Giáo trình sinh hoá học với cơ sở khoa học của công nghệ gen (giáo trình cao học nông nghiệp) phần 2

PHAN HAI CO SO KHOA HOC CUA CONG NGHE GEN 217 Chương mười CẤU TRÚC AXIT NUCLEIC, VAI TRO LUU GIU MAT MA DI TRUYEN CUA DNA Axit nucleic hợp chất có phân tử lượng lớn, có tất tế bào sống trạng thái tự dạng liên kết với protein để tạo thành nucleoprotein Virut - có cấu trúc từ phân tử axit nucleic quan trọng lưu giữ thơng tin di truyền đồng thời giúp thể thơng tin di truyền Axit nucleic tạo trình trùng hợp nucleotit gọi axit nucleic polinucleotit Ngoài chức trùng hợp để tạo thành axit nucleic, nueleotit cịn đóng vai trị quan trọng q trình trao đổi chất trung gian, hợp chất chứa nhiều lượng ATP, NAD”, NADP”, FAD, CoA ) Nueleotit cấu tạo từ thành phần : - pốc kiểm nitơ dị vịng - đường pentoza - axit phosphoric Đường pentoza gồm loại : Riboza Desoxi riboza Từ ta có loại axit nucleic : Axit desoxiribonucleic (DNA ADN) tìm thấy chromosom nhân tế bào động vật thực vật Đối với loài procariôt vi khuẩn tảo xanh da trời có DNA chromosom Người ta cịn tìm thấy DNA mitochondri cloroplast loại thực vật quang hợp Axit ribonuclic (RNA hay ARN) tế bào động, thực vật tìm thấy chủ yếu xitoplasma tế bào Người ta phân biệt có loại RNA : * RNA ribosom RNA vận chuyển RNA thông tin RNA khởi động RNA Khác 219 số virut Chúng tham gia vào trình thể thông tin truyền Một thực vật, động vật bacterophage bao gồm gen phân tử RNA I DUONG PENTOZA c6 chita B-D-riboza, phân tử DNA Trong phan tit RNA B-2-desoxiriboza O HOH,C H H OH H OH OH B-D-Riboza oO HOH,C - H H HY H có chứa OH H OH H B-2-desoxi-D-Riboza Cả hai loại đường thuộc dạng D B II GỐC NITƠ (GỐC KIỀM) Các gốc nitơ xuất phát từ hai loại gốc nitơ dị vòng purin pirimidin Gốc purin Có hai loại gốc purin tìm thấy phân tử DNA RNA, adenin guanin NZ T” Hy é FY N Purin - ‘Or \ —_ NH N i "é) —Ä NH H,NS Adenin Guanin Người ta cịn tìm thấy số gốc purin khác phân tử RNA thông tinvận chuyển tRNA với số lượng nhỏ Cho đến ngày người ta biết có khoảng 50 loại gốc thuộc hai loại purin pirimidin Đối với purin ví dụ : ĩ HN ~ ; |> N Hipoxanthin N N NH HạC-N H, O lỊ ~ À N NH 5-methil-guanin Gốc pirimidin Từ gốc pirimidin có ba loại xitosin, uraxil thimin Trong phan tit DNA có xitosin thimin 220 Trong phân tử RNA có xitosin uraxil NH, N Đ _ Pirimidin NZ O O H | d I H3 Trong DNA H Thimin Xitosin O I HN O= Trong RNA | H Xitosin Người ta tìm thấy Uraxil số gốc bất bình thường phân tử DNA bacteriophage 5-hydroximethil xitosin thay cho vi tri xitosin - N im CH;OH H 5-hydroximethyl xitosin III NUCLEOSIT Khi gốc nitơ kết hợp với phân tử đường riboza hay desoxiriboza tạo ribonucleosit hay desoxiribonucleosit NH, NH, N oN N HOH,C OH Adenosin (Adenosin ribonucleosit) H H Desoxisitidin (xitosin desoxiribonucleosit) 21 Bang sau tóm tắt tên nucleosit : Bảng 11.1 : Các loại nucleosit Gốc Nitơ Ribonucleosit Desoxiribonucleosit Adenin Adenosin Desoxiadenosin Guanin Guanosin Desoxiguanosin Uridin Xitosin Xitidin Ribothimidin Thimin -Desoxiuridin : Uraxil 'Đesoxixitidin Desoxithimidin IV NUCLEOTIT Khi nucleosit tác động với phân tử axit phosphoric tạo thành nucleotit Theo thành phần đường pentoza, người ta phân biệt loại nucleotit 14 ribonucleotit va desoxiribonucleotit Khi thuỷ phán hỗn hợp nucleotit phương pháp khác nhận kết sau : Thuỷ phân axit yếu Gốc nitơ-pentoza-phosphat _ ——————————>Øốc Nucleotit —————— Thuy phan bang kiém yéu nitơ + pentoza-phosphat Géc nito-pentoza + phosphat = - N Nucleosit Bảng 11.2: Bảng tóm tắt nucleotit Gốc nitơ | Ribonucleosit-5'-monophosphat Desoxiribonucleosit -5'- monophosphat Adenin Desoxiadenosin 5'monophosphat = dAMP Adenin 5'monophosphat =AMP Guanin Guanosin 5’monophosphat = GMP_ | Desoxiguanosin 5’monophosphat = d@MP Uraxil Uridin-5'-monophosphat = UMP Desoxiuridin S'monophosphat = dUMP Xitosin Xitidin 5'monophosphat = CMP Desoxixitidin S'monophosphat = dCMP Thimin Thymin ribosit 5'monophosphat (rất hiếm) Desoxithimidin 5'monophosphat = dTMP 222 , V CAU TRUC BAC MOT CUA AXIT NUCLEIC tử DNA phân Trong RNA, liên kết với nucleotit qua cầu diestephosphat vị trí cacbon số đường pentoza vị trí cacbon số phân tử đường pentos Kết luận dựa kết thực nghiệm sau : - Khi trung hoà phân tử axit nucleic nhận thấy phân tử axit phosphoric có chức axit tự - Khi dùng enzim thuỷ phân axit nucleic tuỳ thuộc vào loại enzim ta thu hỗn hợp nucleosit 5'monophosphat nucleosit 3'monophosphat Mạch polinucleotit cấu tạo theo thứ tự phân tử đường pentoza, tiếp đến axit phosphoric, đường pentoza axit phosphoric Cấu trúc đặc trưng cho DNA RNA Các phân tử DNA RNA khác độ dài mạch polinucleotit Dưới đoạn trinucleotit phân tử RNA | O oO gi no | E HN, OH,C HOH,C H “Al HO- Lo H Kẻ, OH OH H Riboza OH,C 223 Các gốc nitơ tham gia vào mạch polinucleotit tương tự thứ tự axit amin mạch polipeptit, quan trọng định chất phân tử DNA hay RNA XÁC ĐỊNH THỨ TỰ CÁC NUCLEOTIT Xác định thứ tự gốc nitơ phân tử RNA DNA cịn khó khăn việc xác định thứ tự axit amin mạch protein Để nghiên cứu cấu trúc bậc axit nucleic người ta phải thuỷ phân chúng Thuỷ phân RNA DNA A Thuỷ phân kiềm Phân tử RNA bị thuỷ phân kiểm cắt đứt mối liên kết nhóm phosphat nguyên tử cacbon số phân tử đường pentoza bên cạnh Hỗn hợp thu sau thuỷ phân nucleotit 3'phosphat wih rs HỆ OH pes Ap +Gp + Up + Cp Phân tử DNA bền vững với việc thuỷ phân kiểm B Thuỷ phân ribonucleaza tuyến tụy Đó enzim endonucleaza, cắt mạch phosphodiester bên mạch phân tử RNA giống thuỷ phân kiểm, phân tử DNA có khả kháng enzim Vị trí cắt mạch xảy nucleotit bên cạnh cacbon 3' gốc nitơ thuộc nhóm pirimidin Xitosin \ Vl As Uraxil Uraxil NÌNG af —* Guanin 3) Cp+ApUp+Up Xitosin số 2) sử NA Su Ribo nucleaza + GpCp + Up C Thuy phan bang nucleaza T, Enzim cắt mối liên kết phosphadieste phân tử RNA bên cạnh vị trí cacbon3' nucleotit có gốc kiểm guanin 224 NHI bebe ye mma Xitosin Adonin Guanin —» Uraxi pCpApGp Uraxil Xitosin Uraxi + UpUpCpGp D Thuy phan bang ribonucleaza U, N6 ciing 14 mét enzim endonucleaza phân cách mối liên kết phosphodieste phân tử RNA vị trí cacbon 3' mà nucleotit bên cạnh, có gốc nitơ adenin hay guanin Người ta dùng enzim để cắt tiếp sản phẩm thu sau thuỷ phân bang ribonucleaza T, E Thuỷ phân phosphodiesteraza noc déc ran Khác với enzim trên, phân cắt mối liên kết axit phosphoric với cacbon 3' đường pentoza Sản phẩm tạo nucleosit 5'-monophosphat Mat khác exonucleaza, cơng phân tử oligo polinucleotit từ đầu 3' Và giải phóng nueleosit -5'- monophosphat Adenin A, ae Uraxil PO } sò Ba Guanin Xitosin “hệ mo Py Xe fp Phosphodiesteraza —_————> ON Enzim tác động lên DNA pA+ pU + pG + pC RNA E Thuỷ phân phosphodiesteraza lách Đây exonucleaza, cơng RNA phóng cách nucleosit 3' monophosphat DNA từ đầu 5' giải ` G Tac dụng phosphataza kiêm cia E.coli Phosphataza kiểm E.coli phosphataza khác cắt phân tử axit phosphoric khỏi đầu phân tử RNA Guanin “i P| Uraxil `P Me Xitosin P | hay DNA Adenin P- [TP — > pGpUpCpA+Pi H Tac dộng desoxiribonucleaza (=DNaza) Những DNaza phát thường khơng mang tính đặc trưng RNaza Người ta nghiên cứu nhiều hai loại endonucleaza sau : tụy phân giải - DNaza (I) tuyến monophosphat - DNaza axit (II) giai phan tao oligodesoxiribonucleotit DNA DNA tao oligodesoxiribonucleotit 5” 3’ monophosphat "endonucleaza Gần người ta phát enzim han chế” có nhiều loại vi khuẩn làm nhiệm vụ phân giải tất phân tử DNA thêm nhập từ bên vào vi khuẩn Những enzim phân cắt phân tử DNA mot cách đặc biệt Ví dụ loại endonucleaza sử dụng lấy từ vi khuẩn E.coli Eco R1, Haemophilus trí cắt mạch Eco RI Hae III Hind III aegitus (Hae III) va Haemophilus influenzae (Hind MI) va vi AC Ỷ GAATTC CTTAAG Ỹ L GGCC CCGG † ‡ AAGCTT TTCGAA t Xác định thứ tự nucleotit phân tử RNA Có ba phương pháp để xác định cấu trúc bậc phân tử RNA a) Thuỷ phân enzim ribonucleaza tuyến tụy, nucleaza T¡, nucleaza U; loại nucleaza khác Số oligonucleotit thu tiếp tục định tính phương pháp sắc ký cột Phương pháp đòi hỏi số lượng mẫu đủ lớn song lại cho phép định tính nucleotit sau sắc ký cột đem soi máy quang phổ tử ngoại Các tiểu phần thu Cũng dùng phương pháp điện di chiều giấy xelluloza - axetat, gel policriamit Số lượng mẫu dùng phương pháp cần song phân tử RNA phải đánh dấu ””P, kỹ thuật đánh dấu dé dàng với vi khuẩn, song với động vật bậc cao vấn để phức tạp Phân tử RNA sau đánh dấu, dùng kỹ thuật thuỷ phân phần hay tồn phần, sau 226 ¿ảnh kích hoạt (amplification) PCR phải trì hai mươi vịng (chu kỳ) để tạo kích hoạt mạch thẳng PCR sản xuất đột biến (PCR mutagenesis) Có thể dùng kỹ thuật PCR để xoá cấy ghép đột biến vào phân tử DNA mục tiêu Kỹ thuật giúp nghiên protein cuối cứu cấu trúc chức tương lai Sự xoá (Deletion) dùng primer nối với vịng cần phải xố tiến hành vị trí giới hận trình tái tổ hợp với primer thứ hai PCR chưẩn (Standard PCR) dây xoắn đôi DNA tác động nhiệt độ tở (Tm) trở thành hai sợi đơn, xuất hai primer, chúng tác động đầu dây đơn Sự tổng hợp DNA hoàn tất nhờ enzim Taq DNA polimeraza với điều kiện môi trường phản ứng có đủ bốn loại deoxiribonucleotit Chu kỳ làm biến chất DNA nhiệt độ tiếp tục Sau lần tổng hợp DNA, tạo kết nhân phân tử DNA nghiên cứu đến số lượng hang pg PCR bi neo (anchored PCR) : cần primer đơn cho phản ứng Trong kỹ thuật PCR đoạn cuối DNA neo, đuôi nhân nghiên cứu tạo dG residues Sự tăng số lượng DNA thêm vào xảy có primer đoạn mật mã biết trước primer thứ hai có olige dC residues 10 Danh sách primer thường dùng (Sequencing primers) Các Sequencing primer liệt kê tổng hợp phosphoramidit Người ta dùng máy HPLC (sắc ký lỏng hiệu cao - High performance Liquide Chromatography) để tách primer có độ thuân cao Sản phẩm thu đựng ống nghiệm với số lượng 1,0 micro gram, dé sử dụng cho phản ứng mã hoá Catolog N2 Š-0115 S-0217 S-0317 S-0416 S-0516 S-0620 S-0716 S-0816 “Primer Sequence M13, 15 mer TCCCAGTCACGACGT M13, 17 mer (-20) GTAAAACGACGGCCAGT MI13,17mer(-40) GTTTTCCCAGTCAGGAC M13 Reverse AACAGCTATGACCCATG M13 Hybridization CACAATTCCACACAAC PBR 322 Bam HI, CW CACTATCGACTACGCATCA PBR 322 Bam HI, CCW ATGCGTCCGGCGTAGA PBR 322 Eco RI, CW GTATCAGGAGGCCCTT (Giá mẫu ước khoảng 30 USD theo Midland Catalog 93/94) 360 Standard PCR ee - ee ” heal ~S -—”- heal — oO digest Target DNA m=m=——————=———— - Arlifical Tail Anchored PCR mm Target DNA Inverse PCR AV Known Sequence tspecific ; primer - + J, \) Seeks oer =a, eee Es = aa E£fi————— SS / \ f Hy @ v9 ——a&@ _, # ẵ fennel CS —- Taq Pol heat Known primer HK Em + Tag polimeraza S.A - cc-= - = anchor primer fleas =1 Taq polimeraza circularize —~” † nown sequence primers amplify 361 II PHUONG PHAP DUA GENLA VAO CO THE SINH VAT Bằng thuật kỹ PCR từ đoạn ~~ DNA người ta có (amplified) thành số lượng đáng kể sau đoạn DNA thể khuyếch đại lạ (foreign DNA) có ích vào gen có ích Người ta tiến hành du nhập gen thể sinh vật (hiện thường thực vật vi sinh vật) ba đường sau : tế Phương pháp vi chủng (micro - injection) : Người ta tách bỏ thành bào mô để tạo thể huyền phù tế bào trần (protoplaste) Sau tế bào trần cố định holding pipette dung dịch vào Trong vài tế bào trần, phân tử DNA trở nên DNA cÂy trồng tế bào trần Những protoplast truyền gọi protoplast chuyển DNA lạ cấy hợp lại thành cải tiến mặt di nạp (transformed protopplasts) Mở lỗ xung điện (Electroporation) : trường hợp này, người ta đưa dung dịch DNA lạ vào protoplasts Hỗn hợp DNA - protoplast đưa vào dòng điện Nhờ tác dụng xung điện xuất lỗ nhỏ xuyên qua lớp protoplast (small pores) Qua lỗ nhỏ DNA lạ thâm nhập vào nhân tế bào kết hợp với DNA có nhân Sau protoplast vừa chuyển nạp tái sinh sinh vật Chuyển DNA qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium - chuyển gen qua trung gian : Agrobacterium vi khuẩn lây nhiễm thân trồng Trong lây nhiễm xuất phần DNA riêng nó, nhờ kích thích sinh sản chất cần thiết cho sinh trưởng vi khuẩn xâm nhập Agrobacterium hoạt động theo nguyên tắc phần DNA lạ có chứa gen mong muốn kết hợp với DNA Agrobacterium (xem tiết chương mười sáu) Sau Agrobacterium nhận mang DNA chuyển nạp lây nhiễm tiếp lạ vào kết hợp với nhiễm sắc thể chủ với DNA Agrobacterium Mô chủ (đã chuyển có chứa gen lạ nạp) sử dụng để tái sinh Mặc dù vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens phương tiện dùng hệ thống chuyển gen có hiệu trồng, chưa thực với nhóm lương thực lúa, lúa mỳ, ngô, đại mạch, cao lương, mà thành công số loại khác Ngày người ta sáng tạo nhiều phương pháp khác để đưa vật liệu di truyền ngoại lai dạng gen riêng biệt vào tế bào thực vật Chúng phân làm hai nhóm sau : 362 a) Chun gen qua vectơ Các plasmid dùng làm vectơ để chuyển vật liệu di truyền vào tế bào sinh vật Các plasmid gọi T¡ Ri Nguyên nhân tạo khối u plasmid có đoạn DNA gọi T-DNA với ba chức : tạo khối u, tổng hợp opine, ức chế q trình tiến hố Những virut dùng làm vectơ chuyển gen ví dụ virut gây đốm hoa cải (CaMV) virut gemini b) Truyền trực tiếp DNA - - Phương pháp vi tiêm : dùng pipet tiêm dung dịch DNA vào tế bào trần áp lực cao - Biến nạp xung điện : điện trường xoay chiều với tần số cao, tế bào trần kết lại với nhau, sau dùng xung điện chiều để dung hợp chúng lại - Biến nạp mở lỗ điện : tế bào trần nằm dung dịch sinh lý thích hợp với phân tử DNA cần biến nạp Các DNA chui vào nhân tế bào trần lớp nguyên sinh chất tế bào Người ta cho xung điện chạy qua dung dịch, nhờ tạo lỗ hổng lớp nguyên sinh chất Qua lỗ hổng phân tử DNA chưi vào bên nhân tế bào - Súng bắn DNA (Biolistics) : biến nạp gen áp lực đưa phân tử DNA vào nhân tế bào Súng bằn DNA dụng cụ có áp lực nén lớn bắn hạt DNA xuyên qua lớp nguyên sinh chất tế bào trần IV RFLP VÀ NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA NÓ RFLP (Restriction Fragment Length Polimorphism), để hiểu vấn đề ta cần sâu tìm hiểu chất Trong tự nhiên xảy nhiều loại biến dị, biến dị thể qua thay đổi phân tử DNA theo nhiều cách, ví dụ: đảo đoạn DNA (inversion), chuyển vị (translocation), cat doan (deletion) hoac chuyén nap (transposition) Lam để nhận biết biến dị Cho đến ngày nay, người ta biết hai phương pháp Thứ xếp dãy DNA cách trực tiếp so sánh thật chi tiết Nhưng phương pháp cồng kệnh tốn thời gian Thứ hai : người ta sử dụng enzim đặc biệt gọi restriction enzim (enzim có giới hạn) Đó desoxiribonucleaza tách từ vi sinh vật có khả cắt mạch DNA vị trí mục tiêu (target sifes) - cịn gọi "restriction sites” vị trí liên kết nucleotit định (xem Chuong mudi) phan tử DNA 363 Ví dụ : Pst - I 1a restriction enzim thứ tách từ probidencia stuartiÍ R245 Eco RII restriction enzim thứ hai tách từ E.coli dong Restriction site Pst-I cTGCAG eerie nucleotit Mũi tên điểm mục tiêu (target site), mạch poli desoxyribo tử phân tử DNA bị cắt rời Dưới tác dụng restriction enzim phân DNA cắt thành đoạn tuỳ thuộc vào 'số lượng target site có Mỗi đoạn (fragments) mang gen nhóm gen (genome) Nó dùng làm "finger print" chuyên tính target DNA biết trước (hoặc V§V có chứa DNA Mục đích cuối ban dé đó) gen tìm thứ tự nucleotit (nucleotide sequence) gen mối liên kết với gen kế cận Khi ta biết thứ tự axit amin phân tử protein suy ngược qua code mật mã di truyền biết thứ tự nucleotit gen đảm nhiệm việc tổng hợp phân tử protein Điều thơng dụng việc xác định DNA : tế bào đảm nhiệm sinh tổng hợp phân tử protein biết Kỹ thuật cất (breakage) hình thành nhờ khả restriction enzim cụ thể phép thu đoạn ngắn chun tính DNA Bản đồ DNA có việc xác định điểm cắt gọi restriction map mà "Restricion map" chuối thẳng không phân nhánh điểm (sites) restriction enzim đặc biệt phát target site Khoảng cách đồ đo trực tiếp cặp gốc kiểm (base pairs) ký hiệu bp trường hợp khoảng cách ngắn Với khoảng cách dài đo kilo base pairs ký hiệu kb 1kb = 1000 bp Đơn vị dùng cho DNA RNA Mỗi restriction enzim có target riêng biệt DNA sợi xoắn kép (duplex) Kỹ thuật phân biệt đoạn DNA dựa nguyên agaroza gen poliacrylamide Phân tử DNA môi trường trung tính mang tắc điện di thạch có chứa gốc phosphat, điện tích âm, người ta đặt phía cực âm Các đoạn DNA chạy cực dương (anode) với tốc độ khác tuỳ thuộc vào độ dài Các đoạn ngắn chạy nhanh đoạn dài Quá trình điện di kéo dài khoảng 1-2 tuỳ theo yêu cầu độ dài đoạn 364 DNA, cần 30 phút Kết thúc điện di, nhuộm điện di đồ bảng dung dich Ethdium Bromide (1 tig/ml) ta thu dải (band) màu xanh Mỗi mot band tương ứng với đoạn DNA định Để nhận biết chiều dài đoạn thu người ta cho chạy song song với mẫu đoạn (fragment) tiêu chuẩn mà kích thước biết (thường gọi marker) Những band có khoảng cách chuyển dịch từ cực âm (catode) tương tự marker chứng có chiều đài marker Cũng nhận biết băng DNA tỏ cách soi đèn tử ngoại chụp ảnh qua tỉa tử ngoại Dưới tác dụng restriction enzim phân tử DNA cắt thành đoạn có kích thước khác goi 1a Restriction Fragment Length Polimorphism, viét tat 14 RFLP Ung dung cia RFLP RFLP marker thường ứng dụng để nghiên cứu : - Độ phong phú di truyền - Sự phân hoá di truyền huyết thống (phylogmentics) - Lập đồ liên kết gen V SOUTHERN HYBRIDIZATION, (LAI SOUTHERN Để phân tích VA gen NORTHERN HYBRIDIZATION LAI NORTHERN) cé ligén quan, E.M.Southern, mét nha sinh vật học phân tử làm việc Trường Đại hoc Edinburgh sang tao ky thuat Southern blotting Kỹ thuật bắt đầu sau : Phân tử DNA xử lý với “enzim hạn chế” (RE) để tạo đoạn DNA Tiến hành chạy điện di sản phẩm sau xử lý enzim Do độ dài khác mà đoạn DNA gel agaroza Tiếp tục chuyển tạo thành băng tách đoạn DNA sang màng nitroxenluloza (nitrocellulose filter) Tiến hành làm biến chất DNA cách khác mở dây xoắn DNA để tạo thành sợi DNA màng blotting Tồn q lọc nitroxenluloza trình biệt lọc ïn situ, nói đơn cố định gọi Southern Sau cố định sợi DNA màng lọc nitroxenluloza, người ta tiến hành dùng mẫu dò đánh dấu lai với phân tử DNA màng lọc Chỉ mẫu dị có thứ tự gốc kiềm bổ sung xác cho đoạn DNA có màng lọc ghép đôi để tạo thành sợi xoắn kép Sợi xoắn kép bao gồm hai sợi đơn có nguồn gốc khác Quá trình gọi Southern hybridization 365 Phân tử DNA | Xử lý với hay nhiều enzim hạn chế `=ấ“==== — WES eS STS | Những đoạn DNA hạn chế Chạy điện di gel agaroza,, // 1110 fr J LL HN WMA LMM ed Gel với doan DNA Chuyén sang mang nitroxenluloza Gel ` “may loc Lai voi mau ⁄ 1⁄1 t1 LL "HH ⁄/⁄/ MMII THAN Wy / mang lọc nitroxenluloza chứa băng điện di ban gel Phát đoạn DNA lai Hình 20.1 Sơ đồ trình Southern blotting Sout hern hybridization 366 - AN Phân tử DNA enzim hạn chế cát thành đoạn có kích thước khác i 29 Electrophore gel agaroza -zœ@x Hộp electrophorese Gel Phát ADN Giấy thấm Mang loc nitroxenluloza Lam bién chat DNA loc Barer Gel iw | ae Cầu nối Giá đỡ Gắn DNA với giấy lọc Nhuộm ff qd | \ (SSS Lai vai DNA tham _ Rita Chuyén sang phim | | A | ñ : Phim| Máy lọc | Le pus Rita phim Hinh 20.2 Southern blotting va Southern hybridization tt rae Nhitng band chi đoạn AND lai voi DNA tham Kỹ thuật Southern thuat Ky Southern blotting va Northern blotting chuyén đoạn DNA từ gel đến agaroza : phận lọc nitrorelluloza Điện di gen mẫu DNA ứng, chuyển dây đơn DNA blotting xử lý với restriction enzim bị biến chất đến màng lọc, dùng tương X quang để chụp thành phim Kỹ thuật áp dụng cho DNA lai DNA thăm Một quy thành DNA Kỹ thuật Northern blotting dùng để copy mRNA trình tường tự chuyển đổi protein có tén 14 “Western blotting" Tinh chất biến dị cha k¥ thuat "blotting" cho phép nhiều dịng RNA blotting DNA r&t có ích quy trình trắc nghiệm tính tương đồng (homology) chất thăm dò đánh dấu NORTHERN BLOTTING VÀ NORTHERN HYBRIDIZATION Trước vào kỹ thuật Northern blotting và,Northern cần tìm hiểu khái niệm EXON INTRON Trong chromosom_ hybridization, ta tế bào ơcariôt thường tồn gen đứt đoạn (Interrupted genes) Ví dụ thứ tự nucleotit mã hoá cho thứ tự axit amin hemoglobin ovalbumin thường bị đứt đoạn khối nucleotit (blocks of nucleotides) khơng mã hố thơng tin (no coding information) Đoạn nucleotit mã hoá thơng tin gọi EXON, cịn đoạn nucleotit khơng dịch sang axit amin gọi INTRON Sự hình thành DNA đồ phía trước) bổ sung (Complementary DNA) ký hiệu cDNA (xem sơ Người ta dùng kỹ thuật Nortern blotting để phát tiền tố (precusors) mRNA ovalbumin có phân tử lượng cao , Trong kỹ thuật mẩu RNA trước tiên chạy điện di gel sau chuyển sang loại giấy đặc biệt liên kết chéo đồng hoá trị RNA Cũng giống kỹ thuật Southern blotting băng complementary phát cách lai với DNA đánh dấu Ở đây, nhận thấy có nhiều loại RNA nhân tách biệt (many discrete nuclear RNA species) có chiều dài gấp4 lần chiều dài phân tử mRNA ovalbumin trưởng thành (mature ovalbumin mRNA) 368 phân Còn ti mRNA lại phát nhờ mẫu cDNA (chỉ chứa thứ tự nuoleotit mRNA) qua kỹ thuật lai gọi Northern hibridization Tiếp tục cho lai với mẫu chứa thứ tự nucleotit intron từ gen nhân phát kích thước nuclear RNAs, phân tử chứa nhiều intron khác Xitoplasmic mRNA RNA 6ng dân trứng Vị trí mẫu đánh dấu _ 245 ' = Chiéu dién ly 26s Kỹ thuật biolistic (súng bắn gen) Kỹ (1987) thuật John Stanford Đại Kỹ thuật cho phép chuyển DNA học Cornell (Hoa Kỳ) phát lạ vào tế bào trồng minh nh hợp tử động vat Hiện có loại dụng cụ biolistic khác nhau, điểm khác chủ yếu phương pháp điều khiển “microprojectile”, Tungsten hay vàng Dụng cụ ban đầu phận cung cấp lượng giống súng gây nổ nhờ kim nổ Dụng cụ kiểu thứ hai hoạt động theo nguyên tắc phóng điện đưa DNA phân tử vàng cực mịn gọi “DNA coated gold particles” Dụng phủ cụ kiểu thứ ba hoạt động áp suất ga từ xilanh chứa gas nitơ hay từ bình khí nén hilium để thúc đẩy tiến hành bắn DNA Vận tốc tiến trình “microprojectile” cơng cụ thứ ba chậm nhiều so với súng bắn gen thứ nhất, song hiệu trường hợp chuyển plasmid vào tế bào trồng (theo Cao ctv 1991) 369 Để làm việc người này, ta cần dé doi buồng bom (bombardment chamber) Mẫu cần bắn gen đặt bên trong, áp suất buồng giảm xuống đến 0,05 - 0,1 at nhờ máy hút chân không Plasmid với sợi đôi DNA Ấ—” điểm cắt mRNA5 —————————— ^^^A^A Olgo diprimer bé sung vao dau poli A Ỷ AAAAAA TTT Enzim hạn chế Xir ly MRNA bang NaOH tạo điểm cong dé polimeraza | diing nhu primer dé C tổng hợp DNA @ CC Enzim nucleaza đặc trưng phá điểm sũsblzss Bé sung dGTP terminal transferaza va Southern cong, Hybridization ©© ® g b Bổ sung dCTP terminal transferaza C((c ——————— —— (Ê Nối ghép với plasmid _ so | Dua vao té bao E.coli để nhân Hinh 20.3 So dé Northern hybridization TAI LIEU THAM KHAO Stryer.L Biochemistry W.H.Treeman and company - New York - 1981 Weil J.H Biochimie génerale Masson, Paris, New York, Milan, Mexico - 1987 Rawn DJ Traité de biochimie Editions Universitaires - Paris - 1990 Pastan I Biochemistry New Delhi - 1990 371 SINH HOA HOC HỌC VỚI CƠ SỞ KHOA CỦA CƠNG NGHỆ GEN Mọi ý kiến đóng góp xin gửi NHÀ XUẤT BẢN NÔNG NGHIỆP D14 Phương Mai, Đống Đa, hà Nội ĐT : 8523887, 8525070, 8521940 Chịu trách nhiệm xuất : PTS Dương Quang Diệu Phụ trách thảo i Pham Thuy Lan Nguyễn Đình Chí Sửa i Hoang Van Tién Pham Thuy Lan In 715 khổ 19x27 Xưởng in NXB Nông nghiệp Giấy chấp nhận đăng ký kế hoạch xuất số 9/503 Do Cục xuất cấp ngày 27/8/1996 In xong nộp lưu chiểu tháng 7/1997 312 57 M3500 GIÁO TRÌNH CAO HỌC NƠNG NGHIỆP Đà XUẤT BẢN : Bảo vệ thực vật IN DAR YN Sinh lý thực vật Hệ thống nông nghiệp Di truyền chọn giống động vật - Chọn giống nhân giống vật nuôi Dinh dưỡng thức ăn gia súc - Nông lâm kết hợp ee Sinh lý gia súc Di truyền số lượng 10 Ứng dụng công nghệ sinh học cải tiến giống lúa 11 Di truyền học 12 Rau trồng rau 13 Sinh hoá học với sở khoa học công nghệ gen