BƯỚC đầu THIẾT kế mồi để PHÁT HIỆN ALEN đa HÌNH HLA c0302 KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

Vì tính đa hình cao nên các phương pháp nghiên cứu về HLA cần được điều chỉnh cho phù hợp, ví dụ: thay đổi vị trí mồi PCR trong intron hoặc vùng xa hơn nơi có mức độ đột biến thấp hơn h

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐẶNG MAI HƯƠNG

MÃ SINH VIÊN: 1401302

BƯỚC ĐẦU THIẾT KẾ MỒI ĐỂ

PHÁT HIỆN ALEN ĐA HÌNH

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin chân thành cám ơn sự giúp đỡ của PGS.TS Phùng Thanh Hương, người cô giáo luôn nhiệt huyết, ở bên hỗ trợ và định hướng cho tôi rất nhiều kiến thức, phương pháp và cách trình bày đề tài

Tiếp theo, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới NCS Phạm Thu Hà, người cũng giúp đỡ tôi rất nhiều về kiến thức chuyên môn, kinh nghiệm thực nghiệm và đồng hành cùng tôi vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn Phòng Thí nghiệm trung tâm - Viện Dinh dưỡng và Phòng Thí nghiệm sinh học phân tử - Viện Vệ Sinh Dịch Tễ TW đã hỗ trợ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và tiến hành thực nghiệm

Trân trọng cảm ơn tới các thầy cô Bộ môn Hóa sinh, phòng Đào Tạo Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, đã động viên và luôn bên cạnh ủng hộ tôi

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019

Đặng Mai Hương

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU iv

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ v

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Human Leukocyte Antigen (HLA) 3

1.1.1 Giới thiệu về gen HLA 3

1.1.2 Đặc điểm gen HLA 5

1.2 HLA-C và alen HLA-C*03:02 5

1.2.1 Tổng quan về HLA-C 5

1.2.2 Tổng quan về alen HLA-C*03:02 8

1.3 Tổng quan về kỹ thuật AS-PCR (Allele-specific polymerase chain reaction) 11

1.3.1 Giới thiệu về AS-PCR 11

1.3.2 Thiết kế mồi đặc hiệu alen 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu 15

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.1.2 Hóa chất, trang thiết bị 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu alen 16

2.3.2 Phương pháp thiết kế mồi chung 17

2.3.3 Phương pháp kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi 17

2.3.4 Phương pháp khuếch đại ADN bằng PCR 18

2.3.5 Phương pháp điện di ADN trên gel agarose 19

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Kết quả thiết kế quy trình PCR alen HLA-C*03:02 bằng công cụ tin sinh học 20

3.1.1 Kết quả thiết kế mồi và kiểm tra tính đặc hiệu mồi PCR exon 2 – exon 3 gen HLA-C 20

3.2.2 Kết quả thiết kế cặp mồi PCR đặc hiệu alen HLA-C*03:02 23

3.2 Kết quả bước đầu triển khai quy trình trên thực nghiệm 33

3.2.1 Kết quả triển khai thực nghiệm PCR bước 1 33

3.2.2 Kết quả triển khai thực nghiệm PCR bước 2 34

3.3 Bàn luận chung 38

3.3.1 Về kết quả thiết kế quy trình PCR alen HLA-C*03:02 bằng công cụ tin sinh học 38

3.3.2 Về kết quả bước đầu triển khai quy trình trên thực nghiệm 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AS-PCR Allele-specific polymerase

CTL Cytotoxic T Lymphocyte Tế bào lympho T độc

HLA Human Leukocyte Antigen Kháng nguyên bạch cầu người

KIRs Killer-cell Imunoglobulin-like

receptor

Thụ thể giống kháng thể của tế bào diệt tự nhiên

MHC Major Histocompability Complex Phức hợp hòa hợp tổ chức chính NGS New generation sequencing Giải trình tự thế hệ mới

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase

SCARs Severe Cutaneous Adverse

Reactions

Phản ứng bất lợi nghiêm trọng ở

da SJS Stevens Johnson Syndrome Hội chứng Stevens-Johnson TEN Toxic Epidermal Necrolysis Hoại tử biểu bì nhiễm độc SNP

Single Nucleotid Polymorphisms Đa hình đơn nucleotid

Ta Annealing Temperature Nhiệt độ bắt cặp

Tm Melting Temperature Nhiệt độ biến tính

UTR Untranslated Region Vùng không mã hóa

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 1.1 Tần suất các alen HLA-C ở cộng đồng người Kinh Việt Nam 7

Bảng 1.2 Cấu trúc alen HLA-C*03:02 8

Bảng 2.1 Quy tắc thiết kế mismatch 17

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR bước 1 18

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR bước 2 18

Bảng 3.1 Đặc điểm cặp mồi PCR exon 2 – exon 3 của Cereb và cộng sự 20

Bảng 3.2 Đặc điểm cặp mồi PCR exon 2 – exon 3 sau thiết kế và điều chỉnh 22

Bảng 3.3 Vị trí các nucleotid đặc trưng của 3 alen C*03:02, C*03:03, HLA-C*03:04 27

Bảng 3.4 Kết quả thiết kế mồi ngược đặc hiệu 3 alen HLA-C*03:02, HLA-C*03:03, HLA-C*03:04 và mồi ngược đặc hiệu 15 alen 28

Bảng 3.5 Kết quả thiết kế mồi xuôi chung cho 18 alen HLA-C 28

Bảng 3.6 Vị trí các nucleotid đặc trưng của alen HLA-C*03:02 30

Bảng 3.7 Kết quả thiết kế mồi ngược đặc hiệu alen HLA-C*03:02 và mồi ngược đặc hiệu 2 alen HLA-C*03:03, HLA-C*03:04 31

Bảng 3.8 Kết quả thiết kế mồi xuôi chung cho 3 alen HLA-C*03:02, HLA-C*03:03, HLA-C*03:04 31

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Vị trí và cấu trúc gen HLA 4

Hình 1.2 Tên alen HLA có đủ 4 cặp chữ số 5

Hình 1.3 Cấu trúc gen HLA-C 6

Hình 1.4 So sánh trình tự 3 alen HLA-C*03 ở cộng đồng người Kinh Việt Nam 8

Hình 1.5 Số lượng SNP alen HLA-C*03:02 tại 8 exon và 7 intron 8

Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 16

Hình 3.1 Vị trí gắn mồi ngược của Cereb 3BCIn3-12 và mồi ngược chỉnh sửa CRE2E3 trên 18 alen HLA-C 21

Hình 3.2 Các vị trí thiết kế mồi xuôi CFE2E3 trong vùng intron 1 22

Hình 3.3 Kết quả blast cặp mồi PCR exon 2 – exon 3 23

Hình 3.4 Kết quả so sánh trình tự exon 2 – exon 3 của 18 alen HLA-C 26

Hình 3.5 Kết quả so sánh trình tự 3 alen HLA-C*03:02, HLA-C*03:03, HLA-C*03:04 30

Hình 3.6 Sơ đồ quy trình PCR xác định kiểu gen của alen HLA-C*03:02 33

Hình 3.7 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR bước 1 34

Hình 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của 4 mẫu nghiên cứu và 1 mẫu trắng ở 3 mức nhiệt độ bắt cặp mồi khác nhau (63oC, 65oC, 67oC) 34

Hình 3.9 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR bước 2 (28 chu kỳ) 35

Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR bước 2 của cặp mồi đặc hiệu 3 alen ở 28 vòng và 3 mức nhiệt độ bắt cặp khác nhau (54oC, 56oC, 58oC) 35

Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR bước 2 của cặp mồi đặc hiệu 15 alen ở 28 vòng và 3 mức nhiệt độ bắt cặp khác nhau (54oC, 56oC, 58oC) 36

Hình 3.12 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR bước 2 (27 chu kỳ) 36

Hình 3.13 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR bước 2 của cặp mồi đặc hiệu 3 alen ở 27 vòng và 3 mức nhiệt độ bắt cặp khác nhau (54oC, 56oC, 58oC) 37

Hình 3.14 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR bước 2 của cặp mồi đặc hiệu 15 alen ở 27 vòng và 3 mức nhiệt độ bắt cặp mồi khác nhau (54oC, 56oC, 58oC) 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Họ gen HLA (Human Leukocyte Antigen – HLA) được biết đến với vai trò mã

hóa cho các phức hợp hòa hợp tổ chức chính (Major Histocompability Complex - MHC)

[54] Chức năng chiếm ưu thế của các phân tử MHC lớp I và lớp II này là liên kết các

peptid từ môi trường của tế bào và trình diện các peptid này trên bề mặt tế bào để hệ thống miễn dịch kiểm tra Đây là một quá trình quan trọng trong phản ứng của hệ thống miễn dịch để tiêu diệt mầm bệnh xâm nhập và để ngăn ngừa hệ thống miễn dịch nhắm vào các tế bào của chính nó [45]

Với chức năng quan trọng trong miễn dịch, hơn một trăm bệnh (đã được xác định

ở hầu hết các hệ cơ quan chính) có liên quan đến các gen HLA lớp I và II ở người, cũng như với một số gen không phải là HLA trong khu vực này (ví dụ, bổ thể C4) và phần lớn trong số chúng được coi là bệnh tự miễn [15], [54] Trong đó, phản ứng quá mẫn do thuốc là mối quan tâm lớn và là gánh nặng cho các hệ thống chăm sóc sức khỏe quốc gia do mức độ thường nghiêm trọng, tỷ lệ nhập viện cao và tỷ lệ tử vong cao, và đã được chứng minh có mối liên quan với các alen HLA của người [2]

Phản ứng dị ứng thuốc phổ biến nhất xảy ra ở da Mức độ của các phản ứng thay đổi đa dạng, từ các ban ngứa dị ứng đến các triệu chứng có khả năng đe dọa đến tính mạng Dị ứng thuốc là một nguyên nhân quan trọng của bệnh suất và tử vong do thuốc Hội chứng Stevens Johnson (Stevens Johnson syndrome - SJS) và hoại tử biểu bì nhiễm độc (toxic epidermal necrolysis -TEN) là những phản ứng bất lợi nghiêm trọng ở da gây

ra bởi thuốc, được đặc trưng bởi sự bong lan rộng của lớp biểu bì (SJS: <10% diện tích

bề mặt cơ thể và TEN: >30% diện tích bề mặt cơ thể) và sự bào mòn của màng nhầy [2]

Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu lâm sàng cho thấy mối liên quan chặt chẽ giữa một số alen cụ thể với phản ứng quá mẫn do thuốc gây ra Trong đó, tiêu biểu là phản ứng dị ứng 3 thuốc abacavir, carbamazepin và allopurinol đã được chứng minh có mối liên quan với một số alen HLA [13] Các phản ứng dị ứng có thể phát triển thành các phản ứng bất lợi nghiêm trọng ở da, như SJS/TEN cùng nhiều biến chứng nguy hiểm

và tỷ lệ tử vong dao động từ 10% đến hơn 30% [13] Chính vì vậy, việc xác định các alen HLA liên quan đến dị ứng thuốc có vai trò lớn trên chăm sóc lâm sàng, cho phép xác định có hay không có alen ở bệnh nhân trước khi quyết định sử dụng thuốc, làm giảm nguy cơ gặp các phản ứng dị ứng nghiêm trọng cho bệnh nhân Do đó, một số alen

trình để xác định các alen này Ví dụ như quy trình PCR xác định alen HLA-B*58:01 liên quan đến phản ứng dị ứng allopurinol hay quy trình RFLP-PCR xác định alen HLA-

A*31:01 liên quan đến phản ứng dị ứng Carbamazepin [52], [55]

Alen HLA-C*03:02 cũng đã được chứng minh có mối liên quan chặt chẽ giữa

phản ứng bất lợi nghiêm trọng trên da (SJS hoặc TEN) với allopurinol ở nhiều cộng đồng trên thế giới như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Châu Âu [22], [10], [28], [50] Tuy nhiên, cho đến nay chưa có nghiên cứu nào hay quy trình nào để xác định

riêng kiểu gen của alen HLA-C*03:02

Với những lý do trên, đề tài “Bước đầu xây dựng quy trình phát hiện alen đa

hình HLA-C*03:02” được thực hiện với 2 mục tiêu:

 Thiết kế mồi và xây dựng quy trình xác định kiểu gen đối với alen

HLA-C*03:02

 Bước đầu triển khai quy trình đã xây dựng trên thực nghiệm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Human Leukocyte Antigen (HLA)

1.1.1 Giới thiệu về gen HLA

Họ gen HLA mã hóa cho một nhóm các protein được gọi là phức hợp phù hợp tổ

chức chính (Major Histocompatibility Complex – MHC) hay phức hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA), nằm trong vùng 6p21.3 trên cánh tay ngắn của nhiễm sắc thể số

6, có chiều dài tổng cộng là 3.600kb hoặc 4,6 x 106 bazơ nitơ gồm hơn 250 gen và giả gen (pseudogenes) trong đó ít nhất 150 gen được biểu hiện thành protein [1], [45], [54]

Phức hợp HLA giúp hệ thống miễn dịch phân biệt các protein của cơ thể với các

protein được tạo ra bởi những nhân tố xâm nhập ngoại lai như virus và vi khuẩn HLA được chia thành ba khu vực là lớp I, lớp II và lớp III Trong đó, vùng HLA lớp I gồm các gen mã hóa cho chuỗi nặng α của các phân tử MHC lớp I "cổ điển" (HLA-A, HLA-

B và HLA-C) và các gen lớp I khác của HLA như HLA-E, HLA-F, HLA-G cùng một loạt

các gen khác, nhưng không phải tất cả đều liên quan đến miễn dịch [1], [45], [54] Các gen mã hóa cho phân tử MHC lớp I "cổ điển" chứa 8 exon với chức năng của từng exon là: exon 1 mã hóa vùng 5’ UTR (vùng không mã hóa) và peptid dẫn đường, exon 2 và 3

mã hóa miền alpha1 và alpha2 - vùng liên kết với peptid, exon 4 mã hóa miền alpha3, exon 5 mã hóa vùng xuyên màng và exon 6 và 7 mã hóa đuôi tế bào chất nội bào Vùng 3’ UTR và vị trí đuôi poly A được mã hóa bởi exon 8 Các đa hình trong exon 2 và exon

3 chịu trách nhiệm về tính đặc hiệu liên kết peptid của mỗi lớp phân tử [45] Vùng HLA lớp II gồm các gen mã hóa cho cả chuỗi nặng α và chuỗi nhẹ β của các phân tử MHC

lớp II (HLA-DP, HLA-DQ và HLA-DR) cùng một số gen khác hỗ trợ trong việc xử lý và

trình diện kháng nguyên [1], [54] Và vùng ở giữa HLA lớp I và lớp II được gọi là HLA lớp III Mặc dù khu vực này không chứa bất kỳ gen nào của HLA, nhưng nó chứa nhiều gen quan trọng trong đáp ứng miễn dịch, bao gồm một số thành phần bổ thể (C2, C4 và yếu tố B) và một số cytokin có vai trò trong quá trình viêm [45], [54]

Vị trí và cấu trúc họ gen HLA được thể hiện trong hình 1.1

Hình 1.1 Vị trí và cấu trúc gen HLA [54]

Các gen HLA có thể có nhiều biến thể khác nhau Một số gen HLA có hàng trăm phiên bản đã được xác định – mỗi phiên bản gọi là một alen HLA [69], mỗi alen có ít nhất một phân loại bốn chữ số (ví dụ HLA-A*02:12), cụ thể:

 Chữ A: biểu thị tên gen trong họ HLA

 Cặp chữ số đầu tiên: mô tả loại alen, thường tương ứng với các kháng nguyên được xác định bằng phương pháp huyết thanh học

 Cặp chữ số thứ hai: cho biết protein HLA nào được tạo ra Chúng được đặt tên theo thứ tự phát hiện

 Ngoài ra, tên các alen còn có thể có cặp chữ số thứ 3 và thứ 4 – thể hiện sự khác nhau của các trình tự nucleotid không mã hóa hay các thay thế nucleotid đồng nghĩa trong vùng mã hóa, sự khác biệt này không có ý nghĩa nhiều trên lâm sàng [65]

Ví dụ tên của một alen HLA đủ 4 chữ số được thể hiện trong hình 1.2

Hình 1.2 Tên alen HLA có đủ 4 cặp chữ số [65]

1.1.2 Đặc điểm gen HLA

Gen HLA ở người, đặc biệt là gen HLA lớp I và lớp II, có tính đa hình cao Ví dụ, đến nay, hơn 4300 alen đã được biết đến với gen HLA-B và hơn 1900 alen với gen HLA-

DRB1 [54] Số lượng SNP (Single Nucleotid Polymorphisms - đa hình đơn nucleotid)

trong hệ gen HLA tương đối lớn với một SNP mỗi 200 - 300 bp (base pair – cặp base)

Các loại biến thể có thể xảy ra bao gồm các đột biến điểm, indel (đột biến thêm hoặc bớt một nucleotid) và các trình tự đơn lặp lại (ví dụ GCGCGC, AAAAA ) Đặc biệt, trong các vùng exon đa hình cao, có thể có 50 - 100 SNP nằm trong khu vực dài 100-

200 bp, nhiều biến thể trong số đó gây ra thay đổi trình tự axit amin Vì tính đa hình cao

nên các phương pháp nghiên cứu về HLA cần được điều chỉnh cho phù hợp, ví dụ: thay

đổi vị trí mồi PCR trong intron hoặc vùng xa hơn nơi có mức độ đột biến thấp hơn hoặc nhận dạng lại toàn bộ các biến thể của trình tự HLA để không bỏ sót alen trong phản ứng chuỗi polymerase và phát hiện được các tổ hợp alen cụ thể [3]

1.2 HLA-C và alen HLA-C*03:02

1.2.1 Tổng quan về HLA-C

1.2.1.1 Vị trí và cấu trúc

Gen HLA-C thuộc họ gen HLA lớp I ở người, nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc

thể số 6 tại ví trí 6p21.33, có tổng chiều dài là 3388 nucleotid và bắt đầu từ nucleotid

31.268.749 đến nucleotid 31.272.136 Cấu trúc gen HLA-C gồm 8 exon, 7 intron dài

2894 nucleotid và hai vùng UTR (untranslated region) không mã hóa cho protein ở 2 đầu của gen (hình 1.3) [68]

Hình 1.3 Cấu trúc gen HLA-C [64]

1.2.1.2 Chức năng HLA-C

Gen HLA-C mã hóa cho chuỗi nặng alpha (3 vùng alpha 1, alpha2, alpha 3) của

phân tử HLA-C (MHC) lớp I Phân tử này tham gia vào trình diện kháng nguyên nội sinh tương tự các phân tử MHC lớp I Khác với HLA-A và HLA-B, mức độ biểu hiện

bề mặt của phân tử HLA-C thấp hơn trên các tế bào xôma Đồng thời, dù HLA-C cũng

giới hạn sự nhận diện kháng nguyên của các tế bào lympho T độc (CTL- Cytotoxic T

Lymphocyte) nhưng chúng ít gặp hơn nhiều so với CTL bị giới hạn bởi HLA-A hoặc

HLA-B Thay vào đó, HLA-C đóng vai trò là một phối tử chính đối với các các thụ thể

giống kháng thể của tế bào diệt tự nhiên (KIRs – Killer-cell Imunoglobulin-like receptor) - điều chỉnh hoạt động gây độc tế bào của các tế bào này [41]

Gen HLA nói chung và HLA-C nói riêng được biết đến là hệ kháng nguyên đa

hình và phức tạp ở người, có liên quan đến rất nhiều bệnh Trong cơ sở dữ liệu của

GWAS Catalog, có 37 nghiên cứu về các SNP nằm trong gen HLA-C liên quan đến 44

kiểu hình khác nhau ở người [72] Ví dụ SNP tại vị trí rs11967684-A liên quan đến tăng

tỷ lệ phần trăm hồng cầu lưới (P = 2 x 10-24)[4]; SNP tại vị trí rs2853953-A liên quan đến nhiễm viêm gan B mạn tính (P = 5 x 10-20) [24]; SNP tại vị trí rs116718137-C liên quan đến ung thư phổi (P = 8 x 10-17) [40];…

Ngoài ra, các alen của gen HLA-C cũng có vai trò quan trọng liên quan đến phản

ứng có hại của thuốc hoặc tác dụng của thuốc, cụ thể đã có 11 thuốc được nghiên cứu liên quan đến các alen này: allopurinol, carbamazepin, methazolamid, methotrexat,

nevirapin, pegINF alpha-2b, [68] Ví dụ alen HLA-C*08:01 làm tăng nguy cơ gặp hoại

tử biểu bì, hội chứng Stevens-Johnson khi sử dụng carbamazepin [46]; Alen

HLA-C*01:02 làm tăng nguy cơ gặp hoại tử biểu bì, hội chứng Stevens-Johnson khi sử dụng

methazolamid [30], [59]; Alen HLA-C*04:01 làm tăng nguy cơ gặp phản ứng thuốc với

tăng bạch cầu ái toan và các triệu chứng toàn thân, hoại tử biểu bì, nhiễm độc, mẫn cảm, hội chứng Stevens-Johnson khi sử dụng nevirapine [29], [36]…

1.2.1.3 Các alen HLA-C ở người Kinh Việt Nam

Theo nghiên cứu của Bạch Khánh Hòa trên 170 người Kinh Hà Nội, có 18 alen

C đã được ghi nhận Trong đó 3 alen C*01:02; C*07:02;

HLA-C*08:01 có tần suất lớn nhất; 3 alen HLA-C*03:02; HLA-C*03:03; HLA-C*03:04 có

tần suất xấp xỉ nhau và alen HLA-C*03:02 có tần suất cao thứ 4 trong cộng đồng (Bảng

1.1) [20]

Bảng 1.1 Tần suất các alen HLA-C ở cộng đồng người Kinh Việt Nam [67]

So sánh trình tự các alen trên bằng trang web http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/, cho thấy số lượng SNP của các alen nói trên tập trung nhiều nhất từ exon 2 đến exon 3 với 65 trên tổng số 183 vị trí có SNP nằm

trong 8 exon và 7 intron của 18 alen này Trong đó, 3 alen HLA-C*03 ở người Kinh Việt Nam gồm HLA-C*03:02, HLA-C*03:03 và HLA-C*03:04 có trình tự rất giống nhau,

chỉ khác nhau 4 nucleotid, với 3 nucleotid ở exon 2 và 3, 1 nucleotid ở exon 5 (được thể

hiện trong hình 1.4) Vì vậy, quy trình thiết kế mồi PCR để xác định alen HLA-C*03:02

và phân biệt với 2 alen HLA-C*03:03 và HLA-C*03:04 tương đối phức tạp và khó khăn

Hình 1.4 So sánh trình tự 3 alen HLA-C*03 ở cộng đồng người Kinh Việt Nam [66]

1.2.2 Tổng quan về alen HLA-C*03:02

So với alen nguyên bản HLA-C*01:02:01:01, alen HLA-C*03:02 có 37 SNP,

trong đó exon 2 và exon 3 có nhiều SNP nhất (hình 1.5) [35]

Hình 1.5 Số lượng SNP alen HLA-C*03:02 tại 8 exon và 7 intron [35]

1.2.2.2 Liên quan giữa alen HLA-C*03:02 với bệnh tật và thuốc

Alen HLA-C*03:02 được tìm thấy và báo cáo đầu tiên vào năm 1992 bởi J

Zemmour [63] Đến năm 2005, lần đầu tiên có một nghiên cứu công bố về mối liên quan

giữa các bệnh nhân có alen HLA-C*03:02 được điều trị bằng allopurinol có thể tăng

nguy cơ phản ứng bất lợi nghiêm trọng ở da (Severe cutaneous adverse reactions - SCARs) ở cộng đồng người Trung Quốc với mối tương quan mạnh: OR = 97,7 (P = 1,4x10-19) giữa bệnh nhân sử dụng allopurinol gặp SCARs có alen HLA-C*03:02 với bệnh nhân dung nạp allopurinol có alen HLA-C*03:02 và OR = 62,3 (P = 2,5x10-13)

giữa bệnh nhân sử dụng allopurinol gặp SCARs có alen HLA-C*03:02 với dân số nói chung có alen HLA-C*03:02 [22]

Sau đó, đã có thêm một loạt các nghiên cứu chứng minh và khẳng định hơn nữa việc làm tăng nguy cơ gặp hội chứng Stevens-Johnson (Stevens Johnson syndrome - SJS) hoặc hoại tử biểu bì nhiễm độc (toxic epidermal necrolysis -TEN) ở bệnh nhân có

alen HLA-C*03:02 sử dụng allopurinol trong các cộng đồng khác nhau Nghiên cứu của

Cristallo AF và cộng sự vào năm 2011 trong cộng đồng người Châu Âu cho thấy: 8,6%

bệnh nhân sử dụng allopurinol gặp SJS/TEN có alen HLA-C*03:02 so với 0% ở nhóm

chứng (P = 0,00105) [10] Cùng trong năm đó, một nghiên cứu trên người Hàn cũng cho giá trị có sự khác biệt lớn với P = 9,39x10-11 giữa bệnh nhân sử dụng allopurinol gặp

SCARs có alen C*03:02 với bệnh nhân dung nạp allopurinol có alen

HLA-C*03:02 và P = 8,58x10-12 với dân số nói chung [28] Đến năm 2013, một nghiên cứu trên cộng đồng người Nhật cũng cho kết quả tương tự với p < 5,62x10-8 so với mẫu chứng là dân số khỏe mạnh [50]

Ngoài việc làm tăng nguy cơ gặp SCARs, alen HLA-C*03:02 cũng cho thấy làm

tăng phát ban trên da ở bệnh nhân sử dụng allopurinol: OR= 4,94 (P= 0,05) so với bênh nhân dung nạp allopurinol và OR= 5,17 (P= 0,04) so với dân số chung Hàn Quốc [26] Tuy nhiên đây chỉ là kết quả phụ của nghiên cứu, giá trị OR rất gần 1 (1,03 với 1,08) đồng thời mới chỉ có một nghiên cứu cho thấy nguy cơ trên

Đối với bệnh, alen HLA-C*03:02 làm tăng nguy cơ bệnh nhân viêm khớp dạng

thấp bị viêm mạch so với bệnh nhân viêm khớp dạng thấp không có bệnh lý ngoài khớp với p < 0,001 [51] Và mới đây vào năm 2018, một nghiên cứu phân tích meta trên 1,3

triệu dân Trung Quốc trưởng thành khỏe mạnh cho thấy alen HLA-C*03:02 có liên quan

mạnh mẽ đến BMI (P = 4,45×10-8) dẫn đến gây nguy cơ thừa cân (P = 2,08x10-5) và béo phì (P = 4,05x10-3) [48]

1.2.2.3 Các phương pháp đã được sử dụng để xác định alen HLA-C*03:02

Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào công bố quy trình phát hiện riêng alen

HLA-C*03:02 ở người Việc xác định alen này chủ yếu trong các nghiên cứu về tần

xuất các alen HLA nói chung trong các cộng đồng với các phương pháp như giải trình

tự Sanger [44], giải trình tự thế hệ mới NGS (New generation sequencing) [5], [17], multiplex real-time PCR [31] Cả ba phương pháp này được sử dụng với mục đích chính

để sàng lọc các gen, trong đó có alen HLA-C*03:02

Giải trình tự Sanger được tác giả Peterson TA và cộng sự áp dụng cho các sản

phẩm PCR exon 2 – exon 3 của gen HLA-C để xác định loại và tần xuất alen HLA-C

[44] Đây là một kỹ thuật phổ biến trong nghiên cứu di truyền phân tử, cung cấp phân tích các ADN ở cấp độ nucleotid [39] Vì vậy, ưu điểm lớn nhất trong phát hiện SNP bằng phương pháp này là thông tin đầy đủ mà nó mang lại Trong một thí nghiệm, loại,

vị trí và trình tự chuỗi của mỗi chuỗi đa hình đều được xác định hoàn toàn Tuy nhiên, phương pháp này cần các công cụ phân tích trình tự tự động đắt tiền [34]

Phương pháp khác được sử dụng xác định HLA-C*03:02 là giải trình tự thế hệ 2

– pyrosequencing 454 [5], [17] Phương pháp phân tích này dựa trên nguyên lý "giải trình tự bằng tổng hợp" được gọi là pyrosequencing với thời gian chạy 10h, đầu ra cho mỗi lần chạy là 0,5 – 1 Gb (1Gb = 1 tỷ cặp base) Vì vậy phương pháp này thích hợp với các nghiên cứu về toàn bộ bộ gen người với ưu điểm độ chính xác, đặc hiệu cao, đến

95 – 98%, nhưng thời gian chậm và rất tốn kém (dựa trên giá niêm yết hiện tại cho hệ thống GS-FLX, chi phí hiện tại cho tất cả các thuốc thử để thực hiện một thử nghiệm duy nhất là 7000 đô la) [19], [27]

Áp dụng kỹ thuật multiplex real-time PCR để xác định các alen HLA-C, tác giả

Koehler RN và cộng sự thực hiện hai phản ứng real-time PCR song song với khuôn là

vùng exon 2 – exon 3 gen HLA-C: một phản ứng chứa cặp mồi đặc hiệu các alen có gắn

đầu dò phát huỳnh quang thích hợp; một phản ứng gồm cặp mồi khuếch đại một vùng bất biến gắn đầu dò phát huỳnh quang khác, với vai trò nội kiểm, giúp xác định phản ứng chứa cặp mồi đặc hiệu là dương hay âm tính [31] Kỹ thuật này cho kết quả khuếch đại ADN mục tiêu được hiển thị sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng [13] Vì vậy, ngoài định tính, real-time PCR có thể định lượng gen mục tiêu ban đầu có trong mẫu và không

cần thêm các phân tích sau khuếch đại (ví dụ điện di trên gel agarose) Hơn nữa, kỹ thuật real-time PCR sử dụng phát hiện sản phẩm dựa trên huỳnh quang nên mang lại độ nhạy cao hơn [39], [49] Mặc dù vậy, phương pháp này cũng có một số nhược điểm như thiết

bị, hóa chất sinh phẩm sử dụng đắt hơn so với kỹ thuật PCR cơ bản, cán bộ thực hiện cần được đào tạo chuyên sâu về các quy trình phân tích như thao tác trên thiết bị realtime, thiết kế đầu dò, đọc kết quả [12], [21]

Vì vậy, khóa luận này đề xuất một phương pháp mới để phát hiện alen

HLA-C*03:02, là kỹ thuật AS-PCR (Allele-specific polymerase chain reaction) cùng việc sử

dụng công cụ tin sinh học để thiết kế mồi và thiết kế quy trình PCR, với độ đặc hiệu cao, thời gian thực hiện ngắn, chi phí thấp, kỹ thuật tương đối đơn giản, cho thấy tiềm năng

áp dụng trong lâm sàng của kỹ thuật này [14]

1.3 Tổng quan về kỹ thuật AS-PCR (Allele-specific polymerase chain reaction)

1.3.1 Giới thiệu về AS-PCR

Phản ứng khuếch đại chuỗi đặc hiệu allele (AS-PCR) là một ứng dụng của phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) PCR là một quá trình tuần hoàn; với mỗi chu kỳ, số lượng ADN mục tiêu tăng gấp đôi Các chuỗi xoắn kép trong mỗi ADN mục tiêu được phân tách bằng nhiệt độ và sau đó được làm nguội, cho phép các mồi gắn vào các chuỗi đó Sau đó, ADN polymerase kéo dài các mồi bằng cách thêm nucleotid vào theo quy luật bổ sung Như vậy, rất nhiều các bản sao của các chuỗi ADN mục tiêu ban đầu được tạo ra sau các chu kỳ của phản ứng PCR [42]

Kỹ thuật PCR nói chung cũng như AS-PCR nói riêng đòi hỏi 4 thành phần chính:

 ADN polymerase chịu nhiệt xúc tác phản ứng tổng hợp trình tựADN mới sau khi mồi bắt cặp với ADN mục tiêu

 Các nucleotid triphosphat (nguyên liệu để tạo ADN)

 Khuôn ADN được khuếch đại: ADN của bộ gen, được phân lập từ các tế bào hoặc mô, hoặc ADN thu được từ các mẫu ARN thông qua phiên mã ngược

 Mồi đặc hiệu gen (Primer): mồi là các oligonucleotid đặc trưng, trình tự ngắn,

có trình tự bổ sung với hai đầu của đoạn ADN cần nhân bản Mồi bên trái bổ sung cho sợi ADN 3’5’ – gọi là mồi xuôi (Forward primer, ký hiệu là F); ngược lại, mồi bên phải bổ sung cho sợi ADN 5’3’ – gọi là mồi ngược (reverse primer, ký hiệu R) [23] Trong AS – PCR, các mồi AS đặc hiệu với

đầu 3' của đoạn mồi đặc hiệu này Alen mục tiêu được khuếch đại dễ dàng, trong khi các alen khác không hoặc kém bị khuếch Sự khuếch đại kém là kết quả của sự không phù hợp giữa mẫu ADN và đầu 3’ mồi AS, ngăn cản hiệu quả kéo dài đầu 3' của Taq polymerase [6]

Nguyên tắc của phản ứng PCR là tổng hợp và khuếch đại sợi ADN mục tiêu từ mạch khuôn nhờ hoạt động enzym polymerase và cặp mồi đặc hiệu cho đoạn ADN này bằng ba bước:

 Bước 1 – Biến tính: ADN sợi kép bị biến tính thành các sợi đơn bằng cách làm nóng đến 94-96oC

 Bước 2 – Bắt cặp mồi: Phản ứng hạ nhiệt độ, các đoạn ADN ngắn đặc biệt được gọi là mồi được bắt cặp với các sợi ADN này ở nhiệt độ thích hợp để mồi ghép cặp bổ sung đặc hiệu với sợi ADN cần khuếch đại Nhiệt độ bắt cặp (Ta – annealing temperature) phụ thuộc vào nhiệt độ biến tính (Tm – melting temperature) của mồi, thường được xác định bằng cách tối ưu hóa

 Bước 3 – Khuếch đại: Hỗn hợp được gia nhiệt đến 72°C, đó là nhiệt độ tối

ưu cho hoạt động của Taq ADN polymerase Polymerase xúc tác sự tổng hợp các sợi ADN mới, sử dụng các nucleotid triphosphat có mặt trong hỗn hợp

để tạo ra chuỗi bổ sung (bắt đầu từ mồi) với trình tự cụ thể, được gọi là quá trình kéo dài [23], [32]

Ngoài nguyên tắc chung của phản ứng PCR, AS-PCR còn cần 3 mồi tương ứng với 2 phản ứng PCR được thực hiện song song cho mỗi SNP để xác định kiểu gen đồng hợp tử, dị hợp tử của alen mục tiêu: một phản ứng gồm mồi đặc hiệu alen thứ nhất (xuôi hoặc ngược) và một mồi chung (ngược hoặc xuôi tương ứng) để khuếch đại alen mục tiêu; và một phản ứng cũng gồm mồi đặc hiệu alen thứ hai và một mồi chung để khuếch đại các alen còn lại [14]

1.3.2 Thiết kế mồi đặc hiệu alen

Tiêu chí của thiết kế mồi PCR nói chung là để cân bằng giữa tính đặc hiệu và hiệu quả của phản ứng khuếch đại Kích cỡ mồi tối ưu là từ 18-28 nucleotid (kích thước ngắn hơn ít giảm tính đặc hiệu nhưng tăng hiệu quả, dài hơn thì ngược lại) Nhiệt độ biến tính của mỗi mồi nên cách nhau từ 2-5oC để đảm bảo đạt được nhiệt độ bắt cặp thích hợp cho cả hai mồi Nhiệt độ biến tính các mồi lớn hơn 50oC thường sẽ làm tăng tính đặc hiệu và hiệu quả của phản ứng khuếch đại Với các sản phẩm PCR dài, Tm từ

62 đến 72oC được khuyến cáo (Tm có thể được tính trong các chương trình thiết kế mồi hoặc tính bằng công thức tính Tm= 2(A+T) + 4(G+C)) Cần hạn chế trình tự bổ sung trong một mồi hoặc giữa hai mồi do tạo cấu trúc thứ cấp trong mồi và làm giảm lượng

sản phẩm Nồng độ GC mồi lý tưởng là 40-60% [16]

Phương pháp AS-PCR là phương pháp phù hợp để phát hiện nucleotid SNP, cho phép phát hiện trực tiếp các SNP trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử được trang bị tối thiểu bằng cách phân tích các sản phẩm PCR trong gel agarose nhuộm màu ethydium hoặc polyacrylamid [14], [53] Vì vậy, ngoài tiêu chí chung của mồi PCR, cặp nucleotid đầu 3’ của hai mồi đặc hiệu alen (allele specific – AS) được lựa chọn cần trùng với vị trí SNP của alen cần xác định để phân biệt các alen Tuy nhiên, sự khác biệt cặp nucleotid duy nhất ở đầu 3' của hai mồi AS không phải lúc nào cũng đảm bảo phân biệt chính xác hai alen Vì vậy, cần một cải tiến quan trọng cho mồi AS là ngoài cặp nucleotid khác biệt tại đầu 3’ của hai mồi, thiết kế thêm một nucleotid mismatch (là nucleotid không bổ sung với khuôn cần khuếch đại của các alen) trong bốn nucleotid gần đầu 3' của mồi AS để làm giảm nguy cơ khuếch đại sai alen Nucleotid không bổ sung này làm tăng tính đặc hiệu của mồi và được sử dụng hiệu quả trong thực tế [14]

Để thiết kế mồi đặc hiệu cho alen, bước đầu cần so sánh trình tự các alen có thể

có để xác định vị trí SNP của alen mục tiêu, từ đó thiết kế mồi dựa trên vị trí SNP đã xác định được, và cuối cùng là kiểm tra lại tính đặc hiệu của đoạn mồi đã thiết kế Các bước này có thể được hỗ trợ bằng kỹ thuật tin sinh học (là một lĩnh vực liên ngành, chủ yếu liên quan đến sinh học phân tử, di truyền học và áp dụng các kỹ thuật tin học (như toán học ứng dụng, khoa học máy tính và thống kê) để hiểu và sắp xếp thông tin liên quan đến các phân tử sinh học theo quan điểm tính toán [7], [38])

Các công cụ so sánh cấu trúc chuỗi ADN, ARN và chuỗi protein là một trong những công cụ phổ biến nhất trong các lĩnh vực tin sinh học Đây là phương pháp sử dụng thuật toán để sắp xếp hai hoặc nhiều trình tự nhằm đạt được sự giống nhau tối đa Các trình tự này có thể được xen bằng các khoảng trống (thường được diễn tả bằng các gạch nối ngang) tại các vị trí có thể sao chotạo thành các cột giống nhau hoặc tương tự nhau Các bắt cặp không giống nhau trong trình tự tương ứng với các đột biến thay đổi nucleotid/acid amin và các khoảng trống tương ứng với phần đột biến thêm vào hoặc xóa đi [7], [58] Hiện nay có bốn thuật toán khác nhau để so sánh cấu trúc các chuỗi,

trong đó khóa luận sử dụng chương trình Multalin dùng thuật toán sắp thẳng hàng lũy tiến với ưu điểm nhanh, tốn ít thời gian, bộ nhớ [25]

Sau khi lựa chọn được vị trí SNP từ kết quả so sánh cấu trúc chuỗi, mồi đặc hiệu alen có thể được thiết kế thủ công hoặc sử dụng một số công cụ cho phép thiết kế riêng mồi đặc hiệu alen như công cụ WASP hoặc BatchPrimer3… [56], [61] Ngoài ra, trong thiết kế mồi đặc hiệu alen, chọn được mồi đặc hiệu trong phản ứng PCR là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến kết quả phản ứng chuỗi polymerase [60] Để kiểm tra tính đặc hiệu của mồi, cần có một công cụ tin sinh học chứa ngân hàng dữ liệu về di truyền và

có khả năng so sánh trình tự các chuỗi sinh học này Trong đó, công cụ khai thác dữ liệu phổ biến nhất là BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - Công cụ tìm kiếm các trình tự tương đồng) [9] Tuy nhiên, việc kiểm tra mục tiêu tiềm năng của cặp mồi bằng BLAST không phải là một quá trình dễ dàng vì cần kiểm tra nhiều đặc điểm giữa mồi

và mục tiêu, chẳng hạn như số lượng và vị trí của các nucleotid bổ sung phù hợp, hướng của mồi và khoảng cách giữa mồi xuôi và mồi ngược Việc này thường làm tốn nhiều thời gian và khó khăn cho người dùng Hơn nữa, mặc dù chương trình BLAST đã được

sử dụng rộng rãi để phát hiện các mục tiêu của mồi, nhưng thực tế nó không phải là một công cụ lý tưởng cho mục đích này vì thuật toán BLAST sử dụng không nhất thiết phải trả về thông tin khớp hoàn toàn trên toàn bộ phạm vi mồi Vì vậy, một công cụ mới Primer-BLAST là sự kết hợp của Blast và một thuật toán khác, vừa kế thừa ưu điểm của Blast như ngân hàng dữ liệu lớn, vừa khắc phục các nhược điểm kể trên của Blast, giúp kiểm tra tính đặc hiệu của mồi dễ dàng, nhanh chóng hơn Công cụ này cũng giúp thiết

kế mồi thích hợp còn lại dựa trên đoạn trình tự đích và một mồi sẵn có [60] Do đó, có thể sử dụng để thiết kế mồi chung phù hợp trong AS-PCR sau khi đã thiết kế được mồi đặc hiệu alen

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Bốn mẫu ADN dân tộc Kinh ở Hà Nam được sử dụng để khảo sát quy trình xác định kiểu gen trên thực nghiệm Các mẫu được thu thập trong dự án “Nghiên cứu thuần tập 5 năm về bệnh đái tháo đường typ 2 và hội chứng chuyển hóa ở người Việt Nam: Vai trò yếu tố di truyền và lối sống” lưu trữ ở tủ -80oC tại Viện Dinh dưỡng

2.1.2 Hóa chất, trang thiết bị

2.1.2.1 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong đề tài gồm: GoTaq Green Master mix 2x (Promega, Mỹ), nước tinh sạch GIBCO® UltraPure Distilled Water (Invitrogen, Mỹ), thạch Agarose (Bio basic, Canada), thuốc nhuộm RedsafeTM (Intron Biotechnology, Hàn Quốc), đệm điện di UltraPureTM 10X TBE Buffer (Invitrogen, Mỹ), Sizer-100DNA marker (Intron Bio, Hàn Quốc), các mồi PCR (IDT, Mỹ)

2.1.2.2 Trang thiết bị

Máy NanoDrop 2000 (Nhật Bản), Lò vi sóng SANYO EM – G7560 V/W (Nhật Bản), máy PCR mastercycler gradient (Eppendorf, Mỹ), máy PCR 2720 Thermal Cycler (Nhật Bản), máy điện di Mulpid® - 2 plus (Nhật Bản), máy minispin Hermle Z130M (Đức), máy chụp Geldoc (Bio Rad, Mỹ), máy lắc vortex (Eppendorf, Mỹ), tủ an toàn sinh học, tủ lạnh – 40C (Toshiba, nhật Bản), tủ lạnh – 200C (Toshiba, nhật Bản), Pipet

2.2 Nội dung nghiên cứu

Đề tài gồm hai mục tiêu: Thiết kế mồi và xây dựng quy trình xác định kiểu gen

đối với alen HLA-C*03:02; Bước đầu triển khai quy trình đã xây dựng trên thực nghiệm

Để giải quyết mục tiêu thứ nhất, cần ba nội dung chính:

 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho exon 2 – exon 3 của gen HLA-C và kiểm tra

tính đặc hiệu của cặp mồi này trên toàn bộ hệ gen của người bằng công cụ Primer-BLAST

 Thiết kế ba mồi gồm hai mồi ngược đặc hiệu alen và một mồi xuôi chung để

thực hiện song song hai phản ứng PCR: khuếch đại đặc hiệu 3 alen

HLA-C*03:02, HLA-C*03:03 và HLA-C*03:04 và khuếch đại đặc hiệu 15 alen HLA-C còn lại trong tổng số 18 alen HLA-C ở cộng đồng người Kinh Việt

 Thiết kế ba mồi gồm hai mồi ngược đặc hiệu alen và một mồi xuôi chung để

thực hiện song song hai phản ứng PCR: khuếch đại đặc hiệu alen

HLA-C*03:02 và khuếch đại đặc hiệu hai alen HLA-C*03:03 và HLA-C*03:04

Với mục tiêu thứ hai, chúng tôi tiến hành khảo sát trên thực nghiệm hai bước đầu của quy trình đã xây dựng và kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di Nội dung nghiên cứu được trình bày trong hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu alen

2.3.1.1 Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu alen

Nguyên tắc: Để thiết kế mồi đặc hiệu alen, đầu tiên cần xác định các alen

HLA-C có trong cộng đồng người Kinh Việt Nam từ nghiên cứu của Bạch Khánh Hòa và cộng

sự năm 2018 [20] Sau đó, lấy trình tự các alen HLA-C có trong cộng đồng người Kinh

Việt Nam từ cơ sở dữ liệu HLA https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html và so sánh các trình tự này bằng công cụ Multalin http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/ để xác định vị trí SNP thiết kế mồi đặc hiệu alen Cuối cùng là thiết kế hai mồi đặc hiệu alen dựa vào vị trí SNP đã lựa chọn bằng công cụ BatchPrimer3 https://probes.pw.usda.gov/cgi-bin/batchprimer3/batchprimer3.cgi để cho mồi có các thông số phù hợp nhất

2.3.1.2 Phương pháp thiết kế mismatch bổ sung cho mồi đặc hiệu alen

Nguyên tắc: Quy tắc thiết kế mismatch bổ sung được thế hiện trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Quy tắc thiết kế mismatch [61]

Theo bảng 2.1, cột thứ nhất là cặp SNP lựa chọn để thiết kế mồi AS, cột thứ hai

là cặp nucleotid mismatch giữa alen và đầu 3’ của mồi và cột cuối cùng là cặp mismatch

bổ sung trong bốn nucleotid cạnh đầu 3’ của mồi (bổ sung tại vị trí áp chót đầu 3’ sẽ cho hiệu quả phân biệt cao nhất) Quy tắc thiết kế thêm mismatch là: Với cặp mismatch tại

vị trí đầu 3’ có độ mạnh yếu (tức độ đặc hiệu kém), cần bổ sung một cặp mismatch mạnh; với cặp mismatch tại đầu 3’ có độ mạnh trung bình, bổ sung một cặp mismatch trung bình và với cặp mismatch tại đầu 3’ có độ mạnh mạnh thì chỉ cần bổ sung một cặp mismatch yếu [61]

2.3.2 Phương pháp thiết kế mồi chung

Nguyên tắc: Sau khi thiết kế được hai mồi đặc hiệu alen, tiếp tục sử dụng công

cụ Primer-BLAST https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ để thiết kế mồi chung Công cụ này giúp thiết kế mồi thích hợp còn lại dựa trên đoạn trình tự mục tiêu

2.3.3 Phương pháp kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ để kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi

Công cụ Primer-BLAST sử dụng một thuật toán sắp xếp để tìm kiếm điểm bổ sung giữa cặp mồi kiểm tra với các trình tự ADN trong bộ gen người có trong cơ sở dữ liệu của công cụ, từ đó cho kết quả các đoạn ADN mà đoạn mồi có thể khuếch đại và chiều dài của đoạn ADN được khuếch đại đó [60]

2.3.4 Phương pháp khuếch đại ADN bằng PCR

Nguyên tắc: Phản ứng khuếch đại chuỗi polymerase (PCR) được sử dụng để

khuếch đại ADN mục tiêu Nhờ sự xúc tác của ADN polymerase chịu nhiệt, một đoạn gen có trình tự xác định được khuếch đại từ phân tử ADN dựa trên sự bắt cặp đặc hiệu của mồi xuôi và mồi ngược với ADN khuôn theo nguyên tắc bổ sung và phản ứng kéo dài chuỗi Kết quả là tạo thành một số lượng lớn bản sao ADN sau một số chu kì nhiệt trong thời gian ngắn [23]

Tiến hành: Thực hiện phản ứng PCR bước 1 và bước 2 với các thành phần như

 Bắt cặp: Mỗi mồi bắt cặp với khuôn trong 30 giây Nhiệt độ bắt cặp phụ thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của mồi, quyết định tính đặc hiệu của mồi và được xác định bằng cách tối ưu hóa

 Khuếch đại: Kéo dài mạch được tiến hành ở 72oC trong 30 giây Và ở chu kỳ cuối, thêm bước khuếch đại cuối cùng từ 10 phút ở 72oC để đảm bảo các sản phẩm được kéo dài hoàn toàn

2.3.5 Phương pháp điện di ADN trên gel agarose

Nguyên tắc: Các đoạn ADN có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra

khi di chuyển với tốc độ khác nhau từ cực âm sang cực dương của máy điện di trong một điện trường có điện thế và cường độ thích hợp [33]

Tiến hành: Tiến hành điện di theo các bước sau :

 Chuẩn bị thạch agarose 1% cho PCR bước 1 và thạch 1,5% cho PCR bước 2: Cân 0,5 g (hoặc 0,75 g với thạch 1,5%) bột agarose cho vào 50ml đệm TBE 0,5X, đun trong lò vi sóng đến khi agarose tan hoàn toàn Để thạch nguội đến khoảng 60oC, thêm 2,5µl thuốc nhuộm Redsafe, lắc đều để hòa thuốc nhuộm vào thạch Sau đó đổ thạch vào khuôn điện di có cài sẵn lược Chiều dày thạch từ 7 – 9 mm là thích hợp Sau 30 – 40 phút thạch đông đặc thì gỡ lược

ra

 Chuẩn bị buồng điện di: Cho dung dịch đệm TBE 0,5X vào buồng điện di Đặt bản thạch đã chuẩn bị ngập trong dung dịch đệm đúng chiều sao cho ADN chạy từ cực âm sang cực dương

 Tra mẫu ADN vào giếng : Dùng micropipet hút 5 - 10µl sản phẩm PCR tra vào giếng Sau khi tra mẫu xong, chạy máy điện di ở 100V trong 30 phút

 Sau khi hết thời gian điện di, lấy bản thạch ra và đưa vào máy GelDoc chụp

các băng sản phẩm dưới đèn tử ngoại

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả thiết kế quy trình PCR alen HLA-C*03:02 bằng công cụ tin sinh học

3.1.1 Kết quả thiết kế mồi và kiểm tra tính đặc hiệu mồi PCR exon 2 – exon 3 gen HLA-C

Vùng exon 2 – exon 3 của gen HLA-C chứa SNP với mật độ lớn nhất trong gen

HLA – C, đặc trưng cho các alen HLA-C và giúp phân biệt các alen HLA-C này Tuy

nhiên do các SNP của alen HLA-C*03:02 nằm rải rác đồng thời trùng với các SNP của các alen HLA-C khác (thể hiện trong hình 3.4) nên không thể PCR trực tiếp để khuếch đại ngay alen HLA-C*03:02 như mong muốn Do đó bước đầu cần sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại exon 2 và exon 3 là vùng đặc trưng của gen HLA-C mà không khuếch

đại gen khác nằm trên cùng nhiễm sắc thể hoặc khuếch đại gen trên nhiễm sắc thể khác

Để khuếch đại vùng exon 2 và exon 3, trước hết, đề tài tham khảo cặp mồi PCR exon 2 – exon 3 mà tác giả Cereb và cộng sự công bố năm 1995 [8] Kết quả kiểm tra

đặc điểm về cặp mồi này bằng công cụ Primer-BLAST được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Đặc điểm cặp mồi PCR exon 2 – exon 3 của Cereb và cộng sự [73]

Trình tự mồi (5'->3')

Chiều

Tự bổ sung

Đầu 3’ tự

bổ sung Mồi xuôi

để làm giảm Ta của cặp mồi:

 Mồi ngược: Bỏ 1 nucleotid G đầu 5’ và thay nu thứ 7 tính từ đầu 5’ từ G

thành A (do đây là vị trí SNP C/T của 18 alen HLA-C), thu được mồi ngược

mới sau khi chỉnh sửa CRE2E3 là: 5’ – GAGATAGGGAAGGCTCCCCACT – 3’ (Ta = 65oC) Như vậy, trình tự