JIÊN KHOA HỌC KỲ THUẬT NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM a ~ HOANG VAN TIEN - LÊ KHẮC THẬN - Lf DOAN DIEN
SINH HOA HOC với cơ sở khoa học của
CONG NGHE GEN
(GIAO TRINH CAO HOC NONG NGHIEP)
Trang 3VIỆN KHOA HỌC KỸ THUẬT NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
HOÀNG VĂN TIẾN - LE KHAC THẬN - LÊ DOÃN DIÊN Chi: bién : HOANG VĂN TIẾN
SINH HOA HOC VOLCO SO KHOA HOC CUA CONG NGHE GEN
(Giáo trình cao học Nông nghiệp)
cat pect tát Tet? ° 9590 PRU HT iy pHOns MUON
NHA XUAT BAN NONG NGHIEP
Trang 4a a 2
TAP THE TAC GIA:
1 HOÀNG VĂN TIẾN : Chương 1;2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
17, 18, 19 va 20
2.LÊ KHẮC THẬN : Chương 9 và 10
3.LÊ DOÃN DIÊN : Chương 8
630 - 631.8
———— +9/503-
NN-97 7908-96
Trang 5Lời giới thiệu Chương một Chương hai Chương ba Chương bốn Chương năm Chương sáu Chương bảy Chương tám Chương chín Chương mười PHẦN HAI Chương mười một
Chương mười hai Chương mười ba
Chương mười bốn
Chương mười lãm Chương mười sáu
Chương mười bảy
Chương mười tám Chương mười chín
Chương hai mươi
MỤC LỤC
PHAN MỘT : KIẾN THỨC CƠ SỞ
: Cấu trúc tế bào
: Axit amin
: Cấu trúc bậc một của peptit và protein
:Protein -
: Enzim - Chất xúc tác sinh học
: Cấu trúc và trao đổi của gluxit : Cấu trúc và trao đổi 1ipit
: Hoá sinh của quang hợp
: Năng lượng sinh học (Bioenergetics) : Màng sinh học, cấu tạo và chức năng
: CO SG KHOA HOC CUA CÔNG NGHỆ GEN
:Cấu trúc axit nucleic, vai trò lưu giữ mật mã di
truyền của DNA
: Cấu trúc của phân tử RNA
: Sinh tổng bợp DNA
: Quá trình sao chép thông tin (Transcription)
: Sinh tổng hợp protein (dịch mật mã di truyền)
: Điều hồ q trình biểu hiện gen
: Chromosom của tế bào ơcariôt và sự thể hiện gen
: Miễn dịch học phân tử
: Công nghệ tái tổ hợp DNA (Công nghệ tái tạo tổ
hợp gen)
: Ky thuat PCR, RAPD, RFLP và những ứng dụng trong nhan gen, lai ghép gen
Trang 7LỜI GIỚI THIỆU
Nhằm cung cấp kịp thời tài liệu học tập chính thức cho đào tạo cao
học, nghiên cứu sinh và từng bước nâng cao chất lượng để hoà nhập với cộng đồng quốc tế về hai bậc đào tạo này Viện Khoa học kỹ thuật nông
nghiệp Việt Nam xin trân trọng giới thiệu giáo trình : “Sinh hoá học
với cơ sở khoa học của công nghệ gen” của tập thể tác giả : PGS.PTS
Hoàng Văn Tiến, GS.PTS Lê Khắc Thận và GS.TS Lê Doãn Diên do
PGS.PTS Hoàng Văn Tiến chủ biên Đây là cuốn sách được biên soạn
khá công phu từ các bài giảng chọn lọc của nhiều khoá đào tạo cao học,
trên cơ sở kế thừa những thành tựu mới của cộng đồng quốc tế về công
nghệ gen, kỹ thuật PCR, RAPD, RFLP Sinh hoá học hiện đại là cơ sở cho công nghệ sinh học, công nghệ gen - một trong những mũi nhọn của khoa học thế kỷ 21 Đây là lĩnh vực đang có tốc độ phát triển như vũ bão đã và đang có những tác động mạnh mẽ làm biến đổi sâu sắc trong sinh học, nông nghiệp và y học
Sinh hoá học là môn khoa học cơ sở cho nhiều ngành khoa học khác: Sinh lý học, Dinh dưỡng và thức ăn của cây trồng vật nuôi Sinh hoá học được ứng dụng, giảng dạy và học tập rộng rãi Tuy nhiên, ở nước ta nó
chưa được đầu tư thích đáng, đây là những hạn chế khách quan và chủ
quan trong biên soạn giáo trình này Mặc dầu tập thể tác giả đã làm việc
với tinh thần nỗ lực cao, nghiêm túc, song giáo trình chắc sẽ còn những
khiếm khuyết khó tránh Chúng tơi mong nhận được nhiều ý kiến đóng
góp của bạn đọc gần xa
Xin trân trọng giới thiệu cùng bạn đọc
: CƠ SỞ ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC
Trang 9PHẦN MỘT
Trang 11Chương một
CẤU TRÚC TẾ BÀO
Tuyệt đại đa số các cơ thể sống đều cấu tạo từ tế bào (trừ virut) Sinh hoá học là một ngành khoa học phối hợp giữa hoá học và sinh vật Nó nghiên cứu các quá trình
biến đổi hoá học xảy ra trong cơ thể sinh vật Phần lớn những phản ứng hoá học này
diễn ra trong tế bào Do đó muốn hiểu biết rõ về các q trình sinh hố xảy ra trong cơ thể ta phải biết được cấu trúc và chức năng của từng bộ phận của tế bào
Tế bào thì rất đa dạng, ví dụ riêng cơ thể của con người được cấu tạo từ trên 200 loại tế bào khác nhau Mặc dù vậy tế bào sinh vật được chia làm 2 nhóm chính :
- Tế bào procariôt và
- Tế bào ơcariôt
Tế bào procariôt (theo tiếng Hy Lạp thì pro là trước, carion là hạt nhân) Tế bào này thường khơng có nhân rõ rệt, nó được bao bọc bởi một thành tế bào Tế bào procariôt điển hình như là xianobacte, tảo xanh lam, E.coli
Tế bào procariôt được xem là tổ tiên của tất cả sự sống trên hành tỉnh
Tế bào ơcariôt (theo tiếng Hy Lạp : ơ (eu) nghĩa là hạt, carion là nhân)
Tế bào ơcariơt có nhân rõ ràng, nó cấu tạo nên cơ thể động và thực vật probistes
và mycetes
l.COLI - MỘT MƠ HÌNH CÚA PROCARIƠT
Tế bào E.coli là một mô hình lý tưởng để các nhà sinh hoá học nghiên cứu Cấu
trúc của nó rất đơn giản, ni cấy nó rất dễ dàng và nó sinh sản rất nhanh
Bacteria gram âm E.coli trong đường ruột của người là một tế bào procariôt được
nghiên cứu kỹ lưỡng, tế bào có đường kính là lụt và chiều dài là 2u Nó được bao bọc
một lớp màng bên ngoài tiếp đến là màng tế bào hay là màng plasmic Những màng này
ngăn cản không cho tế bào phồng lên khi nồng độ các chất chứa bên trong tế bào lớn hơn ở ngoài tế bào Màng của E coli có thể chịu đựng được một áp suất thẩm thấu đạt tới 20 atm Màng của nó khơng chịu được những va đập về cơ học
Flagellcs và fimbriae là những sợi gắn vào màng của E.coli cũng như nhiều tế
bào vi khuẩn khác Flagelle (theo tiếng Latinh Flagel có nghĩa là cái roi da), nó
đảm nhận nhiệm vụ chuyển động của tế bào, chúng giúp đẩy tế bào E coli chuyển
động với tốc độ 50 H/giây Vì chiều dài của nó chỉ có 2k cho nên trong 1 giây nó
Trang 12Fimbriae _— Pilus để giao phối
Hình 1.1
a Mơ hình tế bào procariôt E coli dựa trên ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử (Theo L.Shoemaker) b Ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử, nhát cắt của tế bào E coli thấy rõ :
- Màng bên ngoài của tế bào - (ME)
- Màng plasmic (MF') - Vùng nhân (ế bào (N)
(Ảnh chụp của W.Van Iterson)
Trang 13Pilus đảm nhiệm chức năng giao phối, cịn fimbriae thì cho phép nó dính chặt
với bề mặt của vật khác
Màng tế bào hay còn gợi là màng plasmic được cấu tạo từ protein va lipit Màng
plasmic cho phép thấm qua một cách lựa chọn các chất dinh dưỡng, nó còn chứa các protein vận chuyển điện tử, có khả năng sản sinh ra năng lượng trong điều kiện hảo khí Hệ thống vận chuyển điện tử và hình thành ATP tồn tại ở màng tế bào của một
số vi khuẩn quang hợp
Toàn bộ vật chất bên trong màng tế bào được gọi là xitoplasm Xitosol hoặc là túi tế bào là môi trường nước trong đó có các cơ quan và các hạt khơng hồ tan của
tế bào Đó là một dịch rất keo, có hàm lượng protein là 50% Nó chứa rất nhiều những phân tử nhỏ và rất hồ tan Có rất nhiều các hợp chất khác nhau trong một tế bào E.coli nuôi cấy trong môi trường glucoza ví dụ hàng chục loại axit amin, nucleotit, axit béo, vitamin, enzim Trong một tế bào E.coli có tới 800 loại phân tử
khác nhau có phân tử lượng bằng hoặc nhỏ hơn 100 chưa kể những hợp chất đại phan tử như protein và axit nucleic Cho đến ngày nay người ta biết được 200 loại
hợp chất khác nhau trong tế bào E.coli
Một tế bào E coli có chứa 15.000 ribôsôm, chúng làm nhiệm vụ tổng hợp
protein Mỗi một ribosơm có khả năng sản sinh ra 1 phân tử protein
Đối với E.coli cũng như một số tế bào vi khuẩn khác, DNA nằm ở vùng nhân, vùng này khơng có màng bao bọc khác với nhân của tế bào ơcariôt DNA của E.coli là một phân tử có 2 mạch hình vịng chất đống Mỗi một mạch của DNA chứa đựng tất cả những thông tin cần thiết cho sinh trưởng và sinh sản của tế bào Trong quá
trình nhân đôi hai sợi tách nhau ra và chúng dùng để làm mẫu tổng hợp sợi bên kia
Như vậy là một tế bào được phân chia làm 2 tế bào Mỗi một tế bào con= đều mang
trong nó một sợi DNA của tế bào mẹ và một sợi mới tạo ra Trong xitoplazma của
phần lớn các vi khuẩn cịn tìm thấy những đoạn nhỏ DNA hình vịng gọi là plasmid
Những thành phần này được dùng như là những công cụ không thể thay thế trong sinh vật học phân tử và công nghệ di truyền
CẤU TRUC TE BAO OCARIOT
Tế bào ơcariơt có cấu trúc phức tạp, nó chứa rất nhiều các cơ quan được bao bọc
bởi một màng và được chuyên hoá theo từng chức năng
Nhân tế bào có chứa 95% DNA của tế bào và là trung tâm điều khiển của tế bào
Nhân tế bào được bao bọc bởi màng tế bào và có nhiều lỗ Những lỗ này tạo thành một hệ phức tạp xuyên qua lớp vỏ của hạt nhân Cấu trúc phức tạp này điều khiển sự
vận chuyển protein, RNA qua lại trong nhân DNA trong nhân được tập trung thành một khối đậm đặc §ọi là chromatine bởi vì nó bắt màu rất đậm với một số thuốc
Trang 14Nuoleoie (lôi nhá iculum endoplasmic xu xi y „ l ` ⁄ Nhân tế bào
5 Màng của nhân tế bào
Ậ Xitosol ) _ Vacuole Lizosom -_Ñ | Reticulum endopiasmic Š trơn nhấn À Túi Golgi Hình 1.2
a Tế bào ơcariơt lớn hơn nhiều tế bào procariðt, cấu trúc của nó rất phức tạp
(Theo L Shoemaker)
b Ảnh chụp qua kính hiển vi vi điện tử nhát cất tế bào gan chuột cống bạch Những thành phần cơ bản thấy rõ được là : ,
- Hat nhan (N) ~ Mitochondri (M)
- Reticulum endoplasmic (RE)
(Theo K Porter)
Trang 15Chromatin nucleole
* Cáclỗ hổng trên vỏ hạt nhân
(lỗi nhân) Nucleole
(a) (b)
ình 1.3 Nhân tế bào ơcariôi a Hinh vé theo L.Shoemaker
b Ảnh chụp nhát cất hạt nhân của tế bảo tuyến tuy chuột cống bạch qua kính hiển vi điện tử, thấy rõ ;
~ Nhân tế bảo (n)
- Reticulum endoplasmic xù xi (RER) - Mitochondri (M)
- Lõi nhân (NV)
(Theo L Wolfe)
Trang 1614
Mang ngoal / Mang trong
Hình 1.4
Mitochondri nơi mà các hợp chất lipit, gluxit và protit được oxi hố (trong q trình ưa khí)
để sản sinh ra năng lượng;
a Hình vẽ theo L.Shoerriaker
b Ảnh chụp qua kính hiển vị điện tử nhát cắt mitochondri của tế bào tuyến tuy, chuột hoang Thấy rõ :
- Màng kép (MD)
- Rất nhiều crete (C)
- Matric
Trang 17rXitosol
Lỗ hổng trên vỏ nhân
Ribosom
Hinh 1.5 Reticulum endoplasmic xu xi (RER)
Trên bé mặt của xitern của RER gắn nhiéu ribosom, làm nhiệm vụ tổng hợp protein, tích luỹ nó trong lòng mạch rồi mới xuất ra ngoài RER nối liền với màng ngoài của nhân té bao a Hình vẽ theo L.Shoemaker
b Ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử nhát cát RER của tế bảo gan chuột cống bạch
- Những điểm đen nhỏ là ribosem (R) - Bộ máy Golgi (G)
Trang 18
~—Reticulum endoplasmic xu xi
_ Reticulum endoplasmic tran nhấnÌ
| —— Xiterne
| — Lòng mạch
Hình 1.6
Reticulum endoplasmic tron nhấn (REL) tạo thành một hệ thống màng dẫn truyền rộng lớn của tế bào
a Hình vẽ theo L.Shoemaker
b Ảnh chụp qua kính hiển vi REL nhát cất tế bào gan của chuột cống bạch
(Theo G.Palade)
Trang 19Hình 1.7 ;
Bộ máy Golgi liên kết chặt với reticulum endoplasmic lam nhiém vu tich luy,
chế biến, vận chuyển các tiền tố của gluxit và lipit
a Hình vẽ theo L.Shoemaker
b Ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử nhát cất tế bào máu của chuột cống bach Thấy rõ :
- Reticulum endoplasmic xt xi (RER)
- Vùng Xis (RC) của bộ máy Golgi
- Bọng vận chuyển (VT) eT uy
- Tui Golgi (SG) TT act
Theo K.R.Porter) m tt 2
thạo (itu bade Ệ L0 Ị
PHONG MiG |
Trang 20
nhuộm Quá trình nhân đôi của DNA và quá trình sao chép các thông tin cla RNA
đều xảy ra ở trong hạt nhân Quá trình sao chép là giai đoạn đầu tiên nhằm thể hiện các thông tin di truyền, hoạt tính trao đổi đầu tiên diễn ra ở hạt nhân Những vùng khác của hát nhân có độ đậm cao gọi là nucléol Trong nucleol sẽ tiến hành quá trình tổng hợp RNA và lắp ráp các ribosôm
Mitochondri là nơi sản sinh ra năng lượng trong quá trình ưa khí
Mitochondri giống như là hạt nhân, nó có 2 lớp màng bao bọc : màng bên ngoài trơn nhắn còn màng bên trong thì gấp xuống thành nhiều lớp được gọi là cretes Những
màng này thường rất đàn hồi cho nên hình dáng của mitochondri rất khác nhau nhưng nhìn chung nó có dạng hình bầu dục Dịch thể bên trong là matrice Ở đó có rất nhiều ribosơm và nhiều phân tử DNA mạch vịng Mitochondri ơxy hố triệt để gluxit, axit
béo và axit amin, năng lượng giải phóng ra dưới dạng hoá năng và được lưu giữ trong
các phân tử ATP Số lượng mitochondri thay đổi tuỳ theo loại tế bào Ví dụ tế bào gan có chứa từ 800 tới > 2.500 và chiếm khoảng 20% thể tích của tế bào
Tế bào ơcariơt cịn có rất nhiều màng tạo thành một hệ thống truyền dẫn bên
trong những cơ quan chuyên môn Hệ thống này có vai trị trong q trình tổng hợp,
vận chuyển, dự trữ và bài tiết protein
Reticulum endoplasmic (RE) tạo thành một mạng lưới màng liên tục trong tế
bào ơcariôt Những màng này và các phần dịch chứa trong nó có tên là xiterne Xung quanh hạt nhân RE được nối với màng ngoài của hạt nhân Vùng này của RE được ghép nối với ribosôm và đặc trưng cho cái gọi là reticulum endoplasmic xù xì
(RER), ở đây xảy ra quá trình tổng hợp lipit màng và protein xuất ra ngoài Những
chất này sẽ được chuyển qua màng của RE theo dòng của xitirne, ở đó chúng được
chế biến trước khi được xuất ra ngoài tế bào
Reticulum endoplasmic trơn (REL) không chứa nhiều ribosôm, nó tham gia vào q trình tổng hợp lipit đồng thời trong quá trình làm thay đổi và vận chuyển protein được giải phóng ra từ RER
RE nhìn chung liên hệ rất chặt chế với bộ máy Golgi Hệ thống màng của nó bao gồm một loạt các túi Golgi day dịch thể Trong bộ máy Golgi các tiền tố của gluxit và lipit sẽ gắn với protein để tạo thanh glycoprotein và lipoprotein Các bọng bài tiết thường nằm ở sát màng plasmic
Phần lớn các tế bào động vật đều chứa các bọng tiêu hố, đó là những lisosôm
(xuất phát từ tiếng Hy Lạp lisis có nghĩa là phân giải), nó chứa tồn bộ các enzim Lisosơm có khả năng phân giải các phân tử của chính tế bào, ví dụ như các protein,
các axit nucleic cũng như là các vi khuẩn thâm nhập vào tế bào bằng các con đường
khác nhau Những bọng xitoplasmic khác chứa những vật liệu ngoài tế bào Khi tế bào chết, lisosôm sẽ giải phóng ra các enzim, thuỷ phân tất cả các thành phần chết
Trang 21Bộ xương tế bào (Cytosquelette) tao cho nó có hình dáng nhất định Đó là những chất protein tạo thành một lưới có cấu trúc
Cấu trúc của tế bào thực vật có nhiều điểm giống với tế bào động vật
Điểm khác rõ rệt nhất là chloroplast đảm nhận chức năng quang hợp (xem hình 8)
Vacuol được bao bọc bởi một màng đơn giản nó chứa các dịch dự trữ các muối khống, gluxit hồ tan và protein
Xytosol
Nhân cùng với lõi nhâ: (nucleol) tetleulum andopi, lasmlc trơn nhấn
500nm
Hình 1.8
Tế bào thực vật đặc biệt có chioroplast chịu trách nhiệm quá trình quang hop.”
Màng tế bào được cấu tạo từ xenluloza cứng Có các vacuol là những khoảng không lớn, nơi lưu giữ
những phế thải của tế bào
a Hinh vẽ theo L.Shoemaker
b Ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử nhát cắt của tế bào thực vật Spirodela Thấy rõ :
Vacuol (V) Chloroplast (C) Nhân tế bao (N) (Theo K.R.Porter)
Trang 22Chương hai
AXITAMIN_ˆ
Axit amin là thành phần cơ bản cấu tạo thành phân tử protein Phân tử axit amin
có chứa cả chức năng axit và nhóm amin ở vị trí œ so với nhóm COOH
Axit amin có cơng thức tổng qt như sau :
œ
R -CH - COOH NH,
Các loại protein động vật, thực vật, vi khuẩn và virut đều cấu tạo từ 21 loại axit amin khác nhau
PHAN LOAI AXIT AMIN
Axit amin có hai cách phân loại :
- Phân loại theo cấu trúc hoá học - Phân loại theo giá trị dinh dưỡng
I PHAN LOAI THEO CẤU TRÚC HOA HOC
A Axit amin cé mach hidrocacbon
1 Glixin (Gly) hay la glicocol - hay la axit a-amino-axetic
H - CH - COOH NH,
Glixin rất phổ biến trong các phân tử protein, nhất là trong phân tử gelatin Trong phân tử protein sợi tơ tằm, glixin chiếm từ 25% đến 40% tổng các axit amin Glixin còn tham gia vào thành phần của axit mật
Mặt khác glixin còn tham gia vào quá trình giải độc ở gen như trường hợp với
axit benzoic, nó tạo thành hợp chất N-benzoil-glixin rồi thải ra ngoài
2 Alanin (Ala) hay la a-amino - propionic )
CH, =R -COOH cũng là một axit amin rất phổ biến
Trang 23Trong phân tử Co-enzim A còn tồn tại phân tử -alanin
CH,~ CH; - COOH NH,
3 Valin (Val) hay 1a axit œ-amino-izovaleric
CH~ CH ~ CH - COOH
CH; NH), 4 Lơxin (Leu) hay là axit-œ-amino-izocaprovic
CH, ~ CH ~ CH; - CH ~ COOH
CH, ‘NH,
§ Izoloxin (Ile) hay 14 axit a-amino-B-metil-valeric
CH; — CH, - KH - CH — COOH
CH, NH,
Valin, loxin và izoloxin là 3 axit amin mà phần lớn động vật và người không thể tổng hợp được, do đó chúng cần được cung cấp trong thức ăn, vì thế 3 axit amin này được gọi là các axit amin không thay thế
B Axit amin có chứa chức năng rượu
1 Serin (Ser) hay là axit œ - amino - B - hydroxi - propionic
CH,~ CH - COOH
OH NH,
Nhóm OH thường bị este hoá bởi axit phosphoric để tạo thành phosphoserin, đặc trưng cho phân tử phosphoprotein như là vitelin trong lòng đỏ trứng gà
Hà - m - COOH
Q NFL
HO - ĩ =O OH
Một số kháng sinh là dẫn xuất của serin ví dụ như : cloramphenicol, xicloserin,
aZaserin
2 Treonin (Tr) hay là axit œ-amino-B-hydroxi-butiric
CHỊ GH = C= 00H OH NH,
Treonin là axif amin không thay thế đối với người
Trang 24€ Axit amin chứa lưu huỳnh
1 Xistin (Cys) hay là axit-œ-amino mercapto-propionic Khác duy nhất với
serin là ở vị trí OH của nó được thay thế bằng nhóm SH
CH;- CH - COOH th _ = - COOH I | SH NH, bey 4 NH, § NH, | CH, - CH - COOH Xistin
Nhóm thiol (SH) có vai trò quan trọng trong một số enzim Khi nhóm SH bi
phong bế hoặc bị oxy hoá tạo thành cầu disulfur thì enzim mất hoạt tính Sự trùng
hợp tạo thành axit amin xistin
2 Metionin (MeU) hay là axit œ amino-y-mercapto-butiric
CH, — CH, - ie -— COOH
r NH,
CH;
Metionin cũng là axit amin không thay thế đối với người và có trong rất nhiều loại
protein Nó làm nhiệm vụ cung cấp nhóm metil trong nhiều phản ứng khác nhau
D Axit amin có hai chức năng axit và các amit cla nó
1 Axit aspactic (Asp) hay axit amino sucxinic và dạng B-amit của nó là asparagin
HOOC - CH; - CH — COOH ~ — CH, - = — COOH
NH, NH, NH,
Axit aspactic Asparagin
2 Axit glutamic (Glu) hoặc là axit-œ-amino-glutaric và y-amit của nó là
glutamin (Glu)
Y B a
.HOOC -CH; - CH; — va — COOH pe — CH, - CH, - a — COOH
NH, NH, NH,
Axit glutamic Glutamin
Các loại axit aspactic và glutamic rất phổ biến trong các phân tử protein Chúng đóng vai trị quan trọng trong quá trình chuyển amin (transamination) ở các phản ứng sinh tổng hợp axit amin
Trang 25Hai loại axit này thường có hàm lượng tương đương trong nhiều loại protein
Chúng còn giữ vai trò dự trữ nitơ amin dưới dạng glutamin ở người và động vật
E Axit amin kiém tinh
Có 3 loại axit amin kiểm tính :
1 Lizin (Lys) hay là axit œ-e-diamino-caproic, nó có nhóm amin thứ 2 ở vị trí
Lizin là axit amin không thay thế đối với người và động vật
Cs = ou, ~ tH, - ễu, = I8 - COOH
NH, H,
trong một số protein (colagen, gêlatin) người ta tìm thấy hydroxilizin)
2 Arginin (Arg) hay là axit œ-amino-ồ-guanidino-valeric Giống như lizin, arginin
chứa rất nhiều trong các protein kiểm tính trong nhân của tế bào như là histon và prolamin (trong thành phần của một số prolamin, arginin chiếm tới 80, 90%)
Arginin đóng vai trị quan trọng trong chu trình sinh tổng hợp urê trong cơ thể Mặt khác hợp chất arginin-phosphat làm nhiệm vụ dự trữ năng lượng ở loài động vật không xương sống, như là creatin-phosphat ở loại động vật có xương sống
HạN — C — NH ~ CH, ~ CH ~ CH, ~ CH ~ COOH
NH NH,
Nhóm guanidic Arginin
P
BOP Na c- NH — CH, - CH, - chy te (oon
H NH NH;
Arginin-phosphat
3 Histidin (His) hay là axit amin-œ-amino-P-imidazol-propionic hay là
imidazolil-alanin
Chính nhân imidazol đã tạo ra cho histidin tính chất kiểm yếu
C=C- CH; - CH - COOH N NH NH,
\Z⁄
CH
Histidin có rất nhiều trong các phân tử globin
Trang 26G Axit amin có chứa phân tử phenil (axit amin thom)
1 Phenilalanin (phe) hay là axit-œ-amino-B-phenil-propionic
&P - Ch, - GH- COOH
NH,
Phenilalanin là một axit amin không thay thế với người và động vật
2 Tirosin (Tyr) hay là axit œ-amino (para-hydroxi-phenil) - propionic, vì nó có nhóm phenol nên axit này mang tính chất axit yếu
HO -& > —CH,- £H- COOH NH,
Tirosin cùng với triptophan đóng vai trị quan trong trong việc hấp thu tia tử
ngoại (giữa 260 và 290nm)
Tirosin đảm nhận trách nhiệm trong phản ứng xanto-proteic, phản ứng với HNO; tao mau vàng do hợp chất nitrophenol
Chuyển hoá tirosin tạo ra những hợp chất quan trọng như các sắc tố (melanin)
các hoocmon (như là adrenalin, tirosin)
3 Triptophan (Trp) hay là axit œ-amino indol-propionic hay là B-indolil-
alanin
CI | - CH, - cH — COOH NH,
Triptophan cũng là một axit amin không thay thế với người và động vật Nó có một nhân indol Tên của nó xuất phát từ việc sau khi dùng tripsin thuỷ phân protein,
người ta tìm thấy triptophan Thuỷ phân protein bằng axit sẽ phá huỷ hoàn toàn phân tử axit amin này
H Axit amin có mạch vịng khơng đồng nhất
Prolin (Pro) hay là axit pirolidin-2-cacboxilic và dẫn xuất của nó là hydroxi prolin
HO ~ =
[ Ì COOH Ấ 77 COOH
NH NH
Prolin Hydroxi prolin
Hai loại axit amin này chỉ chứa nhóm imin (NH) prolin rất phổ biến trong các protein, còn hydroxi prolin thì có mức độ kém hơn
Trang 27Ngoài 21 loại axit amin phổ biến nêu trên, đôi khi cịn tìm thấy một số loại axit amin hiếm, chúng xuất hiện ở dạng tự do hoặc liên kết trong phân tử protein ví dụ như trong một số peptit có hoạt tính kháng sinh người ta tìm thấy tiroxidin,
gramixidin, baxitraxin
II PHÂN LOẠI THEO GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG
Theo D.Soltner (1987) 21 loại axit amin có thể chia làm 2 nhóm đó là :
- 12 loại axit amin có thể thay thế được và 9 loại axit amin không thay thế : Axit amin không thay thế Axit amin có thể thay thế
1 Treonin 1 Glixin
2 Valin 2 Alanin
3 Loxin 3 Serin
4 Izoloxin 4 Xystein
5 Metionin 5 Xistin
6 Lizin 6 Axit aspactic
7 Phenilalanin 7, Axit glutamic 8 Histidin 8 Ornitin
9 Triptophan 9 Xitrulin 10 Arginin
11 Tirosin 12 Prolin
Đối với gia cầm cũng như gia sức, những nghiên cứu gần đây cho thấy 19 axit
amin có thể được chia làm 3 nhóm, bao gồm :
- 10 axit amin không thay thế
- 3 axit amin bán thay thế
- 6 axit amin có thể thay thế được
Nhóm axit amin không thay thế
1 Arginin 4 Lơxin 7 Phenilalanin 10 Valin
'2 Histidin 5 Lizin ~8 Treonin
3 Izolơxin 6 Metionin 9 Triptophan
Nhóm axit amin bán thay thế Nhóm axit amin có thể, thay thế
1 Xistin 1 Alanin
2 Glixin 2 Axit aspactic
3 Tirosin 3 Axit glutamic 4 Hydroxi prolin
5 Prolin 6 Serin
Trang 28Sở dĩ người ta gọi là bán thay thế bởi vì nếu cơ thể thiếu xistin thì nó có thể
dùng metionin để tổng hợp thành xistin, nếu cơ thể thiếu tirosin thì nó có thể dùng phenilalanin để tổng hợp ra tirosin Vì lẽ đó trong các bảng nhu cầu về axit amin
người ta thường viết metionin + xistin
CÁC TÍNH CHẤT LÝ HỐ HỌC CỦA AXIT AMIN I CÁC TÍNH CHẤT VẬT LÝ CỦA AXIT AMIN
1 Đồng phân quang học
Tất cả các axit amin trừ glixin có hai H ở vị trí :nguyên tử cacbon, tất cả 20 axit
amin cịn lại đều có ngun tử cacbon œ bất đối xứng (có nghĩa là bốn hố trị của nó liên kết với bốn nhóm khác nhau) Ví dụ như ở hình 2.1 biểu diễn cấu trúc không
gian của phân tử alanin ta thấy rõ đồng phân quang học của phân tử là hình ảnh đối
chiếu qua gương cấu trúc khơng gian của nó
no Gown - Công thức Gagne
C g CH i 'C + ` không gian Ả- Ạ ae oma CN if 16% foo *< HO yn H <a? OH HN oor HE NH; SỈ” CH;OH h CH CH;OH - 4 CH,
lên OOH COOH
CHO H-C - OH Cong ints ais Cc luả «LÍ
HO -C-H | ' mặt phẳng H;N -C-H | H-C- NH;
| CH;OH ' ’ | | CH;OH CH, _ €Hạ
L-glixeraldehit D-glixeraldehit L-alanin D-alanin Hình 2.1 Công thức không gian và công thức mặt phẳng của glixeraldehit và alanin
Có thể phân biệt hai dạng đồng phân quang học đó là D và L theo cấu trúc không gian tương đồng với D và L glixeraldehit Cấu trúc không gian thường khó vẽ cho nên người ta chấp nhận công thức trên mặt phẳng theo đề nghị của Fischer
Theo qui ước này thì tất cả các axit amin dạng D đều có nhóm NH; ở phía bên ~phải, các axit amin dạng L thì có nhóm NH; ở phía bên trái
Tất cả các axit amin cấu tạo nên phân tử protein đều thuộc dạng L Song trong
một số loại peptit của vi khuẩn, nhất là những loại có trong thành phần màng tế bào và một số peptit có hoạt tính kháng sinh, người ta tìm thấy các axit amin dạng D
Trang 292 Khả năng hấp thu tỉa tử ngoại
Các axit amin có khả năng hấp thu tia tử ngoại có độ dài bước sóng là 230nm Một số axit amin khác có khả năng hấp thu tia tử ngoại có bước sóng 250 đến 300nm là vì trong mạch R của nó có chứa gốc phenil (như tirosin) hoặc là nhân indole (như là triptophan) Nhờ tính chất này, nếu ta có dung dịch protein khơng
mầu, ta có thể xác định hàm lượng của nó bằng máy quang phổ tử ngoại 3 Sự ion hoá các axit amin
Tất cả các axit amin đều có 2 nhóm có thể dễ dàng bị ion hoá đó là nhóm COOH
va nhém NH)
Một khi ta thay đổi độ pH của một dung dịch axit amin từ axit sang kiểm thì cấu
trúc của phân tử axit amin thay đổi như sau :
-H* -H†
*HạN - lấy -COOH => *H3N- “ -COO —— H;N - i - COO™
R +H* R +H* R
Cation (pH axit) Zwitterion Anion (pH kiém)
dién tich = +1 điện tích = 0 điện tích = -l
Khi đạt đến độ pH nào đó phân tử axit amin có 2 cực (Zwitterion) và có điện
tích bằng 0 đó chính là điểm đẳng điện của phân tử axit amin Ở điểm này độ hoà tan là tối thiểu, nếu đặt trong môi trường điện di, các phân tử cũng không chuyển
động `
Người ta có thể dễ dàng nghiên cứu độ phân ly của các phân tử axit amin bằng
cách bổ sung các dung dịch HCI và NaOH, sau đó đo độ pH sau mỗi lần bổ sung Bằng cách này người ta có thể vẽ được đường cong chuẩn độ, nhờ đó ta phân biệt
axit amin trung tính, kiểm tính và toan tính
II MỘT SỐ TÍNH CHAT HOÁ HỌC CỦA AXIT AMIN
1 Phản ứng với nhóm amin
Đối với các axit amin có gốc là phân tử phenil sẽ phản ứng với dinitrophenil (DNP)
Người ta dùng phản ứng này xác định axit amin từ đầu N của phân tử protein
O;N, ~ NO; O;N._ om
—-OC-CH-NH, + F~ —> -OC - CH - NH” + FH
| |
R R -
Trang 30Phản ứng của 1-fluoro 2-4-dinitrobenzen với nhóm amin của axit amin đầu N
của phân tử protein
2 Phản ứng với ninhidrin R-CH-COOH NH, H;ạO oO I m 3 R-C-COOH R-C- COOH wt H Oo Ser NH oO Y’~sc~ OH NH; CO; tl O oO H II R-C 7 HO Cc % XO aldehid H” ~C oO i oO I i l Z CL OH ⁄ vả 5 N yh II AS on Ñ Ne ~ c ` c’ \A hig oO i Ï 3H;O Oo Oo
Sản phẩm có màu xanh da trời
Qua phản ứng thấy rõ phản ứng này xảy ra theo nhiều giai đoạn Sản phẩm cuối cùng tạo ra có màu xanh da trời
Độ thấm, nhạt của dung dịch mầu tuỳ thuộc vào nồng độ axit amin Ngày nay người ta dùng phản ứng này để định lượng các axit amin trong máy phân tích axit amin tự động với độ nhạy cao
Trang 31Chương ba
CẤU TRÚC BẬC MỘT CỦA PEPTIT VÀ PROTEIN
Từ “protein” xuất phát từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là điều quan trọng thứ nhất Thực tế, protein là thành'phần rất quan trọng của tế bào sống Nếu tính theo vật chất khô, protein chiếm một tỷ lệ khá lớn (tuỳ thuộc vào loại cơ thể sống) trong thành phần các cơ thể sống Protein đóng vai trị cấu trúc cơ bản của sự sống Toàn bộ quá trình trao đổi chất là nhờ các hoạt động enzim, mà các enzim đều có bản chất là
protein f
Trong thành phân protein có 4 nguyên tố chính là C, H, O và N, rất nhiều
protein có chứa lưu huỳnh và một số ít protein chứa phospho Hàm lượng N trong các phân tử protein động vật thường là 16%, tỷ lệ này thay đổi từ 16,5 đến 19%
trong các nguồn protein thực vật
Song ngày nay người ta chấp nhận tỷ lệ 16% là chung cho tất cả các nguồn
protein do đó chỉ cần xác định lượng N rồi nhân với hệ số 100/16 = 6,25 ta thu được
hàm lượng protein thô
Protein là hợp chất có phân tử lượng lớn bao gồm các axit amin Protein được
phân chia làm 2 nhóm chính :
- Holoprotein - phân tử của nó chỉ bao gồm các axit amin ví dụ như albumin
trứng gà (lòng trắng trứng gà)
- Heteroprotein - phân tử của nó ngồi các axit amin cịn có nhóm prostetic có nguồn gốc gluxit, lipit
Axit nucleic và nhiều thứ khác ví dụ như nucleoprotein trong hạt nhân tế bào, hemoglobin trong máu v.v Trong phân tử protein hay peptit, các axit amin nối liền
với nhau bằng mối liên kết peptidic Mối liên kết này có một tương đồng trong phân
tử biuret khi tiến hành trùng hợp 2 phân tử urê tạo ra
NH;-CO-NH; + NH,-CO-NH; + NH, + NH;-CO-NH-CO-NH,
Chính vì lẽ đó khi bổ sung CuSO, và dung dịch polipeptit trong môi trường kiểm
sẽ tạo thành màu xanh lục - ta gọi là phản ứng biuret Peptit được chia làm 2 loại :
- oligopeptit - bao gồm dipeptit (2 gốc axit amin) tripeptit (3 gốc axit amin) thường không cho phản ứng biuret
Trang 32- polipeptit, bắt đầu từ tetrapeptit (bao gồm 4 gốc axit amin) đều cho phản ứng
biuret
Độ lớn của phân tử polipeptit là bao nhiêu thì được gọi là phân tử protein là chưa
thật rõ ràng Thông thường những phân tử polipeptit có phân tử lượng lớn hơn
10.000 và không vượt qua được màng xelophan thì được gọi là phân tử protein
Một khi đã tách chiết được một phân tử protein hay một peptit thì trước tiên cần
phải nghiên cứu thứ tự các axit amin trong phân tử đó như thế nào - đó chính là cấu
trúc của phân tử protein hay peptit
1 NGHIÊN CỨU THANH PHAN AXIT AMIN
1 Thuy phan protein
Để cắt mạch peptit, có thể dùng axit, kiểm hoặc các enzim Người ta không thể dùng enzim để thuỷ phân hoàn toàn một phân tử protein Thuỷ bằng kiểm sẽ làm
biến dạng hoặc thay đổi cấu trúc của một số axit amin Có thể thuỷ phân protein trong dung dịch 6N HCI ở 105°C trong ống nghiệm hàn kín hút chân khơng hoặc
trong môi trường nitơ với nồng độ protein rất thấp :ừ 0,5 đến 1% trong thời gian 24
giờ Phương pháp này cũng có những nhược điểm là làm chuyển hoá glutamin và
asparagin thành các axit dicarboxylic tương ứng đồng thời phá huỷ cả tryptophan Để xác định triptophan ta phải dùng axit methane-sulforic thuỷ phân Cũng có thể
thuỷ phân bằng kiểm để xác định triptophan
2 Phân tích axit amin
Ngày nay để xác định các axit amin người ta dùng 3 loại phương: pháp sắc ký và đã được tự động hóa gần như hồn chỉnh
a) Sắc ký trên như trao đổi ion
Phương pháp này cho phép phân chia các axit amin thành 3 nhóm :
- Các axit amin toan tính Sẽ được nhựa trao đổi anion như Dowex2, Amberlite
IRA-400 lưu giữ lại
Nhựa -NH;°OH' + R-COOˆ -› Nhựa -NH;° OOC-R + OH-
- Các axit amin kiểm tính sẽ được các nhựa trao đổi cation (như Dowex 50 hay
là Amberlite IRC 50) lưu giữ
Nhựa -§SO; -Na°+R-NH;`” -> Nhựa -SO; *HạN-R + Na!
Trang 33Stein và Moore lần đầu tiên đã dùng nhựa polistiren sulfonê (SO; Na’) ở độ pH
thấp, tất cả các axit amin đều ở dưới dạng cation (R-NH;") và được lưu giữ trên
đỉnh cột
Dung dịch protein sau khi thuỷ phân, lọc sạch rồi đưa lên cột, dùng các dung
dịch đệm xitrat có độ pH và lực ion táng dần để tách các axit amin khỏi cột Các axit amin tách ra tạo thành các tiểu phần, dùng thuốc thử ninhidrin để định lượng hàm lượng từng axit amin trong mẫu Kết quả thu được sẽ do máy tự động ghi trên
băng giấy dưới dạng các pic
Qua hệ thống máy tính, diện tích các pic sẽ được thể hiện bằng số lượng tuyệt đối các axit amin
Sắc ký đồ của một mẫu hỗn hợp các axit amin Mậđộ # quang học Tv Se Tyr Phe Gu Xis i val : ! Io Lew i " q N Lys His Pro NH; IA 5 —> *% *% pH3,25 pH4,25 pH 5,28
0,2 M xitrat Na 0,2M xytrat Na 9,35 M xitrat Na
Hình 3.1
Bằng phương pháp sắc ký cột với nhựa trao đổi ion polystiren sulfanat (ví dụ như Dowex 50) đã tách được
các axit amin khác nhau từ dịch thuỷ phân protein Aspartat có mạch nhánh axit nên xuất hiện đầu tiên
Trong khi đó arginin có mạch nhánh kiềm, xuất hiện cuối cùng
Trên nguyên tắc của stein và Moore, ngày nay người ta tạo ra nhiều máy tự động khác nhau để phân tích thành phần axit amin
b) Sắc ký khí Phương pháp này mới được phát hiện gần đây dùng để tách hỗn
hợp các axit amin Trong phương pháp này người ta phải chuyển tất cả các axit amin
sang dạng bay hơi bằng các phản ứng hoá học lên các cực của nó Ví dụ, metil hố
các nhóm amin, dùng rượu hoặc phenol este hố các nhóm COOH Sau đó chúng
được thổi qua một ống dài 2 m, đường kính 0,1mm, phía trong của ống được bao phủ bằng một màng chất lỏng Ống này được nung nóng lên 100 đến 200°C Các axit amin một phần được hoà tan trong phase lỏng không bay hơi, và một phần bay
hơi Khí mang (gaz vector) sẽ kéo theo các axit amin ra khỏi ống với tốc độ khác
nhau phụ thuộc vào độ hoà tan của chúng trong phase lỏng Có nhiều loại máy sử
Trang 34
dụng nguyên lý này để xác định hàm lượng axit amin Độ nhạy của máy đạt đến
mức độ picomole (picomole = 10”? mol)
e) Sắc khí hấp thụ
Phương pháp này mới được phát hiện gần đây, đó là sắc ký hấp thụ dạng lỏng-
chắc với độ phân giải cao với tên "Sắc ký lỏng hiệu năng cao” (High performance
liquide chromatography) Đơi khi cịn gọi là "Sac ky long cao 4p" (HPLC)
Tất cả các axit amin được chuyển thành dẫn xuất aromatic bằng các phản ứng
hoá học Edman
PP |
“me -CO-CH-NH+CO-CH-NH;| + N-CạH;
Mạch peptidic Phenilthio izoxianat
Re -CO - CH - NH £=8 HN - C,H; Rạ R,- CH - NH -CO - CH - NH, <COL,C=S N - CyHs Phenilthiohidantoine
Những dẫn xuất này được hấp thu trên cột hạt silic (hạt silic hình cầu có đường kính 5um) Nhóm OH của axit amin dugc thay thé bang mach hydrocacbon C18
Pha này rất ky nước (hydrophobe) lưu giữ dẫn xuất aromatic phụ thuộc vào tính ky nước của gốc R Dùng dung môi nước - axetonitril để tách các axit amin ra rồi định
lượng bằng quang phổ tử ngoại Độ nhậy của phương pháp đến picomole Ngày nay người ta đã lắp thêm máy vi tính để tự động quá trình và cho ra kết quả phân tích
ngay Thời gian phân tích một mẫu hỗn hợp các axit amin khoảng 25 đến 30 phút
Trong khi đó nếu dùng phương pháp nhựa trao đổi ion thì phải mất gần 10 giờ để có
thể phân tích hỗn hợp 17 axit amin
THỂ HIỆN KẾT QUẢ
Kết quả phân tích thành phần axit amin có thể được thể hiện bằng 2 cách chính sau : - Tính hàm lượng axit amin trong 100g protein hoặc tính hàm lượng từng axit amin trong Ikg mẫu đem phân tích (ví dụ 1kg gạo, 1kg ngô, lkg bột cá, 1kg khô
dầu đỗ tương v.v )
Trang 35- Khi biết rõ phân tử lượng của phân tử protein mà ta đem phân tích, kết quả thu
được sau khi làm trịn số có thể biết được trong phân tử protein có bao nhiêu gốc
các axit amin Ở đây dùng từ "gốc" axit amin vì khi tạo thành mạch polipeptit thì cứ
mỗi axit amin (trừ các axit amin đầu và cuối) sẽ giảm bớt một phân tử nước Ví dụ phân tử protein œ-corticotrophin của cừu có cơng thức thô như sau : Ala 3, Arg3,
Asp2, Glu5, Gly3, His1, Leul, Lys4, Metl, Phe3, Pro4, Ser 3, Trp1, Tyr2, Val3
II NGHIEN CUU THUTUCAC AXIT AMIN TRONG MACH POLIPEPTIT
VA PHAN TUPROTEIN
Trên nguyên tắc một mạch polypeptit bao giờ cũng tồn tại 2 đầu, một đầu NH2 và đầu kia là nhóm COOH Nếu trong phân tử protein ta tìm thấy 2 đầu NH; và 2 đâu COOH, có nghĩa là nó bao gồm 2 mạch polipeptit ; nếu khơng tìm thấy một đầu nào, có nghĩa là phân tử protein này có mạch polipeptit cấu trúc vịng, nếu tìm thấy 1 đầu (NH; hay COOH) có thể kết luận phân tử này có cấu trúc bán vịng ; cịn nếu tìm thấy 2 đầu thì rõ ràng là phân tử protein chỉ gồm một mạch polipeptit duy nhất
SA ¬ ~
1 mạch polipeptit
Mạch vòng Mạch bán vịng
Hình 3.2 Sơ đồ cấu trúc hình thái phân tử protein
Mạch polipeptit có cấu trúc tổng quát như sau :
h Re Rs th
NH;-CH-CO-NH-CH-CO NH-CH-CO-NH-CH-COOH
a a
Rõ ràng là mỗi một mạch polipeptit đều có một nhóm NH; ở vị trí œ tự do và một nhóm COOH cũng ở vị trí œ tự do Bắt đầu bằng nhóm NH; ta gọi là đầu N và bắt đầu bằng nhóm COOH ta gọi là đầu C Do đó khi xác định thứ tự các axit amin
trong mạch polipeptit có thể bát đầu từ đầu N hoặc từ đầu C
1 Xác định axit amin trong mach polipetit tir dau N
Có nhiều phương pháp xác định nhóm œ-amin (œ-NH;) tự do, song trong cuốn sách này chỉ giới thiệu 3 phương pháp gồm : 2 phương pháp hoá học và một phương
pháp enzim i
Trang 36a) Phương pháp dinitrophenil-aminoaxit của Sanger
Khi nghiên cứu tính chất hố học của axit amin ta đã thấy rõ nhóm œ-amin có thể trùng hợp với dinitrofluobenzen Trong mạch polipeptit chỉ có một nhóm œ-amin tự do
Ở đầu N, khi trùng hợp sẽ tạo thành dinitrophenil-polipeptit Mối liên kết này rất
vững bến, do đó khi ding HCI dé thuỷ phân protein sẽ giải phóng ra tất cả các axit amin tự do cùng với axit amin nằm ở đầu N dưới dạng dinitrophenil-aminoaxit
(DNP-aminoaxit) Sau đó bằng phương pháp sắc ký có thể dễ dàng nhận biết tên của
axit amin đó ‘
b) Phương pháp phenilthiolidantoin của Edman
Về nguyên tắc của phương pháp này có dịp để cập ở phần trước Sơ đồ phản ứng
như sau :
Mạch polypeptit + phenilthioxianat —> phenilthiodantoin + mạch polipeptit
với đầu N là axit amin tiếp theo Khác với phương pháp trước phải thuỷ phân hoàn toàn phân tử protein để giải phóng ra axit amin đầu N Phương pháp này cho phép sau khi polipeptit phản ứng
với phenilthioxianat ở đầu N và làm cho mối liên kết peptit giữa axit amin đầu N với mạch polipeptit trở nên yếu, do đó dễ dàng bị tách ra khi đưa hỗn hợp vào môi
trường axit, đồng thời giải phóng nhóm œ-NH; của axit amin kế tiếp nó (xem phản
ứng) Nếu coi axit amin đầu N là thứ nhất thì sau phản ứng này sẽ tạo ra nhóm a-
amin tự do của axit amin thứ 2 Sau khi tách khỏi mạch polipeptit, bằng phương
pháp sắc ký có thể nhận biết được axit amin ở đầu N
Tiếp tục dùng phenilthioxianat để phản ứng với axit amin thứ 2 rồi lại tách ra và nhận biết bằng sắc ký
Phương pháp này gọi là phương pháp phân giải phản hồi, dùng nó có thể xác định thứ tự của các axit amin bắt đầu từ đầu N Ngày nay quá trình này đã được tự động hố
trong máy có tên là "Máy xác định thứ tự của các axit amin" (Sequenator) ©) Xác dịnh thứ tự các axit amin bằng enzim aminopeptidaza
Enzim này chỉ thuỷ phân mạch peptit của axit amin đứng ở đầu N Sau khi tách
được axit amin thứ nhất nó sẽ giải phóng ra axit amin thứ 2 với nhóm NH; tự do
7 1
CO-CH-NH-CO-CH-NH + CO-CH= NH, + H,O
Trang 37Bằng phương pháp này có thể xác định được thứ tự các axit amin từ đầu N, song
tốc độ của phản ứng chậm do đó khó có thể dùng để xác định đây đủ thứ tự các axit
amin trong một mạch polipeptit xuất phát từ đầu N
2 Xác định axit amin từ đầu C
Có hai phương pháp xác định polipeptit từ đầu C
a) Phuong pháp dùng hidrazin
Khi xử lý phân tử protein với hidrazin ở 100°C, tất cả các mạch peptit của nó bị
cắt đứt, tất cả các gốc axit amin được chuyển thành phân tử hidrazit trừ axit amin
nằm ở đầu C được giải phóng ra dưới dạng tự do, sau đó tách ra và nhận biết nó
bằng phương pháp sắc ký
[(HIN-CH-CO), -NH-CH-COOH) + (H;N-NH;)„ >
R R'
phân tử protein hidrazin
(H;N-CH-CO-NH-NH;)n + ĐỌNG HA CON
1
R R' hidrazit axit amin tu do
b) Xác định thứ tự các axit amin từ dầu C bằng enzim cacboxipeptidaza
Đây là một phương pháp tuyệt vời để xác định axit amin từ đầu C Enzim cacboxipeptidaza của tuyến tụy thủy phân axit amin ở đầu C rồi giải phóng axit
amin kế tiếp
hộ Bộ bẻ
~CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO - NH-CH-COOH + H;O
Enzim cacboxipeptidaza
i Ry R› Ms
~CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-COOH + NH;-CH-COOH
Phương pháp này cịn có tên là "phương pháp phân giải phản hồi” Tuy nhiên không thể dùng enzim cacboxipeptidaza để xác định đẩy đủ thứ tự các axit amin
trong một mạch polipeptit Vì có một số mối liên kết peptit giữa những axit amin
khác nhau, đồi hỏi một thời gian khá lầu để enzim có thể thuỷ phân được
Cả hai phương pháp dùng enzim aminopeptidaza và cacboxipeptidaza chỉ cho kết quả tốt khi phân tử protein chỉ bao gồm một mạch polipeptit Trường hợp phân tử
protein bao gồm nhiều mạch polypeptit thì kết quả thuỷ phân bằng enzim sẽ cho
nhiều axit amin khác nhau
Trang 383 Số lượng các mạch polipeptit trong phân tử protcin
Khi phân tích các nhóm đứng đầu của mạch polipepit trong một phân tử protein, sẽ xây ra hai trường hợp như sau :
- Các mạch polipeptit giống nhau (do đó chỉ tìm thấy một axit amin ở đầu N và
một axit amin ở đầu C) Do đó chỉ cần xác định thứ tự các axit amin của một mạch
polipeptit ta có thể biết được cho toàn bộ phân tử protein
- Trường hợp thứ hai là : tìm thấy số axit amin đầu N và dau C nhiều hơn 1, điều đó có nghĩa là phân tử protein bao gồm từ 2 mạch polypeptit (nếu là 2 axit amin đầu N và 2 axit amin đầu C) hoặc nhiều mạch polipeptit (nếu tổng số các axit amin đầu
€ và đầu N nhiều hơn 2)
Việc đầu tiên trong trường hợp này là phải tiến hành tách các mạch polipeptit sau đó tiến hành phân tích thứ tự các axit amin của từng mạch polipepUit
Phương pháp tách các mạch polipeptit tuỳ thuộc vào mối liên kết giữa các mạch đó Ví dụ, nếu các mạch liên kết với nhau bằng lực ion, hydro hay Vander Waals thì
chỉ cần thay đổi độ pH hay thay đổi lực ion, hoặc dưới tác dụng của một số hoá chất
như urê, guanidin thì có thể tách được các mối liên kết này Trường hợp là các mối liên kết disulfit qua gốc xystein
Ví dụ :R-S-S-R'-> R-SO;H + R-§SO;H
thì phải tiến hành bằng phương pháp oxi hoá Sau khi các mạch polipeptit đã được
tách ra, dùng phương pháp tách tiểu phần đẻ thu nhận từng mạch riêng biệt 4 Xác định thứ tự các axit amin trong mach polipeptit
Trên đây đã nghiên cứu các phương pháp xác định thứ tự các axit amin từ đầu C và từ đầu N Tuy vây các phương pháp này chỉ có thể xác định được một mạch polipeptit gồm một số gốc axit amin nhất định Do đó muốn xác định thứ tự các axit amin trong một mạch polipeptit dài, người ta phải thuỷ phân mạch đó thành những đoạn nhỏ dipeptit, tripeptit Xác định thành phần các peput nhỏ rồi lấp ghép các mạch peptit với nhau theo nguyên tắc trị chơi "đơminơ”
Ví dụ ta có một hexapeptit có công thức chung là AB;C;D Theo phương pháp DNP-amino axit của Sanger cho biết A là axit amin đầu N Bằng phương pháp cacboxipeptidaza xác định được B là axit amin ở đầu € và tiếp đó là axit amin C Từ
kết quả này cho phép xác định bước đầu thứ tự các axit amin như sau :
A(BCD)CB
Sau đó dùng các phương pháp hoá học hoặc các enzim để tách hexapeptit thành
Trang 39Tác nhân cắt mạch polipeptit Vị trí mạch peptit bị cắt
Hoá chất
- Xyanogen bromit Nhóm cacboxIl của metionin
- Hydroxilamin Mối liên kết giữa arginin-glizin
- 2 nitro-5-thioxianobenzoat Liên kết peptit cạnh gốc xistein
Cac enzim =
- Tripsin Nhóm cacboxil của lizin và arginin
- Clostripain Cacboxil cia arginin
- Proteaza cua staphicocus Cacboxil cia aspartac va glutamat
Dùng phương pháp điện di, sắc ký trên cột trao đổi ion có thể tách được các
peptit đó, sau đó tiến hành xác định thành phần các axit amin rồi tiến hành lấp ghép
như sau : Từ các dineptit (A-C | c-D D-B B-C G=B Tir tripeptit ae D=B=C Công thức cuối cùng Á-C-D-B-C-B
5 Mot số thành tựu của việc nghiên cứu thứ tự các axit amin trong mạch
polipeptit
Sanger - nhà sinh hoá người Anh đầu tiên trên thế giới đã xác định đây đủ thứ tự các axit amin của phân tử protein - insulin Cơng trình này tác giả phải tiến hành trong 10 năm và ông đã nhận được giải thưởng Nobel vào năm 1956 Ngày nay
người ta đã biết được thứ tự các axit amin của rất nhiều phân tử protein khác nhau
như các hoocmon: oxitoxin, vasopressin, glucagon ; các enzim: lisozim,
ribonucleaza ; globin; xitochrom C
Các axit min kết hợp trong phân tử polipeptit theo bất kỳ thứ tự nào Ví dụ chỉ
có 3 axit amin ABC ta đã có 6 mạch polipeptit khác nhau là:
Trang 40Trong tự nhiên có 21 loại axit amin, do đó số lượng phân tử protein có cấu trúc khác nhau là rất lớn Vấn đề này ta sẽ nghiên cứu kỹ khi tìm hiểu về quá trình sinh
tổng hợp protein trong cơ thể sinh vật
6 Khả nang hấp thu axit amin
Khi các axit amin đã được điều chế tinh khiết, thì có thể dùng chúng tiêm
truyền trực tiếp vàớ cơ thể người hoặc động vật Ngày nay người ta có thể dùng hỗn
hợp các axit amin bao gồm từ 11 đến 18 loại khác nhau với những tên thương phẩm khác nhau, song thông dụng được gọi với từ dân dã là dung dịch đạm Ví dụ như Bes(amin 5% của Cộng hoà liên bang Đức, hoặc Moriamin của Nhật
Dưới đây là thành phần của dung dịch Bestamin 5% dùng để tiêm truyền tĩnh mạch có thành phần bao gồm 5% axit amin trong dung dịch Sorbitol 50 g/lit
CH;OH | H-C- OH HO -C-H H-C-OH H-C-OH CH,OH Sorbitol
Sorbitol 1A dudng glucoza ma nhém aldehit được chuyển thành chức năng rượu (OH)
Các axit amin gồm có :
Tên Số lượng tính | Tên Số lượng tính axit amin bằng g axit amin bang g
L- Isoloxin 2,38 L- Ornitin 0,76
L- Loxin 3,62 L- Serin 1,15
L- Lizin 4,44 L- Axit aspartic 2,74
L- Metionin 2,34 N- Axetil - L-Xistein 0,34
L- Phenilalanin 2,70 | Sorbitol 50,00
L- Treonin 2,50 Axelat Na.3H,O 3,47
L- Triptophan 0,88 NaCl 0,146 L- Valin 2,80 NaOH 0.808
L- Arginin 6,00 J— Axetat K ¡ 1,649