NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẬT LIỆU NANO ULVAN POLYSACCHARIDE TỪ ULVAN POLYSACCHARIDE TRONG RONG LỤC, HƯỚNG ĐẾN ỨNG DỤNG LÀM CHẤT DẪN THUỐC TRONG Y SINH

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NHA TRANG BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI THUỘC CÁC HƯỚNG KHCN ƯU TIÊN CẤP VIỆN HÀN LÂM KHCNVN TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẬT LIỆU NANO ULVAN POLYSACCHARIDE TỪ ULVAN POLYSACCHARIDE TRONG RONG LỤC, HƯỚNG ĐẾN ỨNG DỤNG LÀM CHẤT DẪN THUỐC TRONG Y SINH Mã số: VAST03.04/15-16 Hướng KHCN: Khoa học vật liệu (Mã hướng: VAST03) Đơn vị chủ trì:Viện Nghiên cứu Ứng dụng Cơng nghệ Nha Trang Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Trần Thị Thanh Vân NHA TRANG, 2017 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NHA TRANG BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI THUỘC CÁC HƯỚNG KHCN ƯU TIÊN CẤP VIỆN HÀN LÂM KHCNVN TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẬT LIỆU NANO ULVAN POLYSACCHARIDE TỪ ULVAN POLYSACCHARIDE TRONG RONG LỤC, HƯỚNG ĐẾN ỨNG DỤNG LÀM CHẤT DẪN THUỐC TRONG Y SINH Mã số: VAST03.04/15-16 Xác nhận quan chủ trì đề tài NHA TRANG, 2017 Chủ nhiệm đề tài MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ v vii Mở đầu CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Sulfate polysaccharide từ rong lục 1.2 Rong lục chi Ulva Ulvan 1.2.1 Rong lục chi Ulva 1.2.2 Ulvan : Thành phần hóa học, cấu trúc ứng dụng 1.3 Nanogel 1.3.1 Định nghĩa nanogel 1.3.2.Cơ chế hình thành nanogel 1.3.3 Phương pháp điều chế nanogel 1.4 Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực Đề tài 1.4.1 Ngoài nước 1.4.2 Trong nước 11 11 12 13 17 17 25 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu: 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân tích thành phần hóa học mẫu rong thu thập 2.2.2 Xây dựng quy trình tách chiết ulvan polysaccharide từ loài rong lục thuộc chi ulva 2.2.3 Xây dựng quy trình chuyển hóa ulvan polysaccharide thành nano ulvan polysaccharide 2.2.4 Nghiên cứu cấu trúc hóa học cấu hình khơng gian sản phẩm ulvan polysaccharide nano ulvan polysaccharide 2.2.5 Thử hoạt tính sinh học ulvan polysaccharide nano ulvan thu 2.2.6 Đánh giá hiệu việc nano hóa định hướng cho khả dẫn 28 28 28 28 4 29 31 33 34 37 thuốc CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu thập số loài rong lục thuộc 02 chi ulva chi 38 38 Enteromorpha phân tích thành phần hóa học mẫu rong thu thập 3.2 Xây dựng quy trình tách chiết ulvan polysaccharide từ loài rong lục thuộc chi ulva 43 3.2.1 Phân tích thành phần nguyên liệu 3.2.2 Đánh giá yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết polysaccharide 44 44 3.2.3 Tối ưu hóa điều kiện chiết ulvan 3.2.4 Đề xuất quy trình 3.3 Xây dựng quy trình chuyển hóa ulvan polysaccharide thành nano ulvan polysaccharide từ loài rong lục thuộc chi ulva làm 47 50 53 nguyên liệu điều chế chất dẫn thuốc 3.3.1 Thủy phân ulvan polysaccharide 3.3.2 Axetyl hóa ulvan polysaccharide thủy phân 3.3.3 Phân tích phổ huỳnh quang AcU EU 3.3.4 Ảnh hưởng nồng độ polyme amphiphilic (AcU) lên kích thước hạt nanogel zeta 3.3.5 Thử nghiệm nanogel ulvan mang curcumin 3.4 Nghiên cứu cấu trúc hóa học cấu hình khơng gian sản phẩm ulvan polysaccharide nano ulvan polysaccharide 3.5 Hoạt tính sinh học ulvan Acetyl ulvan (AcU) 3.5.1.Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 3.5.2 Hoạt tính gây độc tế bào 3.5.3 Hoạt tính chống oxy hóa 3.6.Đánh giá hiệu việc nano hóa định hướng cho khả dẫn thuốc CHƯƠNG CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 54 57 59 62 63 71 84 84 86 89 90 94 97 100 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13 C- NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C H- NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H AOAC : Hiệp hội hóa học phân tích COSY : Phổ tương tác chiều đồng hạt nhân 1H-1H CS% : % tế bào sống sót DA : Mức độ acetyl hóa DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ESI -MS Gal GlcA GPC : Phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử : Galactose : Glucuronic acid : Sắc ký thẩm thấu gel Hela :Ung thư cổ tử cung Hep-G2 : Ung thư gan người HMBC : Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HSQC IC50 IdoA IR J (Hz) MALDI-MS Man MBC MCF-7 MIC NCI NOESY OD PIC-NGs : Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết : Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm : Iduronic acid : Phổ hồng ngoại : Hằng số tương tác : Phổ khối lượng ion hóa hấp thụ laze : Mannose : Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu : Ung thư vú người : Nồng độ ức chế tối thiểu : Viện Ung thư Quốc gia Hoa kỳ : Phổ tương tác không gian đồng hạt nhân 1H-1H : Mật độ quang học Polyion complex nanogels Rha : Rhamnose SAXS : Tán xạ tia X góc nhỏ SEM : Hiển vi điện tử quét SP : Sulfate polysaccharide TFA : Trifluoroacetic acid TMS : Tetramethylsilane UL : U lvan chiết từ rong lục Ulva lactuca AcU : Ulvan acetyl hóa từ UL UR : Ulvan chiết từ rong lục Ulva reticulata UroA : Uronic acid WHO : Tổ chức y tế giới Xyl : Xylose δ (ppm) : Độ dịch chuyển hóa học DANH MỤC BẢNG STT 01 Tên bảng Trang Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học polysaccharide dạng ulvan chiết 21 02 từ số loài rong lục thuộc chi rong Ulva Chaetomorpha Bảng 2.1 Danh sách loài rong địa điểm thời gian lấy mẫu 28 03 Bảng 2.2: Các yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết 30 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 polysaccharide Bảng 3.1 Các loài rong lục sử dụng làm nguyên liệu sinh học để điều chế SPs Bảng 3.2 Thành phần hóa học rong lục Bảng 3.3 Thành phần polysaccharide rong lục Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất chiết polysaccharide Bảng 3.5 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu:dung môi đến hiệu suất chiết polysaccharide Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian chiết đến hiệu suất chiết polysaccharide Bảng 3.7 Ảnh hưởng pH đến hiệu suất chiết polysaccharide Bảng 3.8 Các yếu tố khảo sát điều kiện chiết tối ưu Bảng 3.9 Kết thí nghiệm tối ưu hóa theo phương án CCF Bảng 3.10 Phân tích phương sai kết thí nghiệm tối ưu hóa Bảng 3.11 Kết xác định khối lượng phân tử ulvan Bảng 12 Ảnh hưởng nồng độ polyme amphiphilic lên kích thước hạt zeta hạt Bảng 3.13 Các đỉnh đặc trưng phổ IR AcU AcU-Cur Bảng 3.14 Kết phân tích phổ IR ulvan chiết từ rong ulva lactuca Bảng 3.15 Kết phân tích phổ 1H 13C-NMR UL Bảng 3.17 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ulvan chiết từ 02 loài rong Ulva reticulata (UR) Ulva lactuca 38 41 42 45 45 46 47 47 48 49 55 62 67 72 79 85 20 (UL) AcU Bảng 3.17 Kết thử độc tính dòng tế bào ưng thư 88 ulvan chiết từ rong lục Ulva lactuca 21 Bảng 3.18 Kết thử độc tính dòng tế bào ưng thư ulvan chiết từ loài rong Ulva reticulata 88 22 Bảng 3.19 Kết thử độc tính dòng tế bào ưng thư AcU 89 22 Bảng 3.20 Kết thử hoạt tính chống oxy hóa ulvan 90 DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ STT Tên hình đồ thị Trang 01 Hình 1.1 Sơ đồ biểu thị phân bố lồi rong lục có sulfate polysaccharide 02 Hình 1.2 Cấu trúc chuỗi mạch ulvan 03 Hình 1.3 Cơ chế tạo hydrogel ulvan qua a) Ca2+ borate ester phần b) carboxylate c) sulfate Hình 1.4 Nanogel điều chế dựa vào tương tác tĩnh điện polymer Hình 1.5 Hai phương pháp điều chế nanogel Hình 1.6 Nanogel điều chế từ polymer biến tính chứa gốc kỵ nước 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hình 1.7 Quá trình hình thành nanogel CHPOA-PEGSH Hình 1.8 Cấu trúc hóa học ulvan từ rong lục Ulva pertusa Hình 1.9 Cấu trúc sợi nano hình thành tác dụng Ulvan với PVA poly(vinyl alcohol) / H3BO3/Ca2+ thông qua liên kết hydrogel Hình 2.1: Sơ đồ quy trình tách chiết polysaccharide điện tích Hình 3.1 Hình ảnh số lồi rong lục Hình 3.2 Bề mặt đáp ứng hàm mục tiêu Y (X1=6,0, X4 = 25) Hình 3.4 Quy trình tách chiết ulvan từ lồi rong Ulva lactuca Hình 3.5 Quá trình tự kết tụ tạo michelle cấu trúc lõi-vỏ Hình 3.6 Quá trình tự kết tụ tạo nanogel Hình 3.7 Phổ GPC ulvan thủy phân thời gian Hình 3.8: Phổ GPC ulvan thủy phân thời gian Hình 3.9.Sơ đồ phản ứng axetyl hóa ulvan Hình 3.10 Phổ 1H NMR mẫu ulvan thủy phân (UL) ulvan thủy phân acetyl hóa (AcU) Hình 3.11 Phổ 1H NMR mẫu ulvan thủy phân (U) ulvan thủy 13 14 15 16 20 24 29 40 50 51 53 54 56 56 57 58 59 21 phân ester hóa (EU) Hình 3.12 Phổ huỳnh quang kích thích pyrene mẫu Ac.U EU 61 22 Hình 3.13 Phổ huỳnh quang phát xạ pyrene mẫu AcU EU 61 23 Hình 3.14 Kích thước hạt nanogel nồng độ Polyme amphiphilic (AcU) khác 63 24 25 Hình 3.15 Phổ IR AcU (xanh), AcU-Cur (đỏ) Cur (vàng) Hình 3.16 .Phổ huỳnh quang curcumin nước (Cur-water) 65 66 26 Curcumin nanogel (Cur-Au) Hình 3.17 Thế zeta hệ AcU-Cur 67 27 28 Hình 3.18 Kích thước hạt nanogel AcU-Cur Hình 3.19 Đặc điểm hình thái nanogel AcU-Cur a Ảnh FESEM B Phân bố kích thước hạt curcumin từ ảnh chụp FESEM C ảnh chụp TEM 68 69 29 30 31 32 33 34 35 36 37 Hình 3.20 Phổ IR ulvan chiết từ rong ulva lactuca Hình 3.21 Phổ 1H-NMR ulvan chiết từ rong ulva lactuca Hình 3.22 Phổ 13C-NMR UL Hình 3.23 Phổ COSY UL Hình 3.24 Phổ HSQC UL Hình 3.25 Phổ HMBC UL Hình 3.26 Phổ ESI-MS ulvan UL Hình 3.27 Phổ ESI-MS/MS ion mảnh [RhaSO3]- với m/z 243 Hình 3.28 Đồ thị Kratky dung dịch UR 1% nước NaCl 0,5 M Hình 3.29 Biểu đồ Guinier dung dịch UR 1% nước Hình 30 Kết thử hoạt tính kháng dòng vi khuẩn A) E coli and B) Pseudomonas aeruginosa C) Enterobacter cloace ulvan chiết từ loài rong Ulva reticulata đĩa thạch Hình 31 Hình ảnh thể ức chế dòng tế bào ung thư a) HepG2, b) MCF7 c) Hela ulvan UL với nồng độ khác Hình 3.32 Hình chụp curcumin tan dung dịch AcU (Au-Cur) curcumin tan nước (Cur) Hình 3.33 Ảnh hưởng thời gian lên khả giải phóng 72 73 74 75 77 78 80 81 83 38 39 40 41 42 84 85 87 91 91 Đã đánh giá hiệu việc nanogel AcU khả dẫn curcumin - Tăng khả hòa tan curcumin nước - Không làm ảnh hưởng đến hoạt tính gây độc tế bào curcumin Hoạt tính sinh học Ulvan chiết từ 02 loài rong Ulva lactuca, Ulva reticulata axetyl ulvan (AcU) - Ulvan chiết UR có khả kháng chủng G (-) E.coli P.aeruginosa chủng vi khuẩn G (+) E.cloace Ulvan chiết UL có khả kháng 01 chủng vi khuẩn G (+) E.cloace AcU khơng có khả kháng khuẩn - Cả 03 mẫu thể hoạt chống oxy hóa Mạnh Ulvan chiết từ rong UR - Ulvan chiết từ UL thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh dòng tế bào ung thư HepG2, MCF7 and Hela với giá trị IC50 tương ứng 29.67 ± 2.87, 25.09 ± 1.36 36.33 ± 3.84 µg/ml Ulvan chiết UR AcU thể hoạt tính yếu với giá trị IC50 > 100 µg/ml Tạo sản phẩm ulvan Polysaccharide từ rong lục 200 g ulvan chiết từ loài rong Ulva lactuca với tiêu chất lượng sau : Hàm lượng carbohydrate : 30,2 %, Hàm lượng sulfate : 16,1 %, Hàm lượng acid uronic : 18,2 % 10 g nano ulvan KIẾN NGHỊ Để áp dụng quy trình cơng nghệ vào sản xuất cần tiếp tục hỗ trợ kinh phí để hồn thiện quy trình cơng nghệ với quy mơ pilot kiểm tra độc tích cấp độc tính bán trường diễn sản phẩm ulvan nanogel ulvan, làm cở sở để sản phẩm có giá trị thương mại TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bùi Minh Lý, Thành Thị Thu Thủy, Trần Thị Thanh Vân, Bilan M.I Usov A.I (2012) Nghiên cứu cấu trúc Fucoidan tách chiết từ tảo nâu Sargassum Polycystumn Tạp chí hóa học, 50 (4A), 215 – 218 Đàm Đức Tiến, Nghiên cứu khu hệ rong biển quần đảo Trường Sa (2002), Luận án Tiến sỹ sinh học, Hà Nội Phạm Thế Trinh, Mai Văn Tiến (2005), Polyme phân huỷ sinh học sở màng blend polyethylen tỷ trọng thấp với tinh bột Phần A: Các yếu tố ảnh hưởng, Tạp chí Hoá học, 43, 5A, 176-181 Phùng Hà, Phạm Thế Trinh (2012), Polyme phân huỷ mơi trường, Tạp chí Cơng nghiệp Hố chất Trần Thị Thanh Vân, Võ Mai Như Hiếu, Cao Thị Thúy Hằng, Nguyễn Ngọc Linh, Lê Như Hậu, Bùi Minh Lý, (2009) Phân tích thành phần hóa học số lồi rong biển sinh trưởng bờ biển Nam Trung Bộ Tuyển tập hội nghị Khoa học Toàn quốc sinh học biển phát triển bền vững NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Hà Nội, 661-666 Võ thành Trung, Lê Như Hậu, Nguyễn Thanh Hằng (2014) Nghiên cứu biến động thành phần hóa học theo chu kỳ sống số loài rong Lục Việt Nam ứng dụng sản xuất cồn, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 52 (5B) , 597-604 Võ Thành Trung, Lê Như hậu, Nguyễn Thanh Hằng (2014), Tuyển chọn loài rong lục Việt Nam ứng dụng sản xuất cồn, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 52 (5A), 7-13 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Akiyoshi K., S Deguchi, N Moriguchi, S Yamaguchi, J Sunamoto 26 (1993), Self-aggregates of hydrophobized polysaccharides in water Formation and characteristics of nanoparticles, Macromolecules 3062– 3068 Haug, A., Nilsson, N H., Romming, C., Schaumburg, K., Vialle, J & Anthonsen, T (1976) The influence of borate and calcium on the gel formation of a sulfated polysaccharide from Ulva lactuca Acta Chem Scand B 30, 562–566 10 Ahmed O M., R.R Ahmed (2014), Anti-proliferative and apoptotic efficacies of ulvanpolysaccharides against different types of carcinoma cells In Vitro and In Vivo, Cancer Sci Ther (6) 202–208 11 Alves A, Duarte ARC, Mano JF, Sousa RA, Reis RL (2012) PDLLA enriched with ulvan particles as a novel 3D porous scaffold targeted for bone engineering J Supercrit Fluids; 65:32-8 12 Alves A, Pinho ED, Neves NM, Sousa RA, Reis RL (2012) Processing ulvan into 2D structures: cross-linked ulvan membranes as new biomaterials for drug delivery applications Int J Pharm; 426:76-81 13 AOAC, Official methods of analysis of AOAC International, (16 th Ed), Gaithersburg, USA, 1996 14 Barcelo A., Claustre J., Moro F., Chayvialle J.A., Cuber J.C., Plaisancie P G (2000) Mucin secretion is modulated by luminal factors in the isolated vascularly perfused rat colon, gut, 46, pp 218-224 15 Barros AA., A Alves, C Nunes, M A Coimbra, R A Pires, R L Reis, Carboxymethylation of ulvan and chitosan and their use as polymeric components of bone cements Acta Biomater 2013, 9, 9086 16 Bitter T, Muir HM (1962) A Modified Uronic Acid Carbazole Reaction Anal Biochem 4: 330-334 17 Brading, J E.; Georg-Plant, M.T; Hardy, D.; (1954) The polysaccharide from the alga Ulva lactuca Purification, hydrolysis, and methylation of the polysaccharide J Chem Soc.; 319-324 18 Camila Sampaio Mangolim, Cristiane Moriwaki, Ana Claudia Nogueira, Francielle Sato, Mauro Luciano Baesso, Antônio Medina Neto, Graciette Matioli, (2014) Curcumin–b-cyclodextrin inclusion complex: Stability, solubility, characterisation by FT-IR, FT-Raman, X-ray diffraction and photoacoustic spectroscopy, and food application, Food Chemistry 153 361–370 19 Cao X T, A.M Showkat, K.T Lim (2015), Synthesis of nanogels of poly(εcaprolactone)-b-poly(glycidyl methacrylate) by click chemistry in direct preparation, Eur Polym J 68 267–277 20 Carina C., Anabela A., Paula R.P., Rui A.S., Eduardo A.B.S., Rui L.R., Alirio E.R (2012) Characterization of ulvan extracts to assess the effect of different steps in the extraction procedure, Carbohydrate Polymers, 88, 537-546 21 Carme Coll M., Ferrer, P Sobolewski, R.J Composto, D.M Eckmann, (2013) Cellular Uptake and Intracellular Cargo Release from Dextran Based Nanogel Drug Carriers, J Nanotechnol Eng Med 110021– 110028 22 Chiellini F , A M Piras, C Errico, and E Chiellini (2008) Micro/nanostructured polymeric systems for biomedical and pharmaceutical applications Nano- medicine, 3:367-393 23 Chiellini F., Morelli A (2014), Ulvan: A Versatile Platform of Biomaterials from Renewable Resources, Book Biomaterials - Physics and Chemistry, Italy 24 Chih Ta Lee, Ching-Ping Huang, and Yu-Der Lee (2006), Preparation of Amphiphilic Poly(L-lactide)-graft-Chondroitin Sulfate Copolymer Selfaggregates and Its Aggregation Behavior, Biomacromolecules, 7, pp 11791186 25 Cho J K, W Park, K Na, (2009) Self-Organized Nanogels from Pullulang-Poly(L-lactide) Synthesized by One-Pot Method: Physicochemical Characterization and In Vitro Doxorubicin Release, J Appl Polym Sci 113 2209–2216 26 Costa C., Alves A., Pinto P.R., Sousa R.A., Silva E.A., Reis, R.L., Rodrigues A.E., (2012) Characterization of ulvan extracts to assess the effect of different steps in the extraction procedure Carbohydr Polym, 88, 537–546 27 Costa LS, Fidelis GP, Cordeiro SL, Oliveira RM, Sabry DA, Câmara RBG, et al (2010) Biological activities of sulfated polysaccharides from tropical seaweeds Biomed Pharmacother, 64:21-8 28 Daisy Z Delgado, Mateus B de Freitas, Marciel J Stadnik, (2013), Effectiveness of saccharin and ulvan as resistance inducers against rust and angular leaf spot in bean plants (Phaseolus vulgaris), Crop protection 47, 67-73 29 Devaki, T.; Sathivel, A.; BalajiRaghavendran, H.R (2009), Stabilization of mitochondrial and microsomal function by polysaccharide of Ulva lactuca on D-Galactosamine induced hepatitis in rats Chem Biol Interact 177, 83–88 30 Dina R., Ana C., Teresa A P., Marta W (2015) Chemical composition of red, brown and green macroalgae from Buarcos bay in Central West Coast of Portugal, Food Chemistry, 183, 197–207 31 Dobrynin A.V, (2008) Theory and simulations of charged polymers: From solution properties to polymeric nanomaterials Current Opinion in Colloid & Interface Science 13, p.376–388 32 Dodgson KS (1961) Determination of inorganic sulphate in studies on the enzymic and non-enzymic hydrolysis of carbohydrate and other sulphate esters Biochem J 78:312-319 33 El-Baky HHA, Baz FKE, Baroty GSE (2009) Potential Biological Properties of Sulphated Polysaccharides Extracted from the Macroalgae Ulva lactuca L Academic Journal of Cancer Research, 2:1-11 34 Enrique H G., Jose A.Z.G., Isai P.R (2011) Isolation and chemical characterization of algal polysaccharides from the green seaweed Ulva clathrata (Roth) C Agardh, Journal of Applied Phycology, 23, 537-542 35 Favero N., Cattalini F., Bertaggia D., Albergoni V (1996), Metal accumulation in a biological indicator (Ulva rigida) from the lagoon of Venice (Italy), Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 31, pp 9-18 36 Ghosh S., S Basu, S Thayumanavan (2006), Simultaneous and Reversible Functionalization of Copolymers for Biological Applications, Macromolecules 39 5595–5597 37 Godard, M.; Decorde, K.; Ventura, E.; Soteras, G.; Baccou, J.C.; Cristol, J.P.; Rouanet (2009) J.M Polysaccharides from the green alga Ulva rigida improve the antioxidant status and prevent fatty streak lesions in the high cholesterol fed hamster, an animal model of nutritionally-induced atherosclerosis Food Chem 115, 176–180 38 Greenwood, R; Kendall, K (1999) Electroacoustic studies of moderately concentrated colloidal suspensions Journal of the European Ceramic Society 19 (4): 479–488 39 Guangling Jiao, Guangli Yu, Junzeng Zhang H Stephen Ewart (2011), Chemical Structures and Bioactivities of Sulfated Polysaccharides from Marine Algae, Mar Drugs, 9, 196-223 40 Guillaume Pierre, Valérie Sopena, Camille Juin, Amira Mastouri, Marianne Graber, Thierry Maugard (2011) Antibacterial activity of a sulfated galactan extracted from the marine alga Chaetomorpha aerea against Staphylococcus aureus, Biotechnology and Bioprocess Engineering, Volume 16, Issue 5, pp 937-945 41 Gursharan Bains, Arti B Patel, Vasanthy Narayanaswami (2011), Pyrene: A Probe to Study Protein Conformation and Conformational Changes, Molecules, 16, pp 7909-7935 42 Ha Phuong Thu,Tran Thi Minh Nguyet, Nguyen Xuan Phuc (2008), Nguyen Quang Huan, Study on synthesis of copolymer Poly(lactide)vitamin E TPGS (PLA-TPGS) and nanocarrier for curcumin delivery to cancer cells, APCTP-ASEAN Wokshop on Advanced Materals Science and Nanotechnology’, Nha Trang Sept 15-21 43 Hailong Yu, Qingrong Huang (2010), Enhanced in vitro anti-cancer activity of curcumin encapsulated in hydrophobically modified starch, Food Chemistry, Food Chemistry 119 669–674 44 Hamidi M, A Azadi, P Rafiei (2008), Hydrogel nanoparticles in drug delivery Adv Drug Deliv Rev 60 1638–1649 45 Heffernan M J, N Murthy, Ann (2009) Disulfide-crosslinked polyion micelles for delivery of protein therapeutics Biomed Eng 37 1993–2002 46 Hela Yaich, Haikel Garna, Souhail Besbes, Michel Paquot, Christophe Blecker, Hamadi Attia (2013) Effect of extraction conditions on the yield and purity of ulvan extracted from Ulva lactuca, Food Hydrocolloids, 31, 375-382 47 Hela Yaich, Haikel Garna, Souhail Besbes, Michel Paquot, Christophe Blecker, Hamadi Attia (2011) Chemical composition and functional properties of Ulva lactuca seaweed collected in Tunisia Food Chemistry 128, 895–901 48 Hornig, S & Heinze, T (2008) Efficient approach to design stable waterdispersible nanoparticles of hydrophobic cellulose esters Biomacromolecules, 9, 5, pp (1487- 1492), 1526-4602 (Electronic) 49 Hu Y, D Samanta, S.S Parelkar, S.W Hong, Q Wang, T.P Russell, T Emrick (2010) Ferritin–Polymer Conjugates: Grafting Chemistry and Integration into Nanoscale Assemblies, Adv Funct Mater 20, 3603–3612 50 Huimin Qi, Xiaolei Liu, Jinbao Zhang, Yu Duan, Xiaolan Wang, Quanbin Zhang (2012), Synthesis and antihyperlipidemic activity of acetylated derivative of ulvan from Ulva pertusa, International Journal of Biological Macromolecules, 50, pp 270–272 51 HuiZhang, Yingjie Zhai, Juan Wang, Guangxi Zhai (2016), New progress and prospects: The application of nanogel in drug delivery, Materials Science and Engineering, 60, pp 560-568 52 Jin Q A, G.Y Liu, J.A Li (2010), Preparation of reversibly photo-crosslinked nanogels from pH-responsive block copolymers and use as nanoreactors for the synthesis of gold nanoparticles, Eur Polym J 46 2120–2128 53 Kaeffer B, Bénard C, Lahaye M, Blottière HM, Cherbut C (1999) Biological properties of ulvan, a new source of green seaweed sulfated polysaccharides, on cultured normal and cancerous colonic epithelial cells Planta Med, 65:527-31 54 Kaminaga, Y., Nagatsu, A., Akiyama, T., Sugimoto, N., Yamazaki, T., Maitani, T., et al (2003) Production of unnatural glucosides of curcumin with drastically enhanced water solubility by cell suspension cultures of Catharanthus roseus Febs Letters, 555(2), 311–316 55 Kikionis S., E Ioannou, G Toskas, V Roussis, (2015) Electrospun biocomposite nanofibres of ulvan/PCL ulvan/PEO, J Appl Polym Sci., 132, 412356 Kim S.K., Pangestuti R., Rahmadi P (2011) Sea lettuces: culinary uses and nutritional value, Advances in Food and Nutrition Research, 64, 57-70 57 Lahaye M and Ray B (1996) Cell-wall polysaccharides from the marine green alga Ulva rigida (Ulvales, Chlorophyta) - NMR analysis of ulvan oligosaccharides Carbohydr Res 283, p 161-173 58 Lahaye M, Inizan F, Vigouroux J (1998) NMR analysis of the chemical structure of ulvan and of ulvan-boron complex formation Carbohydrate Polymers 36, p 239-249 59 Lahaye M, Robic A (2007) Structure and Functional Properties of Ulvan, a Polysaccharide from Green Seaweeds Biomacromolecules, 8(6), p 1765-1774 60 Lahaye M., Axelos M A V (1993), Gelling properties of water-soluble polysaccharides from proliferating marine green seaweeds (Ulva spp), Carbohydrate Polymers, 22, pp 261-265 61 Lahaye M., Robic A (2007), Structure and Functional Properties of Ulvan, a Polysaccharide from Green Seaweeds, Biomacromolecules, 8,1766-1773 62 Lahaye Marc (1998) NMR spectroscopic characterisation of oligosaccharides from two Ulva rigida ulvan samples (Ulvales, Chlorophyta) degraded by a lyase Carbohydrate Research 314, p 1–12 63 Lahaye Marc, Brunel Magali, Bonnin Estelle (1997) Fine chemical structure analysis of oligosaccharides produced by an ulvan-lyase degradation of the water-soluble cell-wall polysaccharides from Ulva sp (Ulvales, Chlorophyta) Carbohydrate Research 304.; p 325-333 64 Lahaye, M., Jegou, D., & Buleon, A (1994) Chemical characteristics of insoluble glucans from the cell wall of the marine green alga Ulva lactuca (L.) Thuret Carbohydrate Research, 262, 115-125 65 Lee C T, C.P Huang, Y.D Lee (2006), Preparation of Amphiphilic Poly(L-lactide)-graft-Chondroitin Sulfate Copolymer Self-aggregates and Its Aggregation Behavior, Biomacromolecules 1179–1186 66 Lee C T, C.P Huang, Y.D Lee (2007), Synthesis and characterizations of amphiphilic poly(L-lactide)-grafted chondroitin sulfate copolymer and its application as drug carrier, Biomol Eng 24 131–139 67 Li Y L, L Zhu, Z.Z Liu, R Cheng, F.H Meng, J.H Cui, S.J Ji, Z.Y Zhong (2009), Reversibly Stabilized Multifunctional Dextran Nanoparticles Efficiently Deliver Doxorubicin into the Nuclei of Cancer Cells†, Angew Chem Int Ed 48 9914–9918 68 Lingchong Wang, Xiangyu Wang, Hao Wu and Rui Liu (2014), Overview on Biological Activities and Molecular Characteristics of Sulfated Polysaccharides from Marine Green Algae in Recent Years, Mar Drugs, 12, 4984-5020 69 Maeda K., S Mochizuki, Y Sanada, K Sakurai (2014), Naphthalenehydrophobized β-1,3-glucan nanogel for doxorubicin delivery to immunocytes, Bioorg Med Chem Lett 24 1880–1883 70 Mao W-J, Fang F, Li H-Y, Qi X-H, Sun H-H, Chen Y, et al (2008) Heparinoid-active two sulfated polysaccharides isolated from marine green algae Monostroma nitidum Carbohydr Polym, 74:834-9 71 Maria I.Bilan, Alexey A.Grachev, Nadezhda E.Ustuzhanina et al; (2004) A highly regular fraction of a fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus L Carbonhydr Res., 339, 511-517 72 Masakuni Tako, Makie Tamanaha, Yoshiyuki Tamashiro, Shuntoku Uechi (2015) Structure of Ulvan Isolated from the Edible Green Seaweed, Ulva pertusa Advances in Bioscience and Biotechnology, 6, 645-655 73 Mazor S, Vanounou S, Fishov I (2012), Pyrene as a membrane depth gauge: wavelength selective fluorescence approach to monitor pyrene localizations in the membrane Chem Phys Lipids.165(1):125-31 74 McPherson (1993), Handbook of Dietary Fiber in Human Nutrition, CRC Press: Boca Raton, Florida, USA 75 Mendes, G.D.S., A.R Soares, F.O Martins, M.C.M Albuquerque, S.S Costa, Y Yoneshigue-Valentin, L.M.S Gestinari, N Santos, M.T.V Romanos, (2010) Antiviral activity of the green marine Alga Ulva fasciata on the replication of human metapneumovirus Rev Inst Med Trop S Paulo, 52(1): 3-10 76 Mocanu G, D Mihai, L Picton, D LeCerf, G Muller (2002), Associative pullulan gels and their interaction with biological active substances, J Control Release 83 41–51 77 Monks A, Scudiero.D , Skehan P, Shoemake.R, Paull K, Vistica D, Hose C, Langley J, Cronise P, Campbell H, Mayo J, Boyd M (1991) Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines Journal of National Cancer Institute, No.11, Vol 83, pp.757-766 78 Morelli A, Chiellini F (2010), Ulvan as a New Type of Biomaterial from Renewable Resources: Functionalization and Hydrogel Preparation Macromol Chem Phys; 211:821-32 79 Paradossi, G.; Cavalieri, F.; Chiessi, E.A (2002) Conformational study on the algal polysaccharide ulvan Macromolecules, 35, 6404–6411 80 Paradossi, G.; Cavalieri, F.; Pissoferrato, L.; Liquori, A.M.A (1999) Physico-chemical study on the polysaccharide ulvan from hot water extraction of the macroalga Ulva Int J Biol Macromol., 25, 309–315 81 Park W, S.J Park, K Na (2010), Potential of self-organizing nanogel with acetylated chondroitin sulfate as an anti-cancer drug carrier, Colloids Surf B 79 501–508 82 Paulert, Roberta Júnior; Smania Stadnik, Marciel J.; Pizzolatti, Moacir G Antimicrobial properties of extracts from the green seaweed Ulva fasciata Delile against pathogenic bacteria and fungi, Algological studies volum 123, 123-130, 2007 83 Percival, E.; Wold, J K (1963) The acid polysaccharide from the green seaweed Ulva lactuca Part II The site of the ester sulphate J Chem Soc 1963, 5459-5468 84 Pham Hoai Linh, Pham Van Thach, Nguyen Anh Tuan, Nguyen Chi Thuan (2008), Tran Thi Ha, Nguyen Xuan Phuc and Le Van Hong, Fe3O4 based magnetic fluid, preparation and hyperthermia application, APCTPASEAN Wokshop on Advanced Materals Science and Nanotechnology’, Nha Trang Sept 15-21 85 Pires, C.L.; Rodrigues, S.D.; Bristot, D.; Gaeta, H.H.; Toyama, D.D.O.; Lobo Farias, W.R.; Toyama, M.H (2013), Evaluation of Macroalgae Sulfated Polysaccharides on the Leishmania (L.) amazonensis Promastigote Mar Drugs, 11, 934–943 86 Prieto, P.; Pineda, M.; Anguilar, M.; (1999) Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a Phosphomolybdenum Complex: Specific application to the determination of Vitamin E Anal Biochem.; 269, 337-341 87 Qi H, Liu X, Ma J, Zhang Q, Li Z (2010) In vitro antioxidant activity of acetylated derivatives of polysaccharide extracted from Ulva pertusa (Cholorophta) Journal of Medicinal Plants Research, 4:2445-51 88 Qi, H.M.; Zhang, Q.B.; Zhao, T.T.; Chen, R.; Zhang, H.; Niu, X.Z.; Li, Z (2005) Antioxidant activity of different sulfate content derivatives of polysaccharide extracted from Ulva pertusa (Chlorophyta) in vitro Int J Biol Macromol 37, 195–199 89 Quemener, B.; Lahaye, M.; Bobin Dubigeon, C (1997) Sugar determination in ulvans by a chemical-enzymatic method coupled to high performance anion exchange chromatography J Appl Phycol.; 9, 179188 90 Raemdonck K, J Demeester, S De Smedt (2009), Advanced nanogel engineering for drug delivery, Soft Matter 707–715 91 Ratul Kumar Das, MSc, Naresh Kasoju, MSc, Utpal Bora (2010), Encapsulation of curcumin in alginate-chitosan-pluronic composite nanoparticles for delivery to cancer cells, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 153–160 92 Ray B., Lahaye M (2005) Cell-wall polysaccharides from the marine green alga Ulva rigida (Ulvales, Chlorophyta), chemical structure of ulvan, Carbohydrate Research, 274, pp 313-318 93 Ray, B (2006), Polysaccharides from Enteromorpha compressa: Isolation, purification and structural features Carbohydr Polym, 66, 408–416 (103) 94 Ray, B., & Lahaye, M (1995) Cell-wall polysaccharides from the marine green alga Ulva rigida (Ulvales, Chlorophyta) Extraction and chemical composition Carbohydrate Research, 274, 251- 261 95 Robic A, Sassi J.-F, Lahaye M (2008) Impact of stabilization treatments of the green seaweed Ulva rotundata (Chlorophyta) on the extraction yield, the physico-chemical and rheological properties of ulvan Carbohydrate Polymers 74, p 344–352 96 Robic A., Bertrand D., Sassi J.F., Lerat Y., Lahaye M (2009), Determination of the chemical composition of ulvan, a cell wall polysaccharide from Ulva spp (Ulvales, Chlorophyta) by FT-IR and chemometrics, Journal of Applied Phycology, 21, pp 451-456 97 Robic, A., Rondeau-Mouro, C., Sassi, J F., Lerat, Y., & Lahaye, M (2009) Structure and interactions of ulvan in the cell wall of the marine green algae Ulva rotundata (Ulvales Chlorophyceae) Carbohydrate Polymers, 77, 206-216 98 Robic, A., Sassi, J F., & Lahaye, M (2008) Impact of stabilization treatments of the green seaweed ulva rotundata (chlorophyta) on the extraction yield, the physico-chemical and rheological properties of ulvan Carbohydrate Polymers, 74, 344-352 99 Robic, A.; Gaillard, C.; Sassi, J.F.; Lerat, Y.; Lahaye, M (2009) Ultrastructure of ulvan: A polysaccharide from green seaweeds Biopolymers, 91, 652–664 100 Ryu J H, S Jiwpanich, R Chacko, S Bickerton, S Thayumanavan (2010), Surface-Functionalizable Polymer Nanogels with Facile Hydrophobic Guest Encapsulation Capabilities, J Am Chem Soc 132 8246-8247 101 Sahu, A., Kasoju, N., & Bora, U (2008) Fluorescence study of the curcumin–casein micelle complexation and its application as a drug nanocarrier to cancer cells Biomacromolecules, 9(10), 2905–2912 102 Sasaki Y, K Akiyoshi (2010) Nanogel engineering for new nanobiomaterials: from chaperoning engineering to biomedical applications Chem Rec 10 366–376 103 Sathivel A, Raghavendran HRB, Srinivasan P, Devaki T (2008) Anti-peroxidative and anti-hyperlipidemic nature of Ulva lactuca crude polysaccharide on D-galactosamine induced hepatitis in rats Food Chem Toxicol, 46:3262-7 104 Shanmugam M, Ramavat BK, Mody KH, Oza RM, Tewari A (2001), Distribution of heparinoid-active sulphated polysaccharides in some Indian marine green algae Indian J Mar Sci; 30:222-7 105 Shehzad, A., Wahid, F., Lee, Y.S., (2010) Curcumin in cancer chemoprevention: molecular targets, pharmacokinetics, bioavailability, and clinical trials Arch Pharm 343, 489–499 106 Shonima govindan M, Jiji Thomas and G Muraleeddhara Kurup (2012) In vitro antioxidant and antitumor activity of polysaccharide isolated from ulva fasciata, Int J Pharm Bio Sci., 3(3): 238-246 107 Sou, K., Inenaga, S., Takeoka, S., & Tsuchida, E (2008) Loading of curcumin into macrophages using lipid-based nanoparticles International Journal of Pharmaceutics, 352(1–2), 287–293 108 Sun, H.H.; Mao, W.J.; Fang, F.; Li, H.Y.; (2007) Polysaccharides from marine green seaweed Ulva species and their characteristics Agro Food Ind Hi-Tech.; 18, 28–29 109 Takeo M., T Mori, T Niidome, S Sawada, K Akiyoshi, Y Katayama (2013), A polyion complex nanogel, J Colloid Interface Sci 390 78–84 110 Tamura A, M Oishi, Y Nagasaki (2010), Efficient siRNA delivery based on PEGylated and partially quaternized polyamine nanogels: Enhanced gene silencing activity by the cooperative effect of tertiary and quaternary amino groups in the core, J Control Release 146 378–387 111 Thanh T.T.T.; Tran T.T.V.; Yuguchi Y.; Bui M.L and Nguyen T.T (2013) Structure of Fucoidan from Brown Seaweed Turbinaria ornata as Studied by Electrospray Ionization Mass Spectrometry (ESIMS) and Small Angle X-ray Scattering (SAXS) Techniques Mar Drugs, 11, pp 2431-2443 112 Thanh T.T.T.; Yuguchi Y.; Mimura M.; Yasunaga H.; Urakawa H and Kajiwara K (2002) Structure of Sulfated Polysaccharides in Aqueous Solution as Studied by Scattering Techniques Euro-Japanese Workshop on Functinal Polysaccharides, p 5-6 113 Thanh Thi Thu Thuy (2002) Structure of sulfated polysaccharide in aquarius solution Doctoral Thesis 114 Toskas G, Hund R-D, Laourine E, Cherif C, Smyrniotopoulos V, Roussis V Nanobers based on polysaccharides from the green seaweed Ulva Rigida Carbohydr Polym 2011; 84:1093-102 115 Toskas G, V Smyrniotopoulos, V Roussis, “Composite Polyelectrolyte Systems Based on the Natural Biopolymer Ulvan: Membranes (Symplex Membranes) – Nanomembranes and Natural Blend Fibres of Ulvan/Chitosan”, Eur Patent, OBI 20100100550/3563/2011 116 Toskas G, Heinemann S, Heinemann C, Cherif C, Hund RD, Roussis V, Hanke T (2012), Ulvan and ulvan/chitosan polyelectrolyte nanofibrous membranes as a potential substrate material for the cultivation of osteoblasts Carbohydr Polym.;89(3):997-1002 117 US Patent 1952/711762 A1 118 US Patent 2009/0170810 A1 119 Vanden B.D.A and Vlietinck A.J (1991) Methods in plant Biochemistry: Screening Methods for Antibacterial and Antiviral Agents from Higher Plants Academic Press, London, (6), pp 47-69 120 Wang, F., Wu, X., Liu, S F., Jia, Z., & Yang, J H (2006) The sensitive fluorimetric method for the determination of curcumin using the enhancement of mixed micelle Journal of Fluorescence, 16(1), 53–59 121 Wang, X.; Zhang, Z.; Yao, Z.; Zhao, M.; Qi, H.; (2013) Sulfation, anticoagulant and antioxidant activities of polysaccharide from green algae Enteromorpha linza Int J Biol Macromol.; 58, 225–230 122 Wong C H., Mazenod F P., Whitesides G M J (1983) Chemical and enzymatic syntheses of – deoxyhexoses - conversion to 2,5 - dimethyl - - hydroxyl - 2,3 -dihydrofuran - - one (furaneol) and analogs, Journal of Organic Chemistry, 48, pp 3493-3497 123 Wooram Park, Kyoung sub Kim, Byoung-chan Bae, Young-Heui Kim, Kun Na (2010), Cancer cell specific targeting of nanogels from acetylated hyaluronic acid with low molecular weight, European Journal of Pharmaceutical Sciences, 40, pp 367–375 124 Xiao-xiao Liu, Zhen-jiang Wan, Lin Shi, Xiao-xia Lu (2011) Preparation and antiherpetic activities of chemically modified polysaccharides from Polygonatum cyrtonema Hua Carbohydrate Polymers 83, pp.737–742 125 Yen G.C and Chen H.Y (1995) Antioxidant Activity of Various Tea Extracts in Relation to Their Antimutagenicity J Agric Food Chem.; 43 (1), pp 27–32 126 Yin-Meng Tsaia, Chao-Feng Chiena, Lie-Chwen Lina,b, Tung-Hu Tsaia, Curcumin and its nano-formulation: The kinetics of tissue distribution and blood–brain barrier penetration, Int J Pharmaceut (2011) 06.030 127 Yoshi aki Yuguchi, Bui Minh Ly, Bui Van Nguyen, Tran Thi Thanh Van and Thanh Thi Thu Thuy (2016) Study on Branched Structure Physiological Activity Relationship of Fucoidan Chemistry Letter Vol.45, No.7, p.840–842 128 You, S.G.; Tabarsa, M.; Han, J.H.; Kim, C.Y.; (2012) Molecular characteristics and immunomodulatory activities of water-soluble sulfated polysaccharides from Ulva pertusa J Med Food, 15, 135–144 129 Zamurovic M., S Christodoulou, A Vazaios, E Iatrou, M Pitsikalis, N Hadjichristidis (2007) Micellization behavior of coplex comblike block copolymer architectures, Macromolecules 40 5835–5849 130 Zhang Zhongshan, Wang Xiaomei, Yu Shuchi, Yin Li, Zhao Mingxing, Han Zhiping (2011) Synthesized oversulfated and acetylated derivatives of polysaccharide extractedfrom Enteromorpha linza and their potential antioxidant activity International Journal of Biological Macromolecules, 49, pp.1012– 1015 131 Zhou S Y, X Min, H.J Dou, K Sun, C.Y Chen, C.T Chen, Z.F Zhang, Y.Q Jin, Z.L Shen (2013), Facile fabrication of dextran-based fluorescent nanogels as potential glucose sensors, Chem Commun 49 9473– 9475 132 Zhu, Q.Y., Hackman, R.M., Ensunsa, J.L., Holt, R.R., Keen, C.L., (2002) Antioxidative activities of oolong tea J Agric Food Chem., 50, 6929–6934 133 Zvyagintseva, T.N.; Shevchenko, N.M.; Popivnich, I.B (1999) A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds Carbohydr Res., 322, 32-39