BÙI THỊ DUYÊN NGHIÊN cứu điều CHẾ và xây DỰNG một SỐCHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG của CAO ĐẶCKỶ cúc địa HOÀNG LUẬN văn THẠC sĩ dược học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ DUYÊN NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ XÂY DỰNG MỘT SỐCHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CAO ĐẶCKỶ CÚC ĐỊA HOÀNG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ DUYÊN NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CAO ĐẶC KỶ CÚC ĐỊA HOÀNG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ 8720206 Người hướng dẫn khoa học:PGS.TS Bùi Hồng Cường HÀ NỘI 2019 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới: Đầu tiên tơi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, phịng sau đại học, tồn thể thầy tận tình dạy bảo tơi suốt tháng năm học trường Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn chân thành tớiPGS.TS Bùi Hồng Cường, người thầy tận tụy, luôn bảo hướng dẫn, định hướng, tạo điều kiện tốt cho học tập, nghiên cứu suốt thời gian thực đề tài, hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn tồn thể thầy cơ, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược cổ truyền, giúp đỡ tạo điều kiện giúp tơi hồn thành luận văn Xin gửi lời cảm ơn tới sinh viênĐặng Thị Khánh Huyền, sinh viên Nim Phanakhonekhóa 69 sinh viên khóa 69, 70 – Trường Đại học Dược Hà Nội làm đề tài môn Dược học cổ truyền – trường đại học Dược Hà Nội tham gia nghiên cứu với thời gian nghiên cứu thực luận văn Tôi xin cám ơn DS Đỗ Trung Hiếu Công ty cổ phần thương mại dược phẩm Quốc tế WINSACOM; DS Trần Văn Cương Công ty cổ phần dược phẩm VCP cung cấp dược liệu, chất chuẩn hỗ trợ kinh phí giúp thực đề tài Cuối xin cảm ơn gia đình, bạn bè tồn thể đồng nghiệp trường Cao đẳng Dược Hải Dương ủng hộ, động viên, giúp đỡ trong suốt trình thực luận văn Do kiến thức thân cịn giới hạn, nên luận văn khơng tránh khỏi hạn chế thiều xót Tơi mong nhận góp ý, chỉnh sửa q thầy cơ, bạn bè Tôi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 31 tháng 03 năm 2019 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 VÀI NÉT Về PHƯƠNG THUốC Kỷ CÚC ĐịA HOÀNG 1.2 CÁC Vị THUốC TRONG PHƯƠNG THUốC Kỷ CÚC ĐịA HOÀNG 1.2.1 Thục địa (Radix Rehmanniae glutinosae praeparata) 1.2.2 Hoài sơn (Rhizoma Dioscoreae persimilis) 1.2.3 Sơn thù (Fructus Corni officinalis) 1.2.4 Đơn bì (Cortex Paeoniae suffruticosae) 1.2.5 Bạch phục linh (Poria) 11 1.2.6 Trạch tả (Rhizoma Alisma plantago) 12 1.2.7 Câu kỷ tử (Fructus Lycii) 13 1.2.8 Cúc hoa (Flos Chrysanthemi indici) 14 1.3 PHƯƠNG PHAP DIềU CHế VA TIEU CHUẩN CủA CAO THUốC 15 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 ĐốI TƯợNG VÀ PHƯƠNG TIệN NGHIÊN CứU 17 2.1.1.Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.2.Phương tiện nghiên cứu 17 2.2 PHƯƠNG PHAP NGHIEN CứU 19 2.2.1 Nghiên cứu điều chế cao đặc 19 2.2.2 Xây dựng số tiêu chất lượng cao đặc 21 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu – đánh giá kết 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27 3.1 BÀO CHế CAO ĐặC 27 3.2 KHảO SÁT MộT Số CHỉ TIÊU CHấT LƯợNG CAO ĐặC Kỷ CÚC ĐịA HOÀNG 28 3.2.1 Xác định pH 28 3.2.2 Khảo sát tiêu định tính 28 3.2.3 Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng cao đặc Kỷ cúc địa hoàng HPLC 37 CHƯƠNG BÀN LUẬN 46 4.1 Về ĐIềU CHế DạNG CAO ĐặC 46 4.2 ĐịNH TÍNH CÁC NHĨM CHấT TRONG CAO 48 4.2.1 Định tính phản ứng hóa học 48 4.2.2 Định tính sắc ký lớp mỏng 48 4.3 ĐịNH LƯợNG 49 4.3.1 Về khảo sát lựa chọn chất chuẩn định lượng 49 4.3.2 Về khảo sát thẩm định 49 4.3.3 Về kết định lượng loganin cao đặc Kỷ cúc địa hoàng 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 KếT LUậN 51 KIếN NGHị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN acid desoxyribonucleic BL Bạch linh CH Cúc hoa CKT Câu kỷ tử DĐVN V Dược điển Việt Nam V DĐTQ Dược điển Trung Quốc DL/N Dược liệu/nước DB Đơn bì GSH Glutathion HS Hoài sơn HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu cao kl/tt khối lượng/ thể tích MeOH Methanol PL phụ lục pư Phản ứng QC Kiểm soát chất lượng RSD độ lệch chuẩn tương đối ROS q trình oxy hóa nội bào SD độ lệch chuẩn SKLM Sắc kí lớp mỏng ST Sơn thù TD Thục địa tt thuốc thử TT Trạch tả UPLC Sắc ký lỏng hiệu cực cao DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Hóa chất, dung mơi 17 Bảng 2.2 Trang thiết bị sử dụng phân tích 18 Bảng 3.1 Hàm ẩm dược liệu ban đầu 27 Bảng 3.2 Hàm ẩm, thể chất, tỷ lệ cao chiết mẫu cao đặc 28 Bảng 3.3 Kết đo pH cao đặc Kỷ cúc địa hoàng 28 Bảng 3.4 Kết định tính số nhóm chất mẫu cao thuốc 29 Bảng 3.5 Kết Rf cao đặc ST chuẩn, chất chuẩn loganin sau 30 phun thuốc thử Bảng 3.6 Kết Rf củacao đặc, TĐ chuẩn bước sóng 254 nm 31 Bảng 3.7 Kết Rf cao đặc ĐB chuẩn bước sóng 254 nm 32 Bảng 3.8 Kết Rf củacao đặc BL chuẩn bước sóng 254 nm 33 Bảng 3.9 Kết Rf củacao đặc TT chuẩn bước sóng 254 nm 34 Bảng 3.10 Kết Rf củacao đặc CH chuẩn bước sóng 254 nm 35 Bảng 3.11 Kết Rf củacao đặc CKT chuẩn bước sóng 254 nm 36 Bảng 3.12 Kết Rf củacao đặc HS chuẩn bước sóng 254 nm 37 Bảng 3.13 Chương trình dung mơi cho chế độ rửa giải gradient 38 Bảng 3.14 Chương trình dung mơi cho chế độ rửa giải gradient 38 Bảng 3.15 Các thông số sắc ký ứng với chương trình dung mơi 39 Bảng 3.16 Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống 41 Bảng 3.17 Kết khảo sát khoảng tuyến tính 41 Bảng 3.18 Kết đánh giá độ lặp lại độ xác trung gian phương 43 pháp Bảng 3.19 Kết đánh giá độ cao đặc Kỷ cúc địa hoàng 43 Bảng 3.20 Kết xác định nồng độ giới hạn 44 Bảng 3.21 Kết định lượng loganin số mẫu cao đặc Kỷ cúc địa 45 hoàng Bảng 4.1 Các phương pháp phân tích định lượng loganin HPLC 49 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Các dược liệu phương thuốc Kỷ cúc địa hồng 17 Hình 2.2 Sơ đồ bào chế cao đặc chiết nước 20 Hình 3.1 Sắc ký đồ định tính cắn ethylacetat từ cao đặc ST chuẩn sau 30 phun thuốc thử Hình 3.2 Sắc ký đồ định tính cắn methanol từ cao đặc TĐ chuẩn bước 31 sóng 254 nm Hình 3.3 Sắc ký đồ định tính cắn methanol từ cao đặc ĐB chuẩn bước 32 sóng 254 nm Hình 3.4 Sắc ký đồ định tính cắn methanol từ cao đặc BL chuẩn bước 33 sóng 254 nm Hình 3.5 Sắc ký đồ định tính cắn methanol từ cao đặc TT chuẩn bước 34 sóng 254 nm Hình 3.6 Sắc ký đồ định tính cắn methanol từ cao đặc CH chuẩn bước 35 sóng 254 nm Hình 3.7 Sắc ký đồ định tính cắn methanol từ cao đặc CKT chuẩn bước 36 sóng 254 nm Hình 3.8 Sắc ký đồ định tính cắn cloroform từ cao đặc HS chuẩn bước 37 sóng 254 Hình 3.9 Sắc ký đồ chương trình dung mơi 38 Hình 3.10 Sắc ký đồ chương trình dung mơi 39 Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu placebo, mẫu chuẩn loganin mẫu cao, mẫu 40 cao thêm chuẩn Hình 3.12 Phổ UV loganin mẫu cao mẫu chuẩn 40 Hình 3.13 Đường chuẩn phương trình hồi quy tuyến tính loganin 42 Hình 3.14 Sắc ký đồ HPLC mẫu cao N8T3 loganin chuẩn 45 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh suy giảm chức gan, thận bệnh mãn tính ngày phổ biến Chức gan, thận suy giảm làm tăng nguy ung thư gan Theo số liệu thống kê hội gan mật Việt Nam năm 2018, năm có vạn người chết biến chứng xơ gan giai đoạn nặng ung thư gan Bệnh lý gan, thận gây rối loạn thị lực số bệnh lý mắt mờ mắt, chảy nước mắt, Đặc biệt mơi trường nhiễm bụi, khói, sinh hoạt chưa hợp lý vấn đề mắt dễ xảy Trong lý luận Y học cổ truyền, can khai khiếu mắt: khí can tốt thị lực tốt, ngược lại mắt mờ, thị lực suy giảm, nhìn vào mắt biết trạng thái can Bài thuốc Kỷ cúc địa hoàng có chứa tám loại thảo dược sử dụng để làm giảm triệu chứng hoa mắt, chóng mặt can thận âm hư từ hàng ngàn năm Từ quan điểm y học cổ truyền, người ta tin chế Kỷ cúc địa hồng liên quan đến việc bổ can thận âm, sáng mắt, điều hịa hoạt động can, thận Ngồi ra, thuốc Kỷ cúc địa hoàng làm giảm triệu chứng hoa mắt, chóng mặt tăng huyết áp, dùng phối hợp với thuốc tăng huyết áp để điều trị bệnh tăng huyết áp nguyên phát không rõ nguyên nhân Tăng huyết áp nguy hàng đầu cho bệnh tim mạch – nguyên nhân hàng đầu gây tử vong năm 2020 [58] Về mặt tác dụng dược lý, Kỷ cúc địa hồng có hiệu tốt việc làm giảm nồng độ angiotensin huyết tương tim, làm giảm hàm lượng endothelin cải thiện dòng máu thận chuột bị tăng huyết áp [19] Cách sử dụng thông thường thuốc phương pháp sắc Phương pháp sử dụng từ hàng ngàn năm phổ biến sống thường ngày Khi sử dụng thuốc sắc có nhược điểm tốn nhiều thời gian để nấu thuốc, sau nấu xong phải sử dụng Bởi tiến hành nghiên cứu điều chế dạng cao đặc thuốc để khắc phục nhược điểm dạng thuốc truyền thống Với dạng bán thành phẩm cao đặc, thuốc Kỷ cúc địa hồng tiếp tục phát triển dạng thuốc khác cách dễ dàng hơn: dạng viên nén, viên nang….Xuất phát từ lý trên, đề tàiNghiên cứu điều chế xây dựng số tiêu chất lượng cao đặc Kỷ cúc địa hoàngđược thực nhằm giải hai mục tiêu sau: - Điều chế cao đặc Kỷ cúc địa hoàng - Khảo sátmột số tiêu định tính, định lượng cao đặc Kỷ cúc địa hồng CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vài nét phương thuốc Kỷ cúc địa hoàng * Phương thuốc Kỷ cúc địa hoàng bao gồm vị thuốc sau: Thục địa(Radix Rehmanniae glutinosae praeparata) 24g Hoài sơn(Rhizoma Dioscoreae persimilis) 12g Sơn thù(Fructus Corni officinalis) 12g Đơn bì(Cortex Paeoniae suffruticosae) 9g Bạch linh(Poria) 9g Trạch tả(Rhizoma Alisma plantago) 9g Câu kỷ tử(Fructus Lycii) 9g Cúc hoa(Flos Chrysanthemi indici) 9g * Công năng: Bổ thận dưỡng can, ích tinh sáng mắt[19] * Chủ trị: Thận âm hư, hư hỏa bốc lên, cổ lưng đầu gối đau mỏi, đầu đau, mắt hoa, choáng váng, tai ù, hay mồ hôi trộm, tăng huyết áp [3], [19] * Xuất sứ thuốc : Kỷ cúc địa hồng hồn trích từ «Tiểu Nhi Dược Chứng Trực Quyết» Bài bắt nguồn từ thuốc cổ phương «Lục vị địa hồng hồn» gia vị Câu kỷ tử, Cúc hoa thành thuốc «Kỷ cúc địa hồng hồn» [3], [19] * Phân tích ý nghĩa thuốc theo YHCT: Bài thuốc Kỷ cúc địa hồng khơng chữa thận âm hư mà chữa can thận bất túc Thục địa có tác dụng bổ thận thủy, Trạch tả giúp tuyên tiết chất trọc thận, Sơn thù để ơn sáp can có Đơn bì để tả can hỏa, Hồi sơn thu nhiếp tỳ kinh lại có Bạch phục linh thẩm thấp điều hịa Bài thuốc có sáu vị mà có mở có đóng chữa can thận bất túc với mục đích thuốc bổ Trên sở thuốc tác giả thời xưa gia thêm vị Câu kỷ tử Cúc hoa để tạo thành thuốc Kỷ cúc địa hồng có tác dụng nâng cao hiệu chữa can thận suy mắt hoa, nhìn mờ, chân tay buồn bực, người khó chịu Cúc hoa có tác dụng tân lương giải biểu đồng thời làm cho mắt sáng, Câu kỷ tử có tác dụng bổ dưỡng can thận, khí huyết [3], [19] * Thành phần hóa học: Kỷ cúc địa hồng có thành phần - Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Nếu lớp nước có màu đỏ sim phản ứng dương tính Định tính anthranoid toàn phần (dạng glycosid dạng tự do) Cho vào ống nghiệm lớn 2g dược liệu Thêm 5ml dung dịch acid sulfuric 1N Đun trực tiếp nguồn nhiệt đến sôi Tiếp tục lọc chiết - Lấy 1ml dịch chiết cloroform, thêm 1ml dung dịch amoniac Lắc nhẹ Phản ứng dương tính lớp nước có màu đỏ sim Nếu lớp chloroform có màu vàng tiếp tục nhỏ giọt dung dịch NaOH 10% Lắc nhẹ Lớp cloroform màu lớp nước màu đỏ đậm - Lấy 1ml dịch chiết chloroform cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1ml dung dịch NaOH 10% Lắc nhẹ Phản ứng dương tính lớp nước có màu đỏ sim - Vi thăng hoa: Trải bột dược liệu thành lớp mỏng nắp chai nhôm, đốt nhẹ đèn cồn để loại nước Sau đậy lên nắp nhơm miếng lam kính, bên có miếng bơng thấm nước, tiếp tục đun nóng khoảng - 10 phút Lấy lam kính đểnguội, soi kính hiển vi Định tính flavonoid Cân 4g bột dược liệu cho vào cốc có mỏ Thêm 10ml ethanol 90% Đun cách thủy sơi vài phút Lọc nóng Dịch lọc tiến hành phản ứng định tính: phản ứng Cyanidin, phản ứng với kiềm, phản ứng với FeCl3, phản ứng diazo hóa - Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda) Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết Thêm bột magnesi kim loại (khoảng 10mg) Nhỏ giọt HCl đậm đặc (3 - giọt) Đun cách thủy sôi vài phút, phản ứng dương tính dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ - Phản ứng với kiềm - Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết Phản ứng dương tính nêu thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% thấy xuất tủa vàng Thêm 1ml nước cất, tủa tan màu vàng dung dịch tăng thêm - Nhỏmột giọt dịch chiết lên giấy lọc Hơ khô để lên miệng lọ amoniac đặc mở nút, phản ứng dương tính thấy màu vàng vết dịch chiết tăng lên Nhỏmột giọt khác giấy lọc làm chứng - Phản ứng với FeCl3 Chovàoống nghiệmnhỏ1ml dịch chiết Thêm vài giọt dung dịch FeCl35% Phản ứng dương tính xuất tủa xanh đen - Phản ứng diazo hóa Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa dung dịch kiềm (dung dịchNaOH, KOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử diazo pha, lắc đều, đun nóng nồi cách thủy vài phút Phản ứng dương tính xuất màu đỏ Định tính coumarin Cân 4g bột dược liệu cho vào cốc có mỏ Thêm 10ml ethanol 90% Đun cách thủy sôi vài phút Lọc nóng Dịch lọc dùng để làm phản ứng - Phản ứng mở đóng vịng lacton : Cho vào ống nghiệm ống 1ml dịch chiết + Ống thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10% + Ống để nguyên Phản ứng dương tính xảy tượng sau: - Đun ống nghiệm đến sơi Để nguội quan sát + Ống 1: Có màu vàng tủa đục màu vàng + Ống 2: Trong - Thêm vào ống nghiệm ống 2ml nước cất Lắc quan sát + Ống 1: Trong suốt + Ống 2: Có tủa đục Acid hóa ống vài giọt HCl đặc, ống trở lại tủa đục ống - Phản ứng diazo hóa: Tiến hành kết tương tự phần định tính flavonoid - Quan sát huỳnh quang vết coumarin ánh sáng tử ngoại tác dụng với dung dịch kiềm (Phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân trans tác dụng tia tử ngoại) Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy thấm Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5% Sấy nhẹ Che phần diện tích dịch chiết giấy lọc miếng kim loại (chìa khóa, đồng xu) chiếu tia tử ngoại vài phút Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp đèn tử ngoại Phản ứng dương tính phần khơng bị che có huỳnh quang sáng phần bị che Tiếp tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sáng dần lên, sau vài phút hai phần phát quang Định tính tanin Lấy khoảng 3g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml nước cất, đun sôi phút Để nguội, lọc Dịch lọc dùng để định tính - Ống 1: lấy 2ml dịch lọc, thêm giọt dung dịchFeCl35% (TT) Phản ứng dương tính xuất màu tủa màu xanh đen xanh nâu nhạt - Ống 2: lấy 2ml dị ch lọc, thêm giọt chì acetat 10% (TT) Ph ản ứng dương tínhsẽ xuất tủa - Ống 3: lấy 2ml dịch lọc, thêm giọt dung dịch gelatin 1% Phản ứngdương tính xuất tủa bơng trắng Định tính alcaloid Cân 5g bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 50ml Thêm 15ml dung dịch acid sulfuric 1N Đun đến sôi Để nguội Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100ml Kiềm hóa dịch lọc dung dịch amoniac 6N (khoảng 8ml) đến pH = - 10 (thử giấy quỳ thị màu vạn năng) Chiết alcaloid base cloroform (chiết lần, lần 5ml) Gộp dịch chiết cloroform, loại nước natrisulfat khan, sau dùng đểlàm phản ứng định tính Lấy phần dịch chiết cloroform chuẩn bị trên, đem lắc với acid sulfuric 1N hai lần, lần 5ml Gộp dịch chiết nước Chia vào ống nghiệm nhỏ, ống 1ml Nhỏ vào ống nghiệm 2- giọt thuốc thửsau: - Ống 1: thuốc thử Mayer, phản ứng dương tính cho tủa màu từ trắng đến vàng - Ống 2: thuốc thử Bouchardat, phản ứng dương tính cho tủa nâu đến đỏ nâu - Ống 3: thuốc thử Dragendorff, phản ứng dương tính cho tủa vàng cam đến đỏ Định tính acid hữu Cân khoảng 3g bột dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 10ml nước cất đem đun sôi trực tiếp 10 phút, để nguội lọc qua giấy lọc gấp nếp Cho vào ống nghiệm nhỏkhoảng 2ml dịch lọc, thêm tinh thể Na2CO3 Phản ứng dương tính có bọt khí Định tính đường khử Cân khoảng 3g dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 5ml nước cất, đun sôi Lọc qua giấy lọcvào ống nghiệm khác Thêm 1ml dung dịch thuốc thử Felling A 1ml dung dịch Felling B Đun cách thủy sôi vài phút Phản ứng dương tính xuất hiệu tủa đỏ gạch Định tính acid amin Cân khoảng 3g dược liệu cho vào cốc có mỏ, thêm 20ml nước cất, đun sôi vài phút.Lọcquagiấy lọcvào1ống nghiệm khác.Thêmvài giọt thuốc thử Ninhydrin 3% Đun cách thủy sơi vài phút Phản ứng dương tính xuất hiệu màu xanh đến tím Định tính polysaccharid Chuẩn bị dịch chiết phản ứng định tính acid amin Chia dịch chiết vào ống nghiệm: + Ống 1: 4ml dịch chiết + giọt thuốc thử Lugol + Ống 2: 4ml nước cất + giọt thuốc thử Lugol + Ống 3: 4ml dịch chiết Phản ứng dương tính màu ống 1đậm ống ống Định tính chất béo Cân khoảng 10g bột dược liệu vào cốc cỏ mỏ 100ml, thêm 10ml ether dầu hỏa, bọc kín, ngâm 12 Lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc Nhỏ 1giọt dịch chiết lên mảnh giấy trắng, sấy nhẹ cho bay hết dung mơi, phản ứng dương tính để lại vết mờ giấy Định tính caroten Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2ml dịch chiết ether dầu hỏa dược liệu, cô cách thủy đến cắn, nhỏ vài giọt H2SO4 đặc vàocắn Phản ứng dương tính xuất màu xanh Định tính sterol Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2ml dịch chiết ether dầu hỏa dược liệu, cô cách thủy đến cắn Thêm vào ống nghiệm khoảng 1ml anhydride acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn Để nghiêng ống nghiệm 450, thêm từ từ H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm Phản ứng dương tính mặc phân cách có vịng tím đỏ, lớp chất lỏng phía có màu xanh PHỤ LỤC Khảo sát lựa chọn chất chuẩn làm tiêu chuẩn định lượng cao đặc Kỷ cúc địa hoàng HPLC Lựa chọn chất chuẩn dựa có mặt chất có dược liệu: verbascosid (Thục địa) loganin (Sơn thù) Nguyên liệu mẫu thử: Cao đặc Chuẩn bị mẫu - Mẫu thử: Cân xác khoảng 2g cao đặc Kỷ cúc địa hồng vào bình nón có nút mài, thêm xác 50ml methanol 50%, đậy nút, cân Chiết siêu âm 45 phút, để nguội, cân lại, bổ sung lượng methanol 50%, lắc đều, lọc Hút xác 25 ml dịch lọc, đem cất quay tới cắn Hịa tan cắn bình định mức 10 methanol 50% dung dịch thử - Mẫu chuẩn: + chất chuẩn verbascosid: Hòa tan verbascosid chuẩn pha động để dung dịch có nồng độ xác khoảng 10 µg/ml + chất chuẩn loganin: Hịa tan loganin chuẩn methanol 50% (TT) để dung dịch có nồng độ xác khoảng 40 µg/ml Điều kiện sắc ký khảo sát: + Chất chuẩn verbascosid: Pha động: Acetonitril – dung dịch acid acetic 0.1% (16:84) Cột Agilent Eclipse XDB-C18 (150 ì 4.6 mm; 5àm) Detector UV, bc sóng phát hiện: 334 nm Tốc độ dịng: 0.8 ml/min Thể tích tiêm: 20 µl + Chất chuẩn loganin: Pha động: methanol - Acetonitril – dung dịch acid phosphoric 0.1% (5:10:85) Ct Agilent Eclipse XDB-C18 (150 ì 4.6 mm; 5àm) Detector UV, bước song phát 236 nm Tốc độ dịng: ml/min Thể tích tiêm: 10 µl Kết ết sắc ký đồ HPLC mẫu thử với chất chuẩn verbascosid loganin trình bày Hình 3.9 Hình 3.10 Hình 3.9 Sắc ắc ký đồ chất chuẩn loganin v cao đặc ặc bước sóng 236 nm Hình 3.10 Sắc S ký đồ chất chuẩn verbascosid vàà cao đặc bước sóng 334 nm Nhận xét: Từ kết khảo sát, sắc ký đồ cao đặc b thuốc ốc xuất pic sắc ký có thời gian lưu ưu v với ới chất chuẩn loganin, không xuất pic với thời gian lưu chất chuẩn verbascosid Như ậy sau tr trình khảo ảo sát, lựa chọn chất chuẩn loganin làm tiêu chuẩn ẩn định llượng ợng HPLC cho cao đặc Kỷ cúc địa hoàng ho BẢN B DỊCH PHIẾU PHI KIỂM NGHIỆM Kiểm nghiệm số: YP186783245 Tên sản phẩm Số lô Quy cách Lượng ợng mẫu kiểm nghiệm Cúc hoa YP186783245 100g Ngày báo cáo 20/04/2018 Xuất sứ Xưởng kho Đơn vị kiểm tra Phân xưởng sản xuất phổ thông Kiểm tra tổng hợp Phương pháp lấy mẫu CP2015 Tiêu chuẩn Kết Vi phẫu Phải có đặc trưng hình thức dược liệu Cúc hoa _ Phải có đặc trưng vi phẫu dược liệu Cúc hoa SKLM Cúc hoa vàng (mẫu chuẩn) Đúng Đạt ≤13,0 % 10,5% Hình thức Định tính 22/02/2018 Thùng Mục kiểm tra Nội dung Ngày lấy mẫu Hàm ẩm Tồn dư lượng SO2 Tro Chất ất chiết ethanol Két luận Người soạn thảo: Chen Yong Yan Đạt ≤150,0 mg/kg 27,1 mg/kg ≤9,0 % 5,4 % Khơng 50,0% 64,5% Dược liệu đạt tiêu chuẩn ẩn CP 2015 chất lượng l Người kiểm tra: Liu Qing Ping Người Ngư phê duyệt: Qun Meng Li BẢN B DỊCH PHIẾU PHI KIỂM NGHIỆM Kiểm nghiệm số: YP18678547 Tên sản phẩm Số lô Quy cách Lượng ợng mẫu kiểm nghiệm Phục linh Ngày lấy mẫu 10/01/2018 YP18678547 Ngày báo cáo 22/03/2018 Xuất sứ Xưởng kho Đơn vị kiểm tra Phân xưởng sản xuất phổ thông Thùng 100g Mục kiểm tra Kiểm tra tổng hợp Phương pháp lấy mẫu Nội dung Tiêu chuẩn Kết Vi phẫu Phải có đặc trưng hình thức dược liệu Phục linh _ Phải có đặc trưng vi phẫu dược liệu Phục linh SKLM Phục linh (mẫu chuẩn) Đúng Đạt ≤12,0 % 8,5% ≤150,0 mg/kg 19,1 mg/kg ≤2,0 % 1,4 % Hình thức Định tính CP2015 Hàm ẩm Tồn dư lượng SO2 Tro Chất ất chiết ethanol Két luận Người soạn thảo: Chen Yong Yan Khơng 2,5% Đạt 13,5% Dược liệu đạt tiêu chuẩn ẩn CP 2015 chất lượng l Người kiểm tra: Liu Qing Ping Người Ngư phê duyệt: Qun Meng Li BẢN B DỊCH PHIẾU PHI KIỂM NGHIỆM Kiểm nghiệm số: YP186781256 Tên sản phẩm Số lô Quy cách Lượng ợng mẫu kiểm nghiệm Củ mài YP18678256 100g Ngày báo cáo 10/03/2018 Xuất sứ Xưởng kho Đơn vị kiểm tra Phân xưởng sản xuất phổ thông Kiểm tra tổng hợp Phương pháp lấy mẫu CP2015 Tiêu chuẩn Kết Vi phẫu Phải có đặc trưng hình thức dược liệu Củ mài _ Phải có đặc trưng vi phẫu dược liệu Củ mài SKLM Củ mài chuẩn Đúng Đạt ≤14,0 % 5,5% ≤150,0 mg/kg 21,1 mg/kg ≤ 4,0 % 1,4 % Hình thức Định tính 10/01/2018 Thùng Mục kiểm tra Nội dung Ngày lấy mẫu Hàm ẩm Tồn dư lượng SO2 Tro Chất ất chiết ethanol Két luận Người soạn thảo: Chen Yong Yan Khơng 4,0% Đạt 12,5% Dược liệu đạt tiêu chuẩn CP 2015 v chất lượng Người kiểm tra: Liu Qing Ping Người Ngư phê duyệt: Qun Meng Li BẢN B DỊCH PHIẾU PHI KIỂM NGHIỆM Kiểm nghiệm số: YP18678123 Tên sản phẩm Số lô Quy cách Lượng ợng mẫu kiểm nghiệm Sơn thù YP18678123 100g Ngày báo cáo 10/03/2018 Xuất sứ Xưởng kho Đơn vị kiểm tra Phân xưởng sản xuất phổ thông Kiểm tra tổng hợp Phương pháp lấy mẫu CP2015 Tiêu chuẩn Kết Vi phẫu Phải có đặc trưng hình thức dược liệu Sơn thù _ Phải có đặc trưng vi phẫu dược liệu Sơn thù SKLM Chất chuẩn loganin acid ursolic Đúng Đạt ≤16,0 % 7,5% ≤ 150,0 mg/kg 19,1 mg/kg ≤ 6,0 % 3,4 % Hình thức Định tính 15/01/2018 Thùng Mục kiểm tra Nội dung Ngày lấy mẫu Hàm ẩm Tồn dư lượng SO2 Tro Chất chiết ết ethanol Định lượng Két luận Người soạn thảo: Chen Yong Yan Khơng 15,0% Đạt 24,5% Hàm lượng loganin (C17H26O10) khơng 0,6% tính theo dược liệu khô kiệt 0,64% Dược liệu đạt tiêu chuẩn ẩn CP 2015 chất lượng l Người kiểm tra: Liu Qing Ping Người Ngư phê duyệt: Qun Meng Li BẢN B DỊCH PHIẾU PHI KIỂM NGHIỆM Kiểm nghiệm số: YP18678245 Tên sản phẩm Số lô Quy cách Lượng ợng mẫu kiểm nghiệm Trạch tả YP18678245 100g Ngày báo cáo 20/03/2018 Xuất sứ Xưởng kho Đơn vị kiểm tra Phân xưởng sản xuất phổ thông Kiểm tra tổng hợp Phương pháp lấy mẫu CP2015 Tiêu chuẩn Kết Vi phẫu Phải có đặc trưng hình thức dược liệu Trạch tả _ Phải có đặc trưng vi phẫu dược liệu Trạch tả SKLM Chất chuẩn 23-acetat alisol B Đúng Đạt ≤14,0 % 4,5% ≤150,0 mg/kg 17,1 mg/kg ≤5,0 % 2,4 % Hình thức Định tính 16/01/2018 Thùng Mục kiểm tra Nội dung Ngày lấy mẫu Hàm ẩm Tồn dư lượng SO2 Tro Chất ất chiết ethanol Định lượng Két luận Người soạn thảo: Chen Yong Yan Khơng 10,0% Đạt 18,5% Hàm lượng 23-acetat alisol B (C32H50O5) khơng 0,050 % tính theo dược liệu khô kiệt 0,067% Dược liệu đạt tiêu chuẩn ẩn CP 2015 chất lượng l Người kiểm tra: Liu Qing Ping Người Ngư phê duyệt: Qun Meng Li BẢN B DỊCH PHIẾU PHI KIỂM NGHIỆM Kiểm nghiệm số: YL-SDH-20170651 Tên sản phẩm Số lô Thục địa YL-SDH-20170651 Quy cách Lượng ợng mẫu kiểm nghiệm 200g Ngày báo cáo 06/05/2017 Xuất sứ Xưởng kho Đơn vị kiểm tra Phân xưởng sản xuất phổ thông Kiểm tra tổng hợp Phương pháp lấy mẫu CP2015 Tiêu chuẩn Kết Hiển vi Phải có đặc trưng hình thức dược liệu Thục địa _ Cần rõ đặc trưng kính hiển vi Cần rõ chấm màu tương đồng SKLM Chất chuẩn verbascosid Đúng Đạt ≤15,0 % 10,8% ≤ 150,0 mg/kg 11 mg/kg ≤8,0 % 6,7 % Hình thức Định tính 02/05/2017 Toàn Mục kiểm tra Nội dung Ngày lấy mẫu Hàm ẩm Tồn dư lượng SO2 Tro Chất ất chiết ethanol Định lượng Két luận Người soạn thảo: Chen Cheng Lin Đạt Khơng 65,0% 67,8% Hàm lượng verbascosid (C29H36O15) khơng 0,020 % tính theo dược liệu khô kiệt 0,1% Dược liệu đạt tiêu chuẩn ẩn CP 2015 chất lượng l Người kiểm tra: Liu Jing Ping Người Ngư phê duyệt: Yin Meng Li BẢN B DỊCH PHIẾU PHI KIỂM NGHIỆM Kiểm nghiệm số: YP1809081 Tên sản phẩm Câu Kỷ tử Ngày lấy mẫu 15/01/2018 Số lô 180904-03 Ngày báo cáo 20/01/2018 Quy cách Lượng ợng mẫu kiểm nghiệm Ninh Hạ - Trung Ninh Phân xưởng sản Đơn vị kiểm tra xuất phổ thông Thùng Xuất sứ 100g Mục kiểm tra Kiểm tra tổng hợp Phương pháp lấy mẫu CP2015 Nội dung Hình thức Vi phẫu Định tính SKLM Hàm ẩm Tồn dư lượng SO2 Tro Chất ất chiết ethanol Định lượng Kết Tiêu chuẩn Phải có đặc trưng hình thức dược ợc liệu Đạt Câu Kỷ tử _ Phải có đặc trưng vi phẫu dược ợc liệu Câu Kỷ tử Đúng Câu kỷ tử Các vết huỳnh quang có màu sắc tương ương đồng đ Đạt ≤13,0 % 9,1 % ≤ 150,0 mg/kg 21,9 mg/kg ≤ 5,0 % 4,7 % Khơng 55,0% 75,8 % Hàm lượng ợng Fructus Lycii extract tính theo glucose (C6H12O6) khơng ới 1,80% tính theo 4,1% dược liệu khơ kiệt Hàm lượng Betaine (C5H11NO2) khơng 1,14% 0,03% tính theo dược liệu khơ kiệt Két luận Người soạn thảo: Chen Yong Yan Dược liệu đạt tiêu chuẩn ẩn CP 2015 chất lượng l Người kiểm tra: Liu Qing Ping Người Ngư phê duyệt: Qun Meng Li BẢN B DỊCH PHIẾU PHI KIỂM NGHIỆM Kiểm nghiệm số: YP1806098 Tên sản phẩm Đơn bì Ngày lấy mẫu 15/06/2018 Số lô 180904-03 Ngày báo cáo 20/06/2018 Quy cách Lượng ợng mẫu kiểm nghiệm Thùng Xuất sứ Đơn vị kiểm tra 100g Mục kiểm tra Kiểm tra tổng hợp Phương pháp lấy mẫu Nội dung Hình thức Vi phẫu Định tính SKLM Hàm ẩm Tồn dư lượng SO2 Tro Chất ất chiết ethanol Định lượng Két luận Người soạn thảo: Chen Yong Yan An Huy – Hào Châu Phân xưởng sản xuất phổ thông CP2015 Tiêu chuẩn Kết Phải có đặc trưng hình thức dược liệu Đơn bì _ Phải có đặc trưng vi phẫu dược liệu Đơn bì Đạt Paeonol Đúng + ≤13,0 % 7,6% ≤150,0 mg/kg 19,8 mg/kg ≤ 5,0 % 3,1 % Khơng 15,0% 27,5% Hàm lượng paeonol (C9H10O3) khơng 1,2% tính theo dược liệu khô kiệt 2,5% Dược liệu đạt tiêu chuẩn ẩn CP 2015 chất lượng l Người kiểm tra: Liu Qing Ping Người Ngư phê duyệt: Qun Meng Li ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ DUYÊN NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CAO ĐẶC KỶ CÚC ĐỊA HOÀNG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC... tàiNghiên cứu điều chế xây dựng số tiêu chất lượng cao đặc Kỷ cúc địa hoàng? ?ược thực nhằm giải hai mục tiêu sau: - Điều chế cao đặc Kỷ cúc địa hoàng - Khảo sátmột số tiêu định tính, định lượng cao. .. tượng nghiên cứu 17 2.1.2.Phương tiện nghiên cứu 17 2.2 PHƯƠNG PHAP NGHIEN CứU 19 2.2.1 Nghiên cứu điều chế cao đặc 19 2.2.2 Xây dựng số tiêu chất lượng cao