một mạch polinucleotit trong
một phần chu kỳ tồn tại của nó
Năm 1959, R Sinsheimer phat hiện ra rằng phân tử DNA của bacteriophage
@XI174 chỉ bao gồm có một mạch polinucleotit Các thực nghiệm đưa đến kết
luận :
- Tỷ lệ giữa các gốc nitơ DNA $¿X174 không tuân theo quy luật [A]=[T] và [G]=[C]
- Độ nhớt của dung dịch DNA @X174 kém hon dung dich DNA cia E.coli
cùng nồng độ
Trang 15- Nhóm amin của các gốc nitơ trong phan tu DNA X174 dễ dàng tác dung
với formaldehit, trong khi đó tro¡g phân
tử DNA có cấu trúc hình xoắn kép đều
khơng có phản ứng formaldehit
Tuy vậy phan ti DNA 9X174 chi t6n
tại dạng một mạch trong một giai đoạn
nhất định trong chu kù tồn tại của nó Khi thâm nhập E coli, nó lại có cấu trúc hai mạch xoắn Kết quả này càng làm tăng sự
đúng đắn của mơ hình Crick và Watson
Hình 11.2 Anh chụp qua kính hiển vi điện
tử phân tử DNA của phage ^ Phân tử DNA thường rất dài
Phân tử DNA thường rất dài ví dụ : chromosom của E.coli chỉ bao gồm một phân tử DNA có 4 triệu cặp gốc kiểm, phân tử lượng bằng 2,6 x 10”, chiều dài hình vịng là 14 x 10°A°, đường kính
20A°
B Zimm tìm thấy chromosom của loại ruồi đấm Drosophila melanogaster bao gồm mội phân tử DNA có chiều dài vòng là 2,1 em với 6,2 x 10” cặp gốc
nitơ Phân tử DNA của một sé vi khuẩn có thể trực tiếp nhìn thấy bang mat qua
kính hiển vi điện tử
Bảng ¡1 2 : Kích thước các phân tử DNA
Sinh vật Cặp gốc kiểm Chiều dài vịng
(nghìn cặp) (um) Virut Polioma $1 1,7 Bacterio phage A 48,6 17 Bacterio phage T; 166 56 Vi khuẩn Micoplasma 760 260 E.coli 4.000 1.360 Nhóm lÈucarytcs Nấm men 13.500 4.600 Drosophila 165.000 56.000 Người 2.900.000 990.000
1 Kilobaza = 1000 cap gốc nitơ của phân tử có mạch xoắn kép hoặc 1000
gốc kiểm của phân tử có một mạch polinucleotit
Trang 161 Kilobaza của phân tử DNA có mạch xoắn kếp có chiều dai 0,34j1m va khối lượng khoảng 660 Kdal
Quá trình xoắn, tở, thuận nghịch của phân tử DNA
Hai mạch xuắn của phân tử DNA dễ dàng tách nhau ra khi các mối liên kết
hydro giữa, các gốc nitơ bộ đứt ra Điều đó có thể thực hiện bằng cách làm Rồng
dung dịch DNA hoặc bổ sung axit hoặc kiểm để ion hoá gốc nitơ của chúng Ở
một nhiệt độ nhất định, hai mạch xoắn của phân tử DNA đột nhiên tở khỏi nhau ra Nhiệt độ này thay đổi tuỳ thuộc vào từng loại DNA và gọi là nhiệt độ tở (Melting temperature) Tm Sự tở của phân tử DNA có thể đo được trên máy quang phổ tử ngoại ở bước sóng 260nm
[GC] = 35% 50% 66% 14 1.3 41.2 44 Độ hấp thu Sợi xoắn kép 85 (0c) 220 260 300 Nhiét dé (°C)
Hình 7 T.3 Đường cong nhiệt độ to
của shin th ak so Hình 11.4 Chiéu dai buéc song (nm)
Nhiệt độ tở của phân tử DNA phụ thuộc rất lớn vào thành phần gốc nitơ của
chúng Những phân tử chứa nhiều GC có Tm cao hơn những phân tử chứa nhiều AT Tm của phân tử DNA của nhiều loài khác nhau thay đổi tỷ lệ thuận với hàm
lượng GC, có thể đạt 77 đến 100°C khi lượng GC tang tir 20% dén 78% Cap GC liên kết bằng 3 mối liên kết hydro do đó bền vững hơn cặp AT chỉ bằng 2
mối liên kết hydro
Trong cơ thể dưới tác động của một số loại protein phân tử DNA cũng bị tở ra
Hai mạch của DNA tách nhau ra khi nhiệt độ cao, khi nhiệt độ xuống thấp hơn Tm, hai mạch lại tái kết hợp với nhau
Trang 17Một số DNA có phân tử là một vịng khép kín hay vịng xoắn cuộn
Qua kính hiển vi điện tử người ta
nhận thấy có một số DNA có hình vịng khép kín
Một số chromosom của E.coli cũng có hình vịng khép kín gấp hàng nghìn
lần đường kính của vi khuẩn
Khơng phải tất cả các loại DNA đều
có cấu tạo vịng khép kín Ví dụ DNA
của bacteriophage T; có hình một mạch
thẳng DNA của bacteriophage ^ có thể chuyển đổi từ dạng thẳng sang dạng
vòng khép kín ,
Phân tử DNA cịn có thể có cấu tạo xoắn vào nhau Nhờ cấu trúc này làm
cho nó thêm vững bền Cho đến ngày nay người ta phân biệt có 3 loại DNA :
Hình 11.5 Vịng khép kín (trên) và vịng xoắn
cuộn (dưới) của một số phantir DNA
A-DNA, 2 mạch xoắn phải của nó
có chứa l1 cặp gốc nitơ cho một chu kỳ xoắn, có độ nghiêng 20 độ so với trục thẳng đứng của phân tử DNA Nó hình thành do quá trình khử bớt nước của
dang B-DNA
B-DNA, 2 mach xoắn phải của nó mang đúng mơ hình kinh điển của Crick
và Watson Một chu kỳ xoắn chứa 10 cặp gốc nitơ có mặt phẳng vng góc với
trục của phân tử DÑA
Z-DNA Khác với hai loại trên, nó có cấu trúc hai mạch xoắn trái Mỗi chu kỳ xoắn chứa 12 cặp gốc nitơ Mơ hình này do A Rich cùng các cộng sự phát
hiện dựa trên các nghiên cứu về cấu trúc tinh thể của d (CG) 3'
VII VAI TRÒ LƯU GIỮ MẬT MÃ DI TRUYỀN CỦA PHÂN TỬDNA
Đã từ lâu người ta đã tìm hiểu về vai trò của phân tử DNA, liên quan đến
việc lưu giữ các mật mã di truyền và phát hiện ra rằng :
1 Đối với các cơ thể bậc cao, có một mối tương quan giữa số lượng DNA chứa trong tế bào với số lượng thông tin di truyền Mặt khác số lượng DNA trong nhân của tế bào cơ thể thường là nhị bội thể 2n, còn tế bào sinh dục là đơn bội In
Trang 182 Người ta quan sát thấy rằng thứ tự các gốc nitơ trong phân tử DNA của
thế hệ con thường khá đồng nhất với thứ tự gốc nitơ trong phân tử DNA của bố
mẹ chúng Việc này có thể chứng minh được bằng kỹ thuật lai
3 Những tác nhân vật lý, hoá học gây đột biến thường là gây sự biến đổi
phân tử DNA
4 Với vi sinh vật, người ta ghi nhận rằng phân tử DNA cho phép vận
chuyển một hoặc nhiều tính trạng di truyền
- Chuyển giao một tính trạng (Transformation) Người ta bổ sung phân tử DNA lay từ vi khuẩn kháng streptomixin vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn mẫn
cảm với kháng sinh, sau một thời gian nhất định thấy xuất hiện thế hệ vi khuẩn
kháng streptomixin Tính trạng này đã được nhận từ phân tử DNA bổ sung vào môi trường
- Chuyển giao nhiều tình trạng (Transduction) ví dụ DNA của bacteriophage
khi thâm nhập tế bào vi khuẩn sẽ chuyển giao toàn bộ những tính trạng của nó để biến DNA của vi khuẩn thành DNA của bacteriophage và tiêu diệt vi khuẩn
- Kết giao (conjugaison) đó là sự kết giao trực tiếp giữa hai tế bào vi khuẩn, tế bào thứ nhất có thể chuyển hố một phần hay toàn bộ chromosom sang tế bào thứ hai Người ta ghi nhận rằng có mối tương quan giữa số lượng DNA từ tế bào cho chuyển sang tế bào nhận với số lượng các tình trạng chuyển giao
5 Thí nghiệm trên vi khuẩn pneumococci :
Vi khuẩn pneumococci đóng vai trò quan trọng trong việc xác định vai trò
lưu giữ mật mã di truyền của phân tử DNA Bình thường pneumococci có một lớp vỏ bọc cấu tạo từ polisacarit Chính lớp vỏ bọc này mang độc tính và gây ra
bệnh viêm phổi ở người và động vật có vú
COO- CH,OH coo" ‘HOH
O 5
4 Tứ eo f O H
H H :
Gốc glucoronat Gốc glucoza Gốc glucoronat Gốc glucoza
Người ta đã tạo được một loại pneumococci khơng có vỏ bọc polisacarit
bằng con đường gây đột biến Loại đột biến này khơng gây độc tính Loại vi
khudn pneumococci (P) binh thường có khuẩn lạc trơn nhẫn ký hiệu là § Loại P
đột biến có khuẩn lạc xù xì được ký hiệu là R Vi khuẩn P đột biến không có
enzim dehydrogenaza để chuyển hoá UDP-glucose thành UDP-glucoronate
Trang 19Enzim này cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp lớp vỏ bọc polisacarit có cấu trúc gồm các gốc glucoza và glucoronate luân chuyển nhau
Năm 1928, Fred Griffith phát hiện ra rằng, chủng R khơng độc tính có thể chuyển thành chủng § mang độc tính bằng cách sau :
Ông đã tiêm chuột theo sơ đồ : Lol R sống + S đã dùng nhiệt làm chết Lô II Lô II R sống S - đã dùng nhiệt làm chết
Lô I: Tiêm chủng S đã làm chết bằng nhiệt trộn lẫn với chủng R sống Lô II : Tiêm chủng R sống
Lô II : Tiêm chủng S đã làm chết bằng nhiệt
Kết quả cho thấy chuột ở lô I chết hồn tồn, cịn chuột ở lô II và II còn
sống 100% 7
Trong máu của chuột chết người ta tìm thấy chủng S sống như vậy là trình trạng gây bệnh của chủng S đã là chết bằng nhiệt được chuyển giao sang chủng
R sống Sau này người ta tìm thấy ra khả năng chuyển giao tính trạng có thể
Hinh 11.6
Hinh ảnh chủng R (khuẩn lạc nhỏ)
chuyển thành chủng S (khuẩn lạc lớn)
thực hiện in Vitro Người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy chủng R một số nước chiết từ
định tế bào chủng § đã làm cho một số tế bào
của chủng R chuyển thành chủng S
Năm 1944 O Avery và C Macleod đã tiến
hành nghiên cứu làm cho chủng R chuyển thành
chủng S Các tác giả đã đi đến những kết luận :
- Chất chiết xuất từ nhân tế bào sau khi làm sạch, xác định thành phần hoá học các
nguyên tố cấu thành nó cho thấy giống hệt như thành phần của DNA
- Các tính chất vật lý, hố học chất chiết
xuất từ nhân tế bào chủng § giống với DNA - Dịch chiết xuất bao gồm protein và lipit
khơng mang hoạt tính
- Xử lý dịnh chiết xuất từ nhân bằng trypsin chymotrypsin không làm nó mất hoạt
tính
- Xử lý bằng ribonucleaza cũng khơng làm
mất hoạt tính
Trang 20
- Xử lý bằng desoxiribonucleaza làm mất hồn tồn hoạt tính
Từ đó đi đến kết luận, chất chiết xuất từ nhân tế bào chủng S có thể làm cho
chủng R biến thành chủng § chính là DNA
Cơng trình nghiên cứu này đã mở ra cho sinh hoá học một hướng phát triển mới lầm cơ sở cho công nghệ gen sau này Cho đến năm 1944 người ta đều cho
rằng chính protein trong chromosom mang những thơng tin di truyền cịn DNA
đóng vai trị thứ yếu
6 Năm 1951 R Herriot cho rằng, một bacteriophage có cấu trúc như một cái kim với phần đuôi rất to, bên trong chứa DNA, bên ngoài được bao bọc bằng một màng protein Đầu nhọn của nó cắm vào tế bào vi khuẩn, nhờ có các enzim giúp hoà tan màng tế bào để tạo thành một lỗ hổng, sau đó tồn bộ phần bên trong của virut thâm nhập vào bên trong tế bào chứ không phải là bản thân con virut Giả thiết này
được A Hershey và M chase tiến hành thực nghiệm như sau :
- Họ dùng *’P để đánh dấu DNA của phage (bacteriophage) và dùng 355 dé
đánh dấu protein trong vỏ bọc Sự đánh dấu này là rất đặc trưng vì DNA khơng chứa § và protein không chứa P
- Dùng phage đã đánh dấu cho thâm nhập E.coli sau một thời gian ngắn trong tủ ấm
- Dịch nuôi cấy thu được đưa vào ly tâm với
tốc độ 10.000 vòng phút, làm cho các virut tách
khỏi tế bào E.coli đã bị nhiễm
- Tiếp tục cho ly tâm với tốc độ cao hơn
Màng tếbào đến mức toàn bộ các tế bào E coli lắng xuống
dưới đáy ống ly tâm, còn các virut ở lại trong
Hình 1] 7° dịch phía trên Đem phân tích tìm ??P và *°S két
Sơ đồ phage T; chuyển DNA của nó _ quả thu được cho thấy : vào tế bào vi khuẩn & ji
- Hầu hết DNA của phage được tìm thấy
trong vi khuẩn
- Hầu hết protein của phage tìm thấy ở dịch phía trên
Các thí nghiệm tiếp theo cho thấy dưới 1% ”ŠS được chuyển từ phage bố mẹ sang phage thế hệ con cháu Ngược lại có 30% ??P của phage bố mẹ xuất hiện trong thế hệ con cháu
Protein
Trang 21
Chương mười hai
CẤU TRÚC CỦA PHÂN TỬRNA
NH, Xitosin B’ sh Ò- ĐHNZ2 _ NH, | Ny HO-P-0 kN Adenin OH,C E> O OH HO-P=0 Ò
Phân tử RNA chỉ có một mạch dài nucleotit liên kết với nhau theo hướng 3-5” phosphodieste Số lượng nucleotit từ một vài đến hàng nghìn Khác với
DNA, trong phân tử RNA có chứa đường riboza và uraxil thay cho đường
desoxiriboza va thimin trong phân tử
DNA
Uraxil có thể tạo ra với thimin
thành một cặp gốc nitơ
Phân tử RNA chỉ có một mạch ribonucleotit Do đó nó khác với
DNA có hai mạch xoắn Vì vậy số
lượng adenin sẽ khác với uraxil và
guanin khác với xitosin trong hầu
hết các phân tử RNA
Tuy vậy phân tit RNA cé thé tu gấp nó để tạo thành những đoạn xoắn kép Trong những đoạn xoắn
kép đó thì uraxil sẽ tạo thành cặp
với adenin và guamin tạo thành cặp với xitosin hay uraxil Tỷ lệ các đoạn có cấu trúc xoắn kép thì khác nhau trong các loại RNA khác nhau
xs P”-G-G-G-U-G-G-G-A C C C C U C-U-C -G-U-C-C-U G G G G U | Hs ~ 3? NCZ
Một số phân tử RNA của virut có cấu trúc mach xoắn kép nhỏ là phân tử
Trang 22Trong tế bào có chứa năm loai RNA là :
- RNA thông tin (mRNA) - phục vụ làm khuôn mẫu để tổng hợp protein Mỗi một phân tử mRNA có chứa một gen hoặc một nhóm gen để tổng hợp một loại protein Do đó mRNA là một nhóm các chất rất khác nhau Trong tế bào
E.coli có chứa các mRNA có chiều dài trung bình khoảng 1,2 Kb
- RNA vận chuyển (tRNA) có nhiệm vụ vận chuyển axit amin đã được hoạt hoá
đến ribosom để tổng hợp lên phân tử protein theo mẫu của mRNA Có ít nhất 21 loại tRNA tương ứng với21 loại axit amin khác nhau tRNA bao gồm khoảng 25 nucleotit (25 Kdal) Chúng thuộc nhóm RNA có phân tử lượng nhỏ nhất
- RNA ribosom (rRNA) là thành phần chính của ribosom song vai trị chính
xác của chúng trong quá trình tổng hợp protein chưa hoàn toàn biết rõ Trong tế
bào E.coli có ba loại rRNA gọi là rRNA25S, rRNA16S và rRNA5S Cách phân
loại này là theo hệ số lắng đọng S
Bảng 12.1 : Các RNA trong phân tử E.coli
Loai RNA Số lượng | Hệ sốlắng | Phân tử lượng | Số lượng
theo % đọng (S) (kdal) nucleotit
1) RNA ribosom(rRNA) 80 23 1,2 x 10° 3700
16 0,55 x 10° 1700
5 36x10 | ` 120
2) RNA van chuyén (tRNA)| 15 4 2,5 x 10 75
3) RNA thong tin (mRNA) 5 Rất đa dạng
4) RNA khởi động 5) RNA khác om) x a Š Y LLL Uh
RNA ribosom RNA van chuyén
Hinh 12.1
Trang 23Hệ số lắng đọng của các đại phân tử được tính theo đơn vị Svedberg 1S =
1013 giây Đơn vị này được gọi theo tên của nhà bác học Thuy Điển, người sáng
lập ra ly tâm siêu tốc
Vai trị thơng tin cua MRNA
Năm 1961 lần đầu tiên F Jacob và J Monod đã phát hiện vai trị thơng tin
của mRNA Hai ông nhận thấy rằng protein được tổng hợp trong xitoplasma chứ
không phải trong hạt nhân Mà phân tử DNA lại chứa trong hạt nhân, vậy những
thông tin di truyền mà nó lưu giữ làm thế nào để chuyển vào xitoplasma Hai
nhà khoa học trên đã phỏng đốn rằng phải có những tính chất sau :
1 Chất mang thông tin là một polinucleott
2 Thành phần gốc nitơ (hay gốc kiểm) của chất mang thông tin phải phản ánh được thành phần gốc kiểm của DNA mà nó đặc trưng cho
3 Chất mang thông tin phải đa dạng vì một gen hay một nhóm gen có độ
dày rất khác nhau
4 Chất mang thông tin kết hợp với ribosom ở vị trí diễn ra q trình sinh
tổng hợp protein trong một thời gian ngắn
Š Chất mang thông tin sẽ được tổng hợp và phân giải rất nhanh
Ở thời điểm mà Jacob và Monod đề ra những tiêu chuẩn trên thì khơng có
một phân tử RNA đã biết đáp ứng được Ví dụ rRNA được xem là mẫu tổng hợp
protein thì có kích thước rất thuần nhất, thành phần gốc kiểm tương đối giống nhau ở những sinh vật có tỷ số gốc kiểm khác nhau trong phân tử DNA Mặt
khác rRNA vững bền và nó kết hợp véi 5’
- Ñuorouraxil với tốc độ chậm
RNA vận chuyển thường có phân tử
lượng quá nhỏ và cũng khơng thích ứng với những tiêu chuẩn trên `"
Khi tiến hành cho nhiễm E.coli bằng
phape Tạ, phát hiện thấy RNA mới có đời sống bán phần rất ngắn Thành phần gốc kiểm của nó giống với thành phân gốc kiểm của DNA phage
Giả thuyết đã được chứng minh bằng
thực nghiệm Hình 12.2
Ảnh qua kính hiển vi đện tử : phage T; đang
tấn công tế bảo vi khuẩn E.coli
Trang 24Khi nhiễm E.coli bằng phage Tạ nhận thấy rằng hầu như toàn bộ protein
tổng hợp được sau khi nhiễm đều có đặc tính di truyền thuộc về phage
Sau khi nhiễm xuất hiện một loại RNA có đời sống bán phần ngắn có thành phan nucleotit giéng nhu cua DNA phage
Rõ ràng đây chính là RNA thơng tin (mRNA) vì rằng rRNA và tRNA không
tổng hợp sau khi nhiễm phage T;
Vai trd cha mRNA còn được chứng minh qua các thí nghiệm lai RNA
3? 5’ mach DNA Vào năm 1961, S.SpŸegelman phát
T ~ 2,
GAATGGCTC minh kỹ thuật lai các phân tử axit
nucleic nhằm sáng tổ câu hỏi, liệu các
FEHM41H thứ tự gốc kiểm của mRNA được tổng
hợp sau khi nhiễm phage T; có đối
xứng (theo quy luật ghép đôi các gốc
nitơ) với thứ tạ các gốc kiểm của DNA T;ạ hay không ? Công việc bắt đầu bằng cách nâng nhiệt độ vượt quá
nhiệt độ tở của DNA để tạo thành DNA bao gồm một mạch Những mạch
đơn này lại có thể kết hợp với nhau để tạo thành mạch xoắn kép nếu ta hạ
nhiệt độ từ từ xuống Từ thực nghiệm
này, Spiegelman cho rằng nếu mRNA
có thứ tự các gốc kiểm tương ứng với
DNA thì một mạch mRNA cũng có thể
kết hợp với một mạch DNA để tạo thành một xoắn kép 5 DNA virut Cường độ phóng xạ
Thực nghiệm được tiến hành như
sau :
1 RNA tổng hợp được sau khi nhiễm E.coli bang phage T, (T, mRNA)
được đánh dấu bằng ?P, Tạ DNA được đán dấu bằng °H Hai loại này được
chuẩn bị trong hai thực nghiệm riêng biệt
2 Tr6n T, mRNA va T, DNA tang nhiét độ cao hơn nhiệt độ gây tở sợi xoắn của DNA, thu được dung dịch gồm những mạch đơn DNA va RNA, ha
nhiệt độ xuống khoảng 20-22°C
3 Hỗn hợp đã ]àm lạnh đem đi phân tích bằng ly tâm siêu tốc thu được 3
pic, pic thứ nhất tương ứng với mRNÀ, pic thứ 2 tương ứng với DNA và pic thứ
Trang 253 tương ứng với phân tử lái có cấu trúc xoắn kép song gồm 1 sợi DNA và một
sợi RNA Như vậy là Tạ mRNA tạo thành phân tử lai với Tạ DNA Tạ mRNA không tạo thành phân tử lai với bất cứ một phân tử DNA của vi khuẩn Điều này
đưa đến kết luận quan trọng là m RNA sao chép một cách chính xác những
thơng tin di truyền trên phân tử DNA để tiến hành tổng hợp phân tử protein đặc trưng cho từng cơ thể
Kỹ thuật lai còn phát hiện ra rằng rRNA và tRNA cũng đều được tổng hợp
theo khuôn mẫu của DNA
Các kiểu chuyển thông tin
DNA lưu giữ tất cả các thông tin di truyền của cơ thể sinh vật ngoại trừ một số phage và virut RNA (ví dụ như virut polimielit) ở đây khơng có DNA nên RNA đảm nhiệm vai trị lưu giữ các thơng tin di truyền Rõ ràng là những thông tin này cần được bảo tồn trong quá trình phân chia tế bào Do đó trong quá trình phân chia tế bào sẽ xảy ra quá trình nhân đôi phân tử DNA (duplication hay replication) Một quá trình đồi hỏi các thông tin di truyền trong tế bào mẹ phải được bảo tồn đầy đủ trong các tế bào con
Những thông tin này cho phép tổng hợp các protein đặc chủng theo quy luật
một ger => một mạch polipeptit Tuy nhiên các thông tin không thể chuyển trực
tiếp sang quá trình sinh tổng hợp protein, nó phải được mRNA sac chép RNA thông tin chỉ huy việc lắp ghép các phân tử axit amin để tạo thành phân tử
protein Cho đến ngày nay người ta biết được 5 kiểu vận chuyển thông tin là :
1 Truyền thông tin từ DNA sang DNA, đó lä q trình nhân đôi phân tử DNA nhằm đảm bảo lưu giữ toàn bộ những thông tin di truyền
2 Truyền thông tin từ DNA sang RNA - đó là quá trình sao chép
(transcription) Quá trình này cho phép truyền các thông tin từ phân tử ĐNA sang các phân tử RNA khác nhau
3 Truyền thông tin từ RNA sang protein Đây là quá trình dịch các mật mã di truyền (tranduction) Quá trình này cho phép tổng hợp, các proiein đặc trưng theo đúng những thông tin chứa trong phân tử RNA thông tin
Trong trường hợp virut là một phân tử RNA ta có :
4 Vận chuyển thơng tin tử RNA sang RNA Trong trường hợp này phân tử RNA sẽ đảm nhiệm vai trị làm khn mẫu để tổng hợp RNA của virut (quá trình phát triển của virut) đồng thời làm khuôn mẫu để tổng hợp phân ti RNA
thông tin Phân tử mRNA này sẽ đảm nhiệm việc tổng hợp protein đặc trưng có
Trang 265 Truyền thông tin từ RNA sang DNA Các thông tin chứa trong phân tử RNA
của virut trước tiên phải được vận chuyển sang phân tử DNA của tế bào chủ Từ DNA của tế bào chủ các thông tin sẽ được chuyển cho các phân tử RNA để cuối
cùng có thể thực hiện được các quá trình tổng hợp protein đặc trưng gây bệnh
Ảnh kính hiển vi điện tử quá trình sao chép (transcription) của phân tử RNA
Trang 27Chuong mudi ba
SINH TONG HOP DNA
Theo mơ hình của Crick va Watson, phân tử DNA gồm 2 mạch nucleotit
quấn vào nhau Vậy q trình nhân đơi (Replication) DNA sẽ phải xảy ra như
thế nào ? Mỗi một mắt xích nucleotit của phân tử DNA mẫu phải được một
nucleotit đối xứng nhận biết trước khi nó được tham gia vào quá trình hình thành một mạch polinucieotit Với mục đích đó phân tử DNA phải được tở ra
(hay mở ra) ít nhất là một đoạn một cách tạm thời để có thể kết hợp với các
mạch polinucleotit đối xứng qua mối liên kết hydro theo sơ đồ sau :
NHÂN ĐÔI DNA THEO PHƯƠNG THỨC BÁN BẢO THỦ (Replication semiconservative)
Watson va Crick cho rang, phan tử DNA mới tạo ra có một mạch
polinucleotit là được tổng hợp mới hoàn toàn, các mạch kia nó sẽ nhận được từ
tế bào mẹ Phương thức này gọi là q trình nhân đơi bán bảo thủ
Cũng có thể giả thiết rằng hai sợi mạch polinucleotit của phân tử DNA mẹ
tách ra làm mẫu để tổng hợp hai mạch polinucleotit con, sau đó nó lại phối hợp
lại với nhau Trong số hai DNA con tạo ra sẽ có một DNA vẫn giữ nguyên 2 mạch polinucleotit của phân tử mẹ và một phân tử mới hoàn toàn
Meselson và Stahl đã tiến hành thực nghiệm để tìm xem DNA đã nhân đôi theo phương thức nào
Hai ông đã nuôi cấy E.coli trong nhiều thế hệ trên mơi trường có !”NH„CI
như là nguồn nitơ duy nhất đạt đến mức độ toàn bộ DNA tạo ra đều có chứa '”N
Ở thời điểm đó (gọi là thời điểm O) đem toàn bộ khuẩn lạc cấy truyền trên môi
Trang 28DNA ra cho vào ly tâm trong dung dịch clorua xeri Kỹ thuật này cho phép tách
các phân tử DNA có phân tử lượng khác nhau Phân tử càng nặng sẽ càng chuyển về vị trí gần với đáy ống nghiệm hơn Kết quả thu được cho thấy :
- Ở thời điểm O ứng với thế hệ O chỉ thu được một băng tương ứng với DNA năng (chứa 'ÝN)
- Tiếp tục lai thế hệ nuôi cấy trên môi trường chỉ có chứa l*N, thấy xu hiện một băng nằm ở giữa DNA nặng và DNA nhẹ Điều đó có nghĩa là phân tử
DNA mới tạo ra được cấu tạo từ một mạch DNA nặng và một mạch DNA nhẹ mới tạo ra
e = ` ` }
Nhân đôi bán bảo thủ Nhân đơi bảo thủ
Hình 13.1
Tiếp tục đến thế hệ thứ hai trong mơi trường có chứa '*N, thấy xuất hiện hai
băng có độ đậm bằng nhau, một trong hai băng tương ứng với phân tử DNA lai (DNA được cấu tạo từ một mạch nặng và một mạch nhẹ), còn phân tử DNA kia tương ứng với loại DNA nhẹ (tức là được cấu tạo từ hai mạch polinucleotit có
chứa 'ÝN)
Kết quả nghiên cứu này chứng tỏ quá trình nhân đôi của phân tử DNA xây
ra theo phương thức bán bảo thủ
Trang 29Thế hệ 07 “hại “ dã 1,0 : ™ 1,1 1,5 1,9 : Thế hệ thứ nhất 25 3,0 A Dong Hỗn hợp thế hệ J 0va 1,9 ; Hỗn hợp thế hệ 0và4,1 Hình 13.2 »§
Ly tâm siêu tốc phân tử DNA trong quá trình nhân đơi (replication) vị trí các băng DNA phụ thuộc vào
thành phần ' N hay 'ẨN của nó Sự phân ly các băng
ua các thế hệ 5 ss
hao Meselson va Stahl) Sơ đồ quá trình nhân đôi bán bảo thủ cea erat
của phân tử DNA (theo Meselson va Stahl)
Các mạch của DNA mẹ
Thế hệ thứ hai
Trang 30đó các enzim DNA polimeraza cịn tìm thấy trong các dịch chiết vi khuẩn, các dịch chiết từ động vật và thực vật
Vào năm 1969 hai nhà khoa học là Delucia và Cairns đã tìm thấy DNA
polimeraza II và III Hai enzim này cùng được các phịng thí nghiệm khác phân
lập, sau khi nghiên cứu các tính chất, người ta thấy nó giống với polimeraza Ï ở
một vài tính chất :
, - Để tổng hợp phân tử DNA từ desoxiribnueleosit triphosphat cũng cần phải
có phân tử DNA làm mẫu
- Quá trình tổng hợp cũng bắt đầu từ nhóm 3'-OH tự do - Quá trình tổng hợp cũng theo hướng Š' — 3'
- Chúng có hoạt tính 3" —> 5' exonucleaza, DNA polimeraza III còn có hoạt
tính 5' —> 3' exonucleaza ,
Polimeraza II va III có thể hoạt động tối ưu trên hai mạch của phân tử DNA
làm mẫu Polimeraza III còn liên kết với một số protein khác khi nó thể hiện các
hoạt tính về sinh lý ; £
Những nghiên cứu về sinh hoá học và di truyền học gin đây cho thấy có
khoảng hơn 10 loại protein cần được bổ sung cho DNA polimeraza I và III, để có thể tiến hành nhân đôi DNA trong tế bào E.coli
Để cho DNA polimeraza hoạt động nó cân một phân tử DNA làm mơ hình
Cơ chất cho ‹q trình trùng hợp nhất thiết phải là 2'-Desoxiribonucleosit - 5'- triphosphat Enzim DNA polimeraza làm nhiệm vụ xúc tác cho quá trình trùng
hợp mạch polidesoxiribonucleotit theo hướng 5' —> 3! :
Người ta nhận xét rằng :
1 Mối liên kết phosphodieste tạo ra giữa nhóm 3'OH với nhóm 5'-phosphat
của nucleotit được gắn vào Mạch polinucleotit nhờ đó được kéo dài ra và được
gọi là đoạn bắt đầu
2: Mỗi một phân tử desoxiribonucleotit được gắn vào mạch mới thì hoàn
toàn phụ thuộc vào cấu trúc của mạch mẫu DNA Người ta còn gọi là mạch mẫu (tiếng Anh là "template")
Suy ra rằng enzim DNA polimeraza chỉ có thể tổng hợp phân tử DNA theo
một mẫu đã có trước
Quá trình trùng hợp xảy ra theo huéng 5’ > 3 Enzim DNA polimeraza xúc tác phản ứng sau :
Trang 31DNA, Mg**
(dNMP),+dNTP ——————— => (đNMP)ạ,,¡ + PPi
Enzim
- dNMP = Desoxiribonucleosit - 5'-monophosphat - PPi = Pirophosphat vô cơ
- dNTP = 2'-desoxiribonucleosit - 5' triphosphat
A Cc A C
OH PR `” XP | ‘OH
P P PP wP of
Enzim này có hai cơ chất : một là phân tử làm mẫu có nhóm 3'OH, cơ chất
kia nhất thiết phải là desoxiribonucleosit-5'-triphosphat — ~
Để xác định thứ tự các nucleotit được đưa vào tổng hợp, người ta tiến hành đưa vào phản ứng trùng hợp 4dTNP, một trong số đó được đánh dấu ở vị trí œ
của nhóm phosphat bằng ”?P
Kết thúc phản ứng người ta thu được phân tử DNA Đem phân tử này thuỷ
phân bằng enzim cuối cùng thu được các phân tử desoxiribonucleosit 3'-
monophosphat Người ta xác định thấy rằng ??P được gắn vào phân tử DNA ở vị
trí 5' của một nucleosit bên cạnh
A P 3° Ne OH x P „; II P P
Thuỷ phân DNA mới tạo ra sau khi tổng hợp từ dNTP đánh dấu
Trang 32Người ta tách bốn loại desoxiribonucleosit-3' monophosphat, tiến hành xác
định độ phóng xạ, người ta có thể xác định được thứ tự các gốc nitơ
Từ những phân tích này cho phép đi đến một số kết luận sau :
- Thứ tự các gốc kiểm của mạch DNA mới tạo ra thì giống hệt với mạch đối
xứng của phân tử DNA mẫu
- Độ phân cực của mạch mới tạo ra thì ngược với mạch mẫu
Các giai đoạn của quá trình nhân đơi (replication)
Q trình nhân đơi phân tử DNA có thể chia làm ba giai đoạn :
Giai đoạn bắt đầu, giai đoạn kéo dài và giai đoạn kết thúc 1- Giai đoạn bắt đầu
Như đã trình bàyở trên enzim DNA polimeraza chỉ có thể tổng hợp DNA theo một mẫu có sắn Điểm khởi đầu của q trình nhân đơi thường là chính xác
trong phân tử DNA mẫu Phân tử DNA làm mẫu trước tiên hai sợi xoắn của nó phải tở ra để cho giai đoạn bắt đầu có thể tiến hành
Nhóm 3'-OH có thể được cung cấp theo các phương thức khác nhau Trong phần lớn các trường hợp, một mạch DNA tự uốn cong lại Trường hợp thứ hai là
một mạch của DNA sẽ cung cấp 3'-OH để tổng hợp mạch kia
(2), Tê 5, v° 3 | 5’ ý LH # 3 5 a PET 5 › 3 Ppa s
a) Mach đơn DNA tự cong lại tạo thành điểm b) Mạch đơn DNA với đoạn khởi động RNA
khởi động 2- Giai đoạn kéo dai
Như trên đã nêu hai mạch của phân tử DNA có độ phân cựu ngược nhau Quá trình kéo dài được tiến hành theo hướng 5' — 3' Điều đó có nghĩa là quá trình trùng hợp để tạo thành phân tử DNA theo hướng 5' —> 3" là liên tục nhưng theo một thứ tự đối kháng với mạch DNA làm mẫu
Để chứng minh cho giả thuyết trên nhóm khoa học do ông Okazaki đã tiến
hành thí nghiệm bổ sung desoxitimidin dưới dạng một hợp chất có độ phóng xạ
Trang 33cao để đánh dấu phân tử DNA mới tổng hợp Bằng phương pháp này đã phát
hiện ra rằng phân tử DNA mới tổng hợp dưới dạng mạch nucleotit có số lượng từ 1000 đến 2000 gốc (người ta còn gọi là đoạn Okazaki) Những đoạn này ai liên kết với nhau tạo thành một mạch dài theo hướng 5' —> 3' Đối với những tế bào ơcariot chiều dài của đoạn Okazaki thường rất ngắn, từ 100 đến 200 nucleotit
Quá trình sinh tổng hợp phân tử DNA được tiến hành theo phương thức như
đã nói ở phần trên Trước tiên hai mạch DNA tở ra tạo thành một cái chạc ba
(tiếng Anh gọi là replication fork) Hai mạch của phân tử DNA mẹ được dùng
để tổng hợp phân tử DNA mới
3’ mach trước Chạc ba 5 DNAme ÿ a, DNA me sy CU a 5° 4 ~ 3 " se oS i Se Dos Okan NI 3° “Ne Sy 5 ' 3? mạch chậm
Như đã biết, hai mạch của phân tử DNA mẹ có thành phần gốc nitơ đối ngược nhau Hướng tổng hợp DNA sẽ là 5'—› 3' đối với phan tit DNA con và có thể là hướng 3' -> 5' cho phân tử DNA con khác Song tất cả những DNA polimeraza đã biết chỉ tổng hợp phân tử DNA theo hướng 5' —> 3' mà không theo hướng 3' > 5' Vay thi phân tử DNA con xuất hiện theo hướng 3' —> 5` thực hiện
được bằng cách nào?
Câu hỏi này đã được nhà khoa học Okazaki giải quyết bằng các thực nghiệm của mình Ơng đã tìm thấy rằng phần lớn phân tử DNA được tổng hợp từ những
đoạn nucleotit ; mỗi đoạn này bao gồm khoảng 1000 nucleotit (người ta gọi là đoạn Okazaki) có mặt trong vùng chạc ba Ở đây những đoạn này được DNA ligase nối với nhau để tạo thành mạch DNA con Mạch bên kia được tổng hợp
một cách liên tục Mạch được tổng hợp từ các đoạn Okazaki được gọi là mạch
chậm (tiếng Anh gọi là lagging strand) Còn mạch kia được tổng hợp liên tục và
được gọi là mạch trước (tiếng Anh gọi là leading strand) Cả hai mạch Okazaki
va mạch dẫn đầu đều được tổng hợp theo hướng 5' -› 3'
Quá trình sinh tổng hợp DNA được bắt đầu từ RNA Như đã biết DNA polimeraza đồi hỏi phải có nhóm 3'-OH tự do để có thể bắt đầu tổng hợp DNA
Trang 34đầu tổng hợp DNA Phát hiện này giả thiết rằng chính phân tử RNA mới có thể
khởi đâu cho quá trình tổng hợp DNA, vì rằng RNA polimeraza có thể bắt đầu
môt mạch mới Tiếp theo người ta phát hiện ra rằng phân tử DNA mới tạo ra có thể liên kết đồng hố trị với một đoạn ngắn đã được kéo dài của RNA, chính
đoạn này được dùng làm điểm khởi đầu cho quá trình tổng hợp DNA
Như vậy là chính RNA đã khởi đầu cho quá trình tổng hợp DNA
Trong tế bào E coli, quá trình nhân đơi DNA xảy ra như sau :
1 Một enzim đặc trưng RNA polimeraza (gọi là primaza) tổng hợp một
đoạn ngắn kéo dài của RNA (khoảng 10 nucleotit), đoạn này tổng hợp theo mạch DNA làm mẫu Khác với DNA polimeraza, primaza khơng địi hỏi điểm
khởi đầu để tiến hành tổng hợp mạch polinucleotit
2 Nhóm 3'-OH ở đầu mạch ribonucleotit của mạch RNA sẽ làm nhiệm vụ là
điểm khởi đầu cho quá trình tổng hợp cho mạch DNA mới với sự xúc tác của
DNA polimeraza III
3 Đoạn RNA có trong thành phần phân tử lai RNA-DNA sẽ được thuỷ phân bởi enzim DNA polimeraza I
4 Đoạn RNA có trong phân tử DNA sẽ được loại trừ Phần thiếu hụt tạo ra sẽ được DNA polimeraza I hoàn tất Quá trình này diễn ra một cách rất dễ dàng
vì có mạch DNA làm mẫu
Những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng tác động của primaza được tiến hành cùng với sự hình thành của chất trung gian trước khởi động (tiếng Anh gọi là prepriming intermediate) Chất này bao gồm ít nhất khoảng 5 loại protein Một trong số protein đó là dnaB protein DnaB protein làm nhiệm vụ nhận biết
tín hiệu bắt đầu cho quá trình tổng hợp của primaza
DNA làm mẫu ld 5° 3' — - “ S’ oars 3” Hình 13.4: Sinh tổng hợp DNA
A Primaza tổng hợp một đoạn ngắn RNA
B Đoạn RNA làm nhiệm vụ khởi đầu téng hop DNA
€ Đoạn RNA bị loại bỏ và trên chỗ của nó lại tổng hợp tiếp DNA
Trang 35"3 - Giai đoạn kết thức
Các nghiên cứu về quá trình tổng hợp DNA trước tiên tập trung vào giai đoạn kéo đài phân tử DNA và gân đây nhất là giai đoạn khởi động, chính giai đoạn này đã cho phép điều chỉnh các quá trình trong tế bào Người ta cịn biết
rất ít về sự kết thúc của quá trình nhân đơi phân tử DNA
Hai vấn đề quan trọng được đặt ra là :
- Q trình nhân đơi được kết thúc như thế nào ? Tại sao quá trình nhân đơi khơng tiếp tục ? Tại sao phân tử DNA mới được tổng hợp không được dùng làm
mô hình để tổng hợp phân tử DNA mới ?
- Nếu như phân tử DNA là một gen thắng hoặc là một gen hình vịng thì
việc kết thúc có thể hiểu được một cách dễ dàng là khi phân tử DNA con đã sao
chép đầy đủ các thông tin của DNA mẹ
Tính trung thực của q trình nhân đơi phân tử DNA
Phân tử DNA lưu giữ tất cả các thông tin di truyền Những thông tin di truyền này phải được lưu trữ và chuyển giao cho thế hệ con Có nghĩa là
phan ti DNA mới tổng hợp phải sao chép một cách chính xác các thơng tin
di truyền của phân tử DNA mẹ Nói một cách khác, q trình nhân đơi phân
tử DNA phải rất trung thực và không được phạm một sai sót nào Một khi có
sự sai sót xảy ra thì nó phải được phát hiện bởi những hệ thống sửa chữa Song một điều khó ở đây là sự phân biệt giữa mạch nguồn thơng tin chính
xác với mạch nguồn thông tin sai Vì vậy ở thời điểm tổng hợp phân tử DNA
cần có hoạt tính sửa chữa
1 Hoạt tính sửa chữa của DNA polimeraza
Như ta đã biết bộ gen của E coli bao gồm 4 x 10° cặp gốc kiểm, tỷ lê sai sót chấp nhận được cho mỗi một lần nhân đôi là một gốc kiểm trên 10° hoặc 107,
Cơ chế sửa chữa đã được nghiên cứu khá kỹ càng đối với E.coli Cơ sở của nó là các enzim DNA polimeraza cần đồng thời một lúc phân tử DNA
làm mẫu cũng như là điểm khởi đầu Ví dụ một gốc dưới dạng enol được gắn vào mạch polinucleotit, một gốc tiếp theo lại dưới dạng sêtô làm cho DNA polimeraza không thể xúc tác cho quá trình tạo lập liên kết phosphodieste
với một nucleotit tiếp theo Nghĩa là quá trình tổng hợp sẽ bị dừng lại Đối
với những sinh vật ơcariot sự trưởng thành trong quá trình nhân đơi càng địi
Trang 36} g Mạch chậm kh Parental DNA ae 3' - (Lagging strand)
AS Mạch trước 5° | ` 5'— (Leading strand) 3 3’ Doan Okazaki 3 “ (Okazaki fragment) a“ F x DNA mẫu | No , 3 (DNA template) 5° 5! Replication fork : a A 7 , 5 ‘ 5” eeeeesee 3 he RNA Nar Ỷ re 3°
Chạc ba Đ đơi n RNA DNA
5 NV —————= g 3 Hình 13.5 Quá trình tổng hợp
theo hướng 3'~>5' xảy ra liên tue, con Hình 13.6 RNA giống như là primer
theo hướng '5~> 3" thi không liên tục để tổng hợp DNA
Trang 37Nhân đôi ở tế bào procariôt Nhân đôi ở tế bào Ởcariôt
(Prokaryotic replication) (Eukaryotic replication)
Ori Ori Ori Ori Ori
J 4 Ta ee 2 ee ees a —=—=—~ a =y ° Ro se ast "— 1111 ` HN = = “Ắ wa ` at sss a Cee w+ - 4 =5
Hình 13.7 Sơ đơ q trình nhân đơi DNA ở tế bào procariôt và øcariơt
- Điểm phình ra giữa hai mạch ở phân tử DNA gọi là ori Từ những ori quá
trình nhân đôi DNA được tiến hành `
- Đối với tế bào procariơt chỉ có một ori
Trang 38Chương mười bốn
QUÁ TRÌNH SAO CHÉP THƠNG TIN
(TRANSCRIPTION)
`
Cấu trúc của phân tử DNA do Watson và Crick đề xuất năm 1953, cho phép
hiểu được quá trình nhân đơi của nó Song cịn những thơng tin di truyền được lưu giữ trong phân tử DNA và việc chuyển những thơng tin đó cho thế hệ sau được thực hiện như thế nào ? Các cơ thể sống làm thế nào để biết được những thông tin lưu giữ trong bộ gen của chúng ? Câu hỏi trên được giải quyết trong suốt nhiều năm vừa qua
Vào năm 1940, G Beadle và E Tatum nghiên cứu về nấm mốc trên bánh mì Neurospora crassa, đã để nghị gọi một đơn vị di truyền là gen, mỗi một gen, theo
hai ông thì tương ứng với việc sản xuất một enzim Mãi đến 1956 mới có thể chứng minh một cách đây đủ mối quan hệ giữa các gen và các protein khi mà V Ingram công bố các nghiên cứu của ông về cấu trúc hemoglobin của những hồng cầu dị dạng Tác giả này cho biết bệnh nhân có hồng cầu di dạng di truyền cho thế hệ sau
Trong phân tử hemoglobin của những bệnh nhân này chỉ có một axit amin khác với
phân tử hemoglobin bình thường Kết quả nghiên cứu này chứng tỏ rằng sự biến đổi
về di truyền thể hiện dưới dạng sự thay đổi cấu trúc bậc I của protein, có nghĩa là
những thơng tin di truyền cố định trên các bộ gen quyết định cấu trúc bậc I của mỗi
protein trong cơ thể
Bộ gen của phần lớn các cơ thể procariôt chứa khoảng 2000 gen tương ứng với
2000 loại protein cũng như các hợp chất đại phân tử như là DNA và RNA Những gen này được đặt tên là gen duy rrì, bởi vì sản phẩm của nó giúp cho các hoạt động thông thường của tất cả các tế bào
Nấm men, một loại tế bào ơcariot đơn giản cũng có một bộ gen duy trì Tổng
số gen có trong các sinh vật ơcariơt khác thì chưa được rõ Song ước tính các loại cơn trùng có chừng 7000 gen, các loại động vật có vú có khoảng 50.000 gen Ngoài những gen duy trì, các sinh vật ơcariơt cịn có những gen điều khiển sự phát triển
những gen này chỉ thể hiện trong một số thời kỳ phát triển của bào thai
Trang 39Nhân đôi
PNA: DNA Hình 14.1 Vấn đề cốt lõi của sinh vật
học phân tử : Phân tử DNA tự
Sao chép điều khiển q trình nhân đơi ata
RNA nó, những thơng tin di truyền của
tế bào được chuyển từ DNA sang
Dịch mật mã RNA, réi từ RNA sang protein Protein
Trong chương này sẽ đi sâu vào quá trình làm thế nào các thông tin di truyền
cố định trên phân tử DNA có thể chuyển sang các phân tử RNA, quá trình này được
gọi là sự "sao chép thông tin”
1 Vận chuyển thông tin di truyền từ DNA sang RNA
Để vận chuyển thông tin di truyền từ DNA đến protein, tế bào cần phải bắt đầu
từ việc tổng hợp RNA, nói một cách khác các thông tin di truyền phải được chuyển
từ DNA sang RNA, quá trình này gọi là sự sao chép thông tin di truyền Mỗi một đoạn của phân tử DNA lưu giữ các thông tin để tổng hợp một loại phân tử protein
gọi là một gen Quá trình này có sự tham gia của nhiều loại RNA Ví dụ : RNA vận
chuyển tRNA làm nhiệm vụ vận chuyển các axit đến các ribosom để lắp ráp thành
phân tử protein
rRNA (RNA ribosom) chiếm một phần lớn thành phần của ribosom
Ribosom của tế bào procariôt chứa ba loại rRNA khác nhau : 16S, 5S và 23§
Ribosom của tế bào ơcariot có chứa bốn loại : 18S, 5S, 5,85 va 28S
Một bộ gen có chứa rất nhiều gen, những gen này sản sinh ra rất nhiều tRNA và rRNA làm nhiệm vụ tổng hợp protein đối với tế bào E coli
Nhóm RNA quan trọng thứ ba là RNA thông tin (mRNA) mRNA sao chép từ các gen và lưu giữ các thông tin đặc trưng thứ tự các axit amin trong phân tử protein
Phân tử mRNA ở tất cả các cơ thể sinh vật đều kém bền vững so với các phân tử rRNA và tRNA rRNA thì chiếm một phần lớn số lượng RNA trong tế bào còn mRNA chỉ chiếm một phần nhỏ (xem bảng 14.1)
Khi ta so sánh tốc độ tổng hợp các RNA của tế bào, nhận thấy một phần ba khả
năng tổng hợp nó thuộc về mRNA Khi vi khuẩn sinh trưởng chậm, các tRNA được tự đổi mới thì tỷ lệ mRNA tổng hợp mới có thể đạt tới 60% Ở đây có sự sai khác
giữa tốc độ tổng hợp tương đối khác nhau của các RNA khác nhau Điều này chứng
tổ độ bền vững của các loại RNA trong quá trình trao đổi chất là khác nhau Cụ thể là rRNA và tRNA là khá bền vững, trong khi đó thì mRNA chỉ sau một thời gian rất
Trang 40phân tử mRNA bị phân giải bởi nucleaza chỉ trong vòng 3 phút sau khi nố được tổng hợp Đối với sinh vật ơcariôt, chu kỳ sống bán phần của mRNA khoảng 10 giờ
Bảng 14.1: Thành phần RNA trong một tế bào
Loại Có mặt thường xuyên Kha nang tổng hợp (3)
rRNA 83% 58%
tRNA 14% 10%
mRNA 3% 32%
RNA khởi động (1) <1% <1%
RNA khác (2) 9 <1 <1% Ghi chi: Theo H Bremer va P.P Dennis (1987)
(1U RNA khởi động được dùng trong quá trình nhân đơi DNA, nó không phải là sản
phẩm của RNA polimeraza
(2) Trong số những RNA khác, người ta tìm thấy nhiều RNA enzim như là thành phần của RN-aza
(3) Tính theo phần trăm của tổng số RNA tổng hợp được
2 Tổng hợp RNA nhờ sự xúc tác RNA polimeraza
Stevens và Sweiss đã phát minh ra enzim có khả năng tổng hợp RNA nếu có đủ các chất ATP, UTP, GTP, CTP cùng với phân tử DNA làm mẫu Enzim mới này chính là RNA polimeraza, nó đảm nhận quá trình tổng hợp RNA theo mẫu của một
phân tử DNA, đó chính là q trình sao chép
Phân tử RNA polimeraza trước tiên là nó nhận biết được địa điểm đặc biệt trên
phân tử DNA mẫu để gắn vào, nó tháo giãn phân tử DNA và tổng hợp ngay ở vị trí
đó một đoạn RNA khởi động, đoạn này sẵn sàng được kéo dài ra Enzim này sau đó
làm nhiệm vụ xúc tác để kéo dài mạch RNA theo kiểu đối kháng RNA polimeraza
có cấu trúc bậc 4 giống như DNA polimeraza, đó là một holoenzim Holoenzim
RNA polimeraza liên kết với những protein phụ trợ tạo thành một phức hợp sao
chép hay còn gọi là một bộ máy sao chép, bộ máy này dùng để tổng hợp RNA
Thành phần của phức sao chép thay đổi rất lớn tuỳ theo từng loài sinh vật, nhưng chúng xúc tác các phản ứng gần như cùng một kiểu
RNA polimeraza tách từ E.coli là một cấu trúc gồm 6 thành phần (hecxamere)
bao gồm 5 loại đơn vị cơ bản (xem bảng14.2)
Thành phần của nó bao gồm các loại đơn vị cơ bản sau :
- Hai đơn vị cơ bản œ, một đơn vị cơ bản 8”, một đơn vị cơ bản B, một đơn vị cơ bản ø và một đơn vị cơ bản œ Holoenzim bao gồm tất cả các đơn vị cơ bản tiến hành
các phản ứng sao chép Đơn vị cơ bản " chịu trách nhiệm cố định trên phân tử DNA,