VDD phuong phap chan doan nhiem HP

PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHIỄM HELICOBACTER PYLORI BS CKII LÂM VÕ HÙNG I/ ĐẠI CƯƠNG : Nhiễm Helicobacter pylori (H.p) bệnh nhiễm khuẩn mạn tính người toàn cầu[2] Hiện nay, Tổ chức y tế giới (WHO) xếp H.p nguyên nhân gây viêm dày, loét dày tá tràng ung thư dày H.p loại vi khuẩn dễ thay đổi dù có nhiều phương pháp phát cách có mặt hạn chế nó[5] Trên thực tế chẩn đốn xác nhiễm H.p giúp ích nhiều cho cơng tác điều trị Điều trị tiệt trừ H.p chữa lành bệnh mà phòng ngừa biến chứng loét hay ung thư dày Chuyên đề chủ yếu trình bày phương pháp tìm H.p thường dùng lâm sàng đánh giá ưu, khuyết điểm phương pháp II/ ĐẶC ĐIỂM VI KHUẨN HELICOBACTER PYLORI: 2.1.Lịch sử: Từ 100 năm trước đây, Gulio Bizzozero lần ghi nhận có diện loại vi khuẩn sống dày chó Tiếp theo, nhiều nhà khoa học tìm thấy loại xoắn khuẩn diện lớp nhầy dày lại thất bại việc nuôi cấy vi khuẩn[2] Năm 1970, nhà giải phẩu bệnh Robin Warren nhận xét có mối liên hệ viêm dày mãn tính loại xoắn khuẩn niêm mạc dày Mãi đến năm 1982, Robin Warren người học trò Barry Marshall thành cơng ni cấy vi khuẩn từ 11 bệnh nhân bị viêm dày Marshall chứng minh ảnh hưởng vi khuẩn bệnh lý dày Họ đặt tên Campylobacter pylori dựa theo hình dạng đặc tính tăng trưởng Năm 1983, phát vi khuẩn Campylobacter pylori mối liên quan với bệnh lt dày tá tràng cơng bố tạp chí Lancet Và năm 2005, với phát này, hai ông trao tặng giải thưởng Nobel Y học 2.2.Đặc điểm vi trùng học: Căn vào hình dạng đặc tính tăng trưởng, người ta đặt tên vi khuẩn Campylobacter pyloridis, sau đổi thành Campylobacter pylori Tuy nhiên kính hiển vi điện tử, vi khuẩn khơng giống Campylobacter có cấu trúc chiêm mao khác hẳn Ngồi có khác biệt lớn tính chất sinh hóa cấu trúc chuổi RNA ribo thể 16S vi khuẩn đặt tên Helicobacter pylori H pylori xoắn khuẩn gram âm, có dạng chữ S, thuộc loại hiếu khí kích thước ngắn từ 0,2 – 0,5μm, có từ – chiên mao, di động, có men men urease, oxidase, catalase, mucolytic, protease, lipase phospholipase Hình 2.1.Hình ảnh vi khuẩn H pylori tăng trưởng nhiệt độ 30-40 độ, chịu môi trường pH từ 5-8,5 sống phần sâu lớp nhầy bao phủ niêm mạc dày, lớp nhầy với bề mặt lớp tế bào biểu mô vùng nối tế bào H pylori diện thực quản tá tràng có chuyển sản niêm mạc dày vùng Sự tồn mơi trường acid dày nhờ tác dụng bảo vệ niêm mạc dày nhờ men urease tạo mơi trường kiềm xung quanh vi khuẩn H.p gặp dạng hình cầu chuyển thành dạng hoạt động điều kiện thích hợp Đây dạng biến thể kháng lại phần chu trình sống vi khuẩn có vai trò quan trọng việc lây truyền bệnh Goodwin gọi dạng “ngũ” nhờ H.p tồn lâu mơi trường bên ngồi điều kiện khơng thuận lợi[6] Tạ Long cộng nhận xét đặc điểm siêu cấu trúc H.p dạng hình cầu hình oval, đầu có chùm lơng quan sát kính hiển vi điện tử[3] 2.3.Đặc điểm týp di truyền: Hiện nay, cấu tạo gen toàn chủng H.p biết là: HP 26695 phân lập Anh vào năm 1987 chủng HP 199 phân lập Mỹ vào năm 1994 Cấu trúc gen chúng bao gồm cấu trúc nhiễm sắc thể vòng từ 1,64 đến 1,67 Mb mà 90,8 _ 91% cấu tạo vùng mã hóa Khác chủ yếu gen chủng số lượng chất đoạn chèn diện hay không gen mã hóa men hạn chế Vùng nhiễm sắc thể chủ yếu chứa gen tham gia vào tổng hợp men urease, yếu tố độc tế bào VacA, kháng nguyên CagA tiêm mao Đa số chủng phân lập Đơng Á có CagA allen gây độc tế bào gen VacA, có 50% châu Âu Mỹ có gen Sự khác biệt giải thích nguồn gốc địa lý chủng chọn lọc khác chủng theo đặc điểm ký chủ[4] 2.4.Dịch tể học: Nhiễm H.p nhiễm khuẩn mạn tính thường gặp người Tần suất nhiễm H.p thay đổi tùy theo tuổi, tình trạng kinh tế _ xã hội chủng tộc Người ta ước tính có 50% dân số bị nhiễm H.p, chủ yếu nước phát triển với tần số nhiễm cao từ 50 -90% lứa tuổi lớn 20 hầu hết trẻ em bị nhiễm độ tuổi từ – Việt Nam có tỉ lệ nhiễm H.p cao vào khoảng 70% người lớn Trong nước phát triển, tuổi bị nhiễm thường lớn 50, chiếm 50% dân số Tần suất tăng thêm 10% năm Đường lây nhiễm chủ yếu đường ăn uống (phân _ miệng) trực tiếp (miệng _ miệng) qua nước bọt Ở nơi có điều kiện vệ sinh kém, nước thức ăn bị nhiễm nguồn lây lan quan trọng ban đầu[2] 2.5.Động lực: 2.5.1.Tính di động: Nhờ hoạt động tiêm mao cấu trúc hình xoắn, vi khuẩn di chuyển qua lớp niêm dịch vào lớp niêm mạc dày để tồn môi trường acid dịch vị 2.5.2.Men urease: Men giúp vi khuẩn thoát khỏi pH thấp dịch vị cách biến đổi urea thành amoniac bicarbonate giúp giữ mơi trường chung quanh vi khuẩn có pH Urease có vai trò quan trọng biến dưỡng tránh đáp ứng miễn dịch: tham gia tổng hợp protein cách cung cấp ni tơ, biến đổi glutamate thành glutamine kết hợp với kháng thể giúp ngăn chặn kết hợp với tế bào ngăn chặn opsonin hóa 2.5.3.Yếu tố chống tăng sinh: Chất trích tinh H.p làm ức chế tăng sinh tế bào niêm mạc dày Các protein kích thích tăng trưởng vi khuẩn làm cho H.p dễ khu trú vào niêm mạc dày hoạt động men Cu-Zn superoxide dimutase Mn superoxyde dimutase làm cho vi khuẩn dễ bám vào niêm mạc đồng thời gia tốc tế bào theo chương trình 2.5.4.Yếu tố kết dính: Nhờ yếu tố kết dính giúp vi khuẩn kết dính vào biểu mơ dày Nếu khơng có kết dính vi khuẩn bị đẩy vào lòng dày tác động nhu động dày tái sinh lớp biểu mơ dày 2.5.5.Sự kết dính hồng cầu: H.p có khả kết dính hồng cầu mạnh qua trung gian thụ thể acid sialic giúp vi khuẩn tránh thực bào Các chủng H.p có khả kết dính hồng cầu cao làm gia tăng kháng lại thực bào Điều cho thấy thụ thể sialic bảo vệ vi khuẩn khỏi bị bao vây 2.5.6.Các adhesin giúp thu giữ sắt: H.p cần sắt để phát triển mà bình thường dày sắt H.p tiết siderophore để bắt giữ sắt mơi trường xung quanh, ngồi vách H.p có protein kết hợp lactoferine giúp H.p thu giữ sắt từ môi trường xung quanh 2.5.7.Phospholipase protease: Các men thủy phân chất nhầy giúp vi khuẩn xuyên qua lớp nhầy niêm mạc 2.5.8.VacA (vacuolating cytoxin VacA) Độc tố tạo không bào: Là ngoại độc tố vi khuẩn, độc tố gắn vào màng tế bào biểu mô tạo thành phụ thuộc điện chọn lọc anion hexameric gây không bào biểu mô dày làm ức chế hoạt hóa lượng tổn thương ty lạp thể làm tổn thương chu trình tế bào VacA phóng thích cytochrome C làm chết tế bào chương trình 2.5.9.CagA gen (cytotoxine associated gen A): Vi khuẩn H.p có gen có độc tính cao Gen điểm cho đoạn DNA 40kb tương ứng với 25 gen gọi đảo sinh bệnh, gây tổn thương tế bào thường phối hợp với loét ung thư dày Sau vào tế bào CagA phosphoryl hóa kết hợp với SHP-2 tyrosine phosphatase tạo nên yếu tố đáp ứng phát triển tế bào (growth factor – like cellular) sản xuất cytokine tế bào ký chủ 2.5.10.Phản ứng ký chủ H.p: Đáp ứng viêm H.p làm huy động bạch cầu đa nhân, lympho T B, đại thực bào tương bào gây tổn thương cục kết hợp với phân tử MHC nhóm II niêm mạc dày gây chết tế bào theo đường tự tiêu (apoptosis) Ngồi ra, hoạt hóa bạch cầu đa nhân làm gia tăng tái sinh tế bào niêm mạc chết tế bào chương trình tương tác với T giúp đỡ interferon 2.5.11 Đáp ứng miễn dịch với H.p: H.p gây loại phản ứng miễn dịch cấp, mạn hoạt động viêm teo dày Tiêu biểu giai đoạn cấp khu trú H.p vào niêm mạc làm tăng pH quanh vi khuẩn, đồng thời phóng thích chất hóa ứng động hoạt hóa bạch cầu đa nhân trung tính hệ thống miễn dịch đưa đến thối hóa chất nhầy biểu mơ dày Qua giai đoạn mạn pH dày trở lại bình thường 2, kháng nguyên lạ H.p tiếp tục gia tăng gây đáp ứng miễn dịch làm phóng thích nhiều cytokine Các cytokine kích thích bạch cầu lympho, eosinophil monocyte đồng thời phóng thích nhiều kháng thể IgG IgA vào dày để opsonin hóa vi khuẩn, giai đoạn kéo dài 10_20 năm kết cục gây loét dày Nếu nhiễm trùng khơng điều trị sau 10- 20 năm teo niêm mạc dày, làm gia tăng pH dày lên 6-8 Các tuyến tiết bị mất, viêm xuyên thành dày dị sản ruột, điều khởi đầu cho giai đoạn ác tính Những người nhiễm H.p có trường hợp có triệu chứng có trường hợp khơng triệu chứng Lý chủng H.p có độc lực khác Ngành sinh học phân tử sâu vào nghiên cứu đặc tính H pylori thấy khơng phải tất vi khuẩn có cấu trúc di truyền giống Loại vi khuẩn H pylori gây viêm loét, ung thư dày có chứa gen đặt tên CagA (Cytotoxin-associated gene A) Gen CagA diện 60% H pylori gây bệnh viêm dày Hình 2.2 Sơ đồ chế gây tổn thương dày vi khuẩn Ở môi trường acid pH = – 4,5, H pylori chép gen bình thường; pH < 2, H pylori tồn tại; pH > 7, H pylori ngưng hoạt động, trở thành cầu khuẩn khơng di chuyển H.pylori với nhóm máu, H.pylori dễ gắn lên bề mặt kháng nguyên Tewish, Tewish có biểu mơ niêm mạc dày có lực cao H pylori , mà Tewish đặc trưng cho cấu tạo nhóm máu O, nhiễm H pylori người có máu nhóm O cao gấp 1,5 – lần so với người có nhóm máu khác Hầu hết người nhiễm H pylori bị viêm dày với mức độ từ vừa đến trầm trọng Trong đó, số nhỏ viêm dày tiến triển thành loét hay ung thư dày Sự tiến triển tùy thuộc vào chủng H pylori đáp ứng kí chủ[4] III/ CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐỐN NHIỄM HELICOBACTER PYLORI: Kể từ H.p tìm vào năm 1982, đến có nhiều phương pháp chẩn đốn nhiễm H.p Trong chẩn đốn, phương pháp có ưu nhược điểm khác việc chọn lựa phương pháp tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu ứng dụng thực hành tùy thuộc vào giá nghiệm Điều quan trọng thử nghiệm phải có độ nhạy độ đặc hiệu cao để giúp cho chẩn đoán trước điều trị theo dõi sau điều trị đạt hiệu tốt Các phương pháp chẩn đốn H.p chia thành hai nhóm[4],[6]: _ Các thử nghiệm xâm hại thực qua nội soi dày tá tràng _ Các thử nghiệm không xâm hại Nguyên tắc định thử nghiệm bệnh nhân không uống loại thuốc kháng tiết, loại kháng sinh… phải ngưng điều trị tuần[4],[6] 3.1 Các thử nghiệm xâm hại qua nội soi dày tá tràng (invasive test): 3.1.1 Thử nghiệm urease[7]: Test xác định hoạt độ men urease H.p việc đặt mẫu mô dày vào môi trường lỏng (test maison, CU test) bán đặc (CLOtest, HUT test) màng gọi Pyloritek có chứa urea chất thị màu theo pH Nguyên tắc thử nghiệm nhằm phát men urease H.p, H.p gần loại vi khuẩn dày tiết men urease với khối lượng lớn (ngoại trừ số bệnh nhân bị nhiễm Helicobacter helmanii) Men urease H.p có mẫu mô dày làm biến đổi urease thành amoniac ( NH3), NH3 làm mơi trường thuốc thử có pH kiềm, làm thay đổi màu chất thị theo phản ứng sau: Urê + H2 O urease/HP  CO2 + NH3 NH3  pH  đổi màu thị từ vàng sang đỏ Hình 3.1 Mẫu thử CLOtest Độ nhạy thay đổi theo loại test thời gian đọc kết quả, gia tăng ủ 37_42 oC, test tốt đọc cho độ nhạy cảm 85_90% độ đặc hiệu từ 95_98% Trong điều kiện người ta thừa nhận ngưỡng phát vi khuẩn 104_105vi khuẩn/ml[4],[7] Trong loại test Việt Nam thường sử dụng CLOtest CLO test viết tắt chử Campylobacter Like Organism test CLOtest sử dụng mẫu thử hổn hợp gồm: agar gel có chứa urea, chất thị đỏ phenol, chất kiềm hãm vi khuẩn Mẫu sinh thiết niêm mạc dày lấy nội soi vùi vào Thử nghiệm dương tính mẫu thử CLOtest đổi màu từ vàng sang màu đỏ tía CLOtest đọc kết sau phút, 20 phút, giờ, giờ,và 24 giờ[6] Nếu đọc kết giờ, độ nhạy thử nghiệm giảm xuống phụ thuộc vào lượng men urease hoạt động số lượng vi khuẩn Ở số trường hợp, kết dương tính sau vài phút mật độ vi khuẩn thấp kết dương tính sau nhiều liền, chí âm tính giả xảy Các trường hợp âm tính giả : mật độ vi khuẩn thấp ( trên), xuất huyết tiêu hóa, teo niêm mac dày, u MALT, vừa dùng kháng sinh PPIs[2] Các trường hợp dương tính giả gặp nhiễm H.heilmanii, vi khuẩn sinh men urease thường gặp dày chó, mèo, lợn Khi độ toan dịch vị thấp, dương tính giả gặp trường hợp nhiễm vi khuẩn khác sinh men urease Enterobacter Pseudomonas.sp[6] Áp dụng giá trị thử nghiệm CLOtest: _ Chẩn đốn nhiễm H.p: thử nghiệm nhanh chóng, rẻ tiền, đơn giản hữu hiệu để phát H.p Độ nhạy độ đặc hiệu 90% sinh thiết hai mẫu hang vị thân vị độ nhạy tăng thêm 4,3% so với lấy mẫu hang vị Độ nhạy tác giả trình bày Bảng 3.1 so sánh độ nhạy CLOtest với thử nghiệm urease khác Bảng 3.2 Tại Việt Nam, thử nghiệm urease dương tính loét tá tràng 64,7% đến 87,3% loét dày 60% đến 100% Tác giả Số Bệnh Độ nhạy nhân Logan(1991) 195 92 Vandenplas(1992) 95 100 Culter(1995) 228 89,6 Thijs(1996) 105 90,2 Lerang(1998) 351 85 Monteiro(1999) 104 88,6 Bảng 3.1 Độ nhạy thử nghiệm urease Tác giả Tên thử nghiệm Độ nhạy thử nghiệm ½ giờ 24 giờ 93 93 94 97 98.5 Yousfi(1996) CLOtest/ n= 100 Hp Fast Pyloritek 93 98.5 100 Laine (1996) CLOtest 71 86 n= 87 Hp Fast 66 82 Pyloritek 89 Bảng 3.2 Độ nhạy thử nghiệm urease : so sánh Pyloritek với CLOtest Hp Fast 93 88 - _ Đánh giá kết sau điều trị: dù sau điều trị tiệt trừ H.p có thành cơng hay không, thất bại, số lượng vi khuẩn ngưỡng phát (10 đến 105 UFC/ml) nên test không khuyến cáo dùng để đánh giá kết sau điều trị Tuy nhiên, sau tiệt trừ H.p bệnh nhân cần nội soi đánh giá mức độ lành ổ loét dùng chẩn đốn mơ bệnh học để đánh giá thay đổi niêm mạc dày trước sau điều trị, lúc test urease cần thiết cho việc kết hợp đánh giá kết tiệt trừ có ý nghĩa H.p dương tính[6] 3.1.2.Ni cấy vi khuẩn: Lấy mẫu mô niêm mạc dày đem nhuộm Gram để tìm diện vi khuẩn [2] Tuy nhiên, độ nhạy khơng cao Để xác định xác nhiễm H.p mặt phương diện vi trùng học cần phải ni cấy vi khuẩn 3.1.2.1.Ý nghĩa: Trong chẩn đốn nhiễm H.p, nuôi cấy thử nghiệm đặc hiệu nói tiêu chuẩn vàng có độ đăc hiệu 100%[6] Ni cấy cho biết mật độ H.p, câu trúc gen chủng H.p khác Ni cấy cho biết dạng hình cầu H.p hình thái thối hóa vi khuẩn Dù vậy, mặt thực tiễn lâm sàng dùng phương pháp có nhiều phương pháp khác đơn giản hơn, dễ áp dụng rộng rãi Tuy nhiên, trường hợp điều trị thất bại, nuôi cấy làm kháng sinh đồ thử nghiệm có ích để hướng dẫn điều trị thích hợp phương pháp để đánh giá tìmh trạng kháng thuốc vi khuẩn kháng sinh 3.1.2.2 Cách thực hiện: u cầu dùng mơi trường cấy thích hợp thuộc loại Portagerm pylori (bioMerieux) cho phép bảo quản mẫu sinh thiết 24 với nhiệt độ bên Đây mơi trường đặc, chọn lọc có chứa kháng sinh để ức chế phát triển vi khuẩn khí đường hơ hấp Lấy mẫu mơ dày cấy vào mơi trường Sau mơi trường cấy ủ 37 oC môi trường vi khí bảo hòa nước với 5% oxy 5-10% CO2 Thời gian mọc _ ngày, dùng kháng tiết trước thời gian mọc chậm đến 12 ngày Định danh vi khuẩn nhuộm Gram phối hợp với diện men catalase, oxydasae urease Thông qua cấy làm kháng sinh đồ Độ đặc hiệu cấy 100% độ nhạy thay đổi từ 70 _ 100% tùy theo nghiên cứu độ nhạy phụ thuộc mật độ vi khuẩn, kỹ thuật cấy, bảo quản bệnh phẩm, vận chuyển mẫu sinh thiết, vận chuyển < giữ nhiệt độ thường, 24 nên bảo quản 4oC, > 24 nên bảo quản -70oC[4] 3.1.2.3.Giá trị chẩn đốn: Mặc dù độ đặc hiệu ni cấy đạt gần 100% độ nhạy khác ảnh hưởng yếu tố nêu Sau kết độ nhạy số nghiên cứu: Tác giả Số bệnh nhân Độ nhạy Logan (1991) 195 83 Olson (1995) 845 83 Soule (1995) 104 86 Thijs (1996) 105 98,4 Lerang (1998) 351 93 Monterio (1999) 104 100 Bảng 3.3 Độ nhạy thử nghiệm nuôi cấy Tại Việt Nam kết nuôi cấy chẩn đoán nhiễm H.p thấp so với thử nghiệm khác, ni cấy có kết dương tính từ 36,8% đến 68,7%[1],[3] 3.1.3 Xác định acid nhân vi khuẩn (ADN): Phản ứng khuếch đại gen cho phép phát chuỗi ADN đặc hiệu H.p mẫu sinh thiết dày, dịch dày, chất nhầy nước bọt, mảng bám răng, phân Phương pháp phát mật độ vi khuẩn thấp < 106 vi khuẩn gam phân Tuy nhiên không cho phép xác định diện vi khuẩn sống Lợi ích giúp phát diện vi khuẩn với mật độ thấp (theo dõi sau điều trị) Kỹ thuật PCR cho phép phát vi khuẩn từ mẫu sinh thiết dày, với đột biến nhiễm sắc thể gây đề kháng với macrolides, diện gen có tiềm gây bệnh CagA allen VacA Trước điều trị độ nhạy độ đặc hiệu phương pháp thay đổi từ 80 _ 97% từ 83 _ 100%[4] 3.1.4 Chẩn đốn mơ bệnh học: Mơ bệnh học sử dụng rộng rãi để chẩn đoán nhiễm H.p với phương pháp nhuộm heamatoxyline eosin (HE), Giemsa, Warthin-Starry, nhuộm tím Cresyle, nhuộm bạc Acridin Orange, nhuộm bạc cho hình ảnh H.p rõ nhất[4], [6] Việc phát H.p tùy thuộc số lượng mẫu mô sinh thiết vị trí khác Nên sinh thiết hai mẫu hang vị thân vị theo phân loại viêm dày hệ thống Sydney Trong trường hợp điều trị với kháng sinh H.p gặp dạng hình cầu Hơn kháng sinh, việc dùng thuốc kháng tiết làm giảm mật độ H.p niêm mạc dày Để tăng độ nhạy thử nghiệm, phương pháp nhuộm thơng dụng nêu trên, dùng nhuộm hóa mơ miễn dịch mẩu mơ sinh thiết cần lấy đủ kích thước Phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch nhờ kháng thể kháng H.p đa dạng đơn dạng[4],[6] Ý nghĩa chẩn đốn mơ bệnh học: Chẩn đốn mơ bệnh học có ý nghĩa quan trọng không nhằm xác định diện H.p mơ để đánh giá thương tổn kèm theo niêm mạc dày viêm cấp, viêm mạn tính hoạt động , viêm teo, chuyển sản, nghịch sản carcinome dày Ngoài việc đánh giá thay đổi mô bệnh học niêm mạc dày trước sau điều trị tiệt trừ H.p cần thiết không phần quan trọng Sau điều trị tiệt trừ H.p thành công số bệnh nhân có niêm mạc dày bình thường tăng lên, viêm mạn viêm teo niêm mạc giảm xuống có ý nghĩa mà nhờ loại trừ khuynh hướng tự nhiên loét tái phát Riêng chuyển sản nghịch sản ruột khơng có thay đổi, trường hợp cần theo dõi chặt chẽ lâu dài sau Giá trị chẩn đốn mơ bệnh học: Độ nhạy độ đặc hiệu việc phát H.p gần 90%_ 95%[3],[4] Tác giả Logan (1991) Vanderplas (1992) Culter (1995) Số bệnh nhân 195 95 228 Độ nhạy (%) 95 100 93,1 Olson (1995) 845 99 Soule (1995) 104 100 Thijs (1996) 105 96,8 Monteiro (1999) 104 95,5 Bảng 3.4 Độ nhạy chẩn đốn mơ bệnh học Tại Việt Nam chẩn đốn mơ bệnh học phát có H.p cho kết 34,6 – 91,42%[1],[3] Chẩn đốn mơ bệnh học mật độ nhiễm H.p: Với kỹ thuật nhuộm HE hay nhuộm Giemsa đủ cho chẩn đốn, nhuộm với Warthin-Starry phức tạp Các phương pháp nhuộm đặc biệt khác phương pháp hóa mơ miễn dịch ngồi việc giúp phát nhiễm H.p giúp tìm dạng hình cầu vi khuẩn Để đánh giá chuyển sản ruột dùng phương pháp nhuộm Alcian Blue(AB, pH2,5) phương pháp PAS (Perodic Acid Schiff) Để đánh giá mật độ nhiễm H.p thường sử dụng bảng phân loại cải biên Robert, George David (1994) theo bảng sau: Độ Ký hiệu H.p âm tính H.p (+) Trên tồn quang trường Khơng tìm thấy H.p H.p xếp rời rạc, thấy khúm nhỏ H.p (++) Ít khúm nhỏ khúm lớn H.p (+++) Trên khúm nhỏ khúm lớn Bảng 3.5 Mật độ nhiễm H.p phương pháp mô bệnh học Mật độ nhiễm H.p có liên quan đến thương tổn mơ bệnh học Trong trường hợp nhiễm H.p với mật độ 2(+) 3(+) thấy tồn tuyến niêm mạc dày bị phá hủy Ngoại trừ tuyến mơn vị sâu bị ảnh hưởng bị mật độ nhiễm H.p nhiều 3(+) Chẩn đốn mơ bệnh học giúp khảo sát tình trạng niêm mạc dày trước sau điều trị tiệt trừ H.p Hình thái mơ bệnh học niêm mạc dày thường gặp viêm niêm mạc mạn tính Theo Widgren, viêm dày mạn tính hoạt động H.p đánh giá theo tiêu chuẩn mô bệnh học sau đây: _ Mạn tính: đặc trưng thâm nhập lympho bào _ Hoạt động: diện bạch cầu đa nhân trung tính _ Hình thái: vi khuẩn H.p tìm thấy hang vị thân vị hang vi thân vị Diễn tiến viêm dày mạn tính tiến triển đến viêm teo dày với việc số khe tuyến mà hậu việc xuất chuyển sản ruột bề mặt tế bào biểu mô WHO xếp H.p nguyên nhân hàng đầu bệnh sinh ung thư dày viêm dày H.p ngun nhân lộ trình viêm teo niêm mạc – chuyển sản_ nghịch sản _ ung thư dày Nghiên cứu Nguyễn Cường Thịnh cho thấy tỉ lệ nhiễm H.p thuộc type I với CagA(+), VacA(+) thể viêm dày mạn có chuyển sản ruột 66,7% cao so với 39,4%viêm dày mạn khơng có chuyển sản ruột (P< 0,05) Quan điểm viêm teo niêm mạc kết hợp với chuyển sản ruột xem dấu hiệu sớm dẫn đến ung thư dày[3] 3.1.5 Phản ứng chuỗi Polymerase PCR (Polymerase Chained Reaction)[6],[8]: 3.1.5.1 Nguyên tắc: PCR thử nghiệm cho phép khuếch đại chọn lọc mẫu AND đích thành tỷ để sau phát Nhiễm H.p chẩn đốn phương pháp nhờ việc khuếch đại chuỗi gen quan trọng Mẫu bệnh phẩm (mô, vi khuẩn, ) phân tích để lấy AND đích, bước khuếch đại từ primer mồi AND đơn bắt cặp vào đoạn khởi đầu hay đoạn cuối chuỗi ADN đích với tham gia xúc tác phản ứng tổng hợp men Taq polymerase (là men chịu nhiệt độ trích từ vi khuẩn Thermus aquaticus) Sự khuếch đại thử nghiệm PCR dựa vào 30 _ 40 chu kỳ nhiệt theo bứơc sau: _ Giai đoạn làm biến tính _ Giai đoạn bắt cặp _ Giai đoạn kéo dài Cuối cùng, sản phẩm khuếch đại 10 từ ADN đích ban đầu phát phương pháp điện di theo sơ đồ sau: Chuẩn bị bệnh nhân (Mẫu mơ/vi khuẩn) Phân tích Khuếch đại 30-40 chu kỳ nhiệt Biến tính (AND đích) Bắt cặp (đoạn mồi-primer) Điện di Phát sản phẩm khuếch đại (109 từ AND đích ban đầu) Hiện nay, PCR kỹ thuật chẩn đoán tiên tiến chưa phổ biến rộng rãi Việt Nam chẩn đoán nhiễm H.p Theo số kết nghiên cứu PCR có độ nhạy cao Mẫu bệnh phẩm lấy từ mẫu sinh thiết dày, dịch hút dày, mãng cao răng, nước bọt hay từ phân Kết số nghiên cứu sau: Tác giả Số bệnh nhân 104 Độ nhạy (%) 91 Soule (1995) Thijs 105 96,7 (1996) Monteiro 104 93,2 (1999) Bảng 3.6 Kết thử nghiệm PCR Ưu điểm : việc chẩn đốn nhiễm H.p trước điều trị, PCR dùng để theo dõi sau điều trị tiệt trừ H.p Hơn nữa, PCR phân biệt khác tái nhiễm tái phát, nhiễm khuẩn khác kết hợp Một áp dụng quan trọng khác nghiên cứu bệnh sinh, PCR định cấu trúc gen chủng H.p có khả gây bệnh CagA S1 VacA có liên quan đến bệnh loét dày tá tràng ung thư dày Kỹ thuật PCR dùng để đánh giá yếu tố gây bệnh H.p Kết qủa cho thấy cấu trúc di truyền VacA CagA H.p từ mẫu sinh thiết niêm mạc dày thử nghiệm PCR tương tự với nuôi cấy dùng ADN vi khuẩn H.p Liên quan đến kháng thuốc, PCR giúp tìm gen đột biến tạo kháng thuốc vi khuẩn ví dụ đề kháng Clarithromycine tượng đột biến gen vị trí 23S RNA Riêng phương diện dịch tể học, PCR với phương pháp so sánh “dấu ấn di truyền” ADN phân biệt khác chủng H.p Khuyết điểm: chi phí cao, máy đắt tiền, đòi hỏi nhân viên xét nghiệm lành nghề nên kỹ thuật chưa thông dụng Việt Nam vùng sâu, vùng xa 3.2 Các thử nghiệm không xâm hại ( noninvasive test): 3.2.1 Nghiệm pháp thở 13C 14C (UREA BREATH TEST=UBT)[6]: Nghiệm pháp thở UBT tác giả Graham mô tả vào năm 1987 vào năm 1988 Marshall Surveyor mô tả nghiệm pháp thở 14C Cả hai nghiệm pháp xem tiêu chuẩn vàng trở nghiệm phổ biến khơng xâm hại chẩn đốn đánh giá kết tiệt trừ H.p Kết hai thử nghiệm thở 13C 14 C giống xác khác chổ 13C chất khơng gây phóng xạ 14C chất có hoạt tính phóng xạ Do 14C có hoạt tính phóng xạ nên khơng dùng cho trẻ em phụ nữ mang thai 13C dùng cho đối tượng nêu trên[2] Tuy nhiên, việc sử dụng test hạn chế giá thành cao máy đắt[4] 3.2.1.1 Nguyên tắc: Bệnh nhân cho uống urea đánh dấu 13C 14 C Nếu dùng 13C khơng có điều kiện chăm sóc, theo dõi chuyên chở đặc biệt nên 13C UBT dùng rộng rãi Sau uống, men urease từ vi khuẩn tác động lên urea đánh dấu giải phóng 13CO2 Chất vào máu thải trừ qua phổi Việc phát thở chất đồng vị đánh dấu tỉ lệ 13C/12C đo sắc ký quang phổ kế khối hệ thống khác quang phổ laser quang phổ hồng ngoại Hình 3.2 Nguyên lý test thở C13 – C14 Ohara cs nghiên cứu 255 bệnh nhân so sánh hiệu việc dùng thuốc dạng gói dạng viên chứa 100mg 13 C-urea Kết cho thấy độ xác, độ nhạy, độ đặc hiệu khơng có khác biệt cách uống thuốc thử nghiệm 13C không cần thiết phải súc rửa miệng sau uống thuốc Nghiệm pháp coi dương tính có ngưỡng delta 1000 Để tránh kết âm tính giả nên cho bệnh nhân ngưng thuốc PPIs tuần thuốc kháng sinh tuần Test thở có độ xác 95% thường dùng để đánh giá kết điều trị tiệt trừ H.p[2] 3.2.1.2 Giá trị chẩn đoán áp dụng: a/ Chẩn đoán nhiễm H.p: Test UBT phương pháp không xâm hại, đơn giản, dễ áp dụng, phương pháp có độ nhạy độ đặc hiệu cao bệnh nhân dễ chịu so với phương pháp chẩn đoán khác dựa vào nội soi Vì vậy, phương pháp thuận tiện cho chẩn đoán nhiễm H.p trẻ em (bảng 3.7) b/ Theo dõi sau điều trị: Test UBT ứng dụng cho chẩn đóan nhiễm H.p dùng để theo dõi đánh giá kết sau điều trị tiệt trừ H.p Ứng dụng hữu ích cho nghiên cứu cộng đồng So sánh kết UBT trước sau điều trị cho thấy hiệu phác đồ tiệt trừ H.p Tác giả Số bệnh nhân 195 95 Logan (1991) Vandenplas (1992) Culter (1995) 228 Olson (1995) 845 Soule (1995) 104 Thijs (1996) 105 Lerang (1998) 351 Monteiro 104 (1999) Bảng 3.7 Độ nhạy UBT Tác giả Số bệnh nhân Độ nhạy (%) 98 96 90,2 91 94 100 95 93,3 Độ nhạy thử nghiệm đánh giá tiệt trừ H.pylori (%) 13 C Mô BH Nuôi PCR UBT cấy 97 95 76 81 Soule 104 (1995) Olson 634 89 97 81 (1995) Mégraud 97 87,5 95 90 67,7 (1999) Bảng 3.8 Kết tiệt trừ H.p: độ nhạy nghiệm pháp thở 13C- UBT so với nghiệm pháp khác Nhược điểm: giá thành cao trang thiết bị đắt tiền nên chưa phổ biến rộng rãi tỉnh tỉnh vùng sâu, vùng xa 3.2.2 Chẩn đoán huyết thanh: 3.2.2.1 Nguyên tắc: Chẩn đoán huyết phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) để phát kháng thể IgG kháng H.p Đây xét nghiệm tốn thích hợp cho nghiên cứu dịch tể học với độ nhạy 90% Việc xác định nồng độ kháng thể IgG sử dụng nhiều globuline miễn dịch khác IgA IgM Hiện thị trường có nhiều kit khác dùng để chẩn đoán nhiễm H.p (trên 20 kit) Độ nhạy độ đặc hiệu khác tùy theo kit này[6] Tên thử nghiệm Độ nhạy Độ đặc hiệu Help test (Amrad) 98,4 93,3 Malakit (Biolab) 79,9 98.6 GAP IgG (Bio-Rad) 94,9 91,3 Pyloriset 95,8 95,5 TMEIA_G(ORION Helico G (Porton) 92,3 87,1 H.pylori IgG Kit (Radim) 81,6 90,7 Roche MTP (Roche) 99,3 86,5 Pylori-Sat (Whittaker) 92,9 89,4 Bảng 3.9 So sánh độ nhạy độ đặc hiệu Kit khác 3.2.2.2 Giá trị chẩn đoán áp dụng: a/ Chẩn đoán nhiễm H.p: Tùy theo tác giả kit khác nhau, độ nhạy độ đặc hiệu chẩn đoán huyết trình bày theo bảng 3.9 b/ Theo dõi sau điều trị tiệt trừ H.p: Ít có giá trị sau điều trị tiệt trừ H.p thành cơng kháng thể tồn chẩn đoán dương tính từ tháng đến năm[2],[6] Hội nghị Châu Á Thái Bình Dương tháng 8/1997 khuyến cáo khơng nên dùng chẩn đốn huyết để làm phương tiện xác định kết tiệt trừ H.p Tác giả Số BN Graham(1996) Moayyedi (1997) Enroth (1997) Chen (1997) Harrison (1998) Oksanen (1998) 551 114 144 86 50 207 Tên thử nghiệm Flexure Helisal Độ nhạy 96 92 Độ đặc hiệu 95.1 92 BM test CLO ser Accu Stat Pyloriset Screen 96 95,7 89,5 95 83 72,5 93,5 94 Bảng 3.10 Độ nhạy độ đặc hiệu chẩn đoán huyết Chẩn đoán huyết trước điều trị tiệt trừ H.p cần thiết cần nên kết hợp với test khác để nâng cao khả chẩn đốn nhiễm H.p hai test thường dùng test urease mơ bệnh học có tỉ lệ âm tính giả 3.2.3 Test nhanh huyết ( Doctor test): Test nhanh huyết chủ yếu phục vụ cho bác sĩ lâm sàng thực hành sở y tế, áp dụng nghiên cứu Về nguyên tắc, huyết máu bệnh nhân đặt giãi sắc ký có chứa sẳn kháng nguyên đặc hiệu, phản ứng ngưng kết xảy vòng – phút cho kết chẩn đoán dương tính 3.2.4 Test huyết phát kháng thể kháng CagA: Ở phương Tây, chủng H.p biểu với CagA (+) có liên quan đến bệnh sinh loét dày tá tràng Thử nghiệm ELISA phát protein đặc hiệu CagA kháng thể kháng CagA Tuy nhiên, phương Đông Nam Mỹ, CagA (+) thấy hầu hết đối tượng không rõ khác biệt khả gây bệnh 3.2.5 Tìm kháng thể kháng H.p nước tiểu: Năm 1998, nhà khoa học Nhật Bản tìm thấy kháng thể IgG kháng H.p nước tiểu bệnh nhân Từ mở khả phương pháp để chẩn đoán nhiễm H.p 3.2.6 Immunoblot: Immunoblot phương pháp nhằm nghiên cứu đáp ứng miễn dịch bệnh nhân kháng lại kháng nguyên khác H.p Nguyên tắc: kháng nguyên vi khuẩn phân tích phương pháp điện di chuyển đến màng nitrocellulose, tiếp xúc với huyết thử nghiệm Thử nghiệm Immunoblot có độ nhạy độ đặc hiệu cao nhiều so với chẩn đoán huyết Giá trị thử nghiệm: dùng để chẩn đoán nhiễm H.p theo dõi kết điều trị tiệt trừ H.p Tuy nhiên, thực tế chưa sử dụng xét nghiệm thường qui 3.2.7 Dùng PCR chẩn đoán H.p phân: Trên thực nghiệm người ta dùng kỹ thuật PCR để tìm H.p phân Tuy nhiên, thử nghiệm khó thực bệnh nhân có chế độ ăn nhiều chất xơ Hiện nay, chưa có phương pháp đơn giản hữu hiệu để giúp loại bỏ chất xơ này, thử nghiệm chưa áp dụng rộng rãi 3.2.8 Phát kháng nguyên phân HpSA: Đây test dùng kỹ thuật ELISA có tên Premier platinum HpSA để phát kháng nguyên H.p phân Thử nghiệm việc giúp chẩn đốn nhiễm H.p, giúp theo dõi điều trị tiệt trừ H.p với độ nhạy độ đặc hiệu cao Đối với trẻ em, thử nghiệm HpSA có ích nghiên cứu dịch tể học thử nghiệm xâm lấn qua nội soi khó thực Hơn nữa, trẻ em sinh năm đầu đời, chẩn đoán huyết khó đánh giá kháng thể từ mẹ truyền sang tồn IV/ ỨNG DỤNG TRÊN LÂM SÀNG: 4.1 Ứng dụng chẩn đoán nhiễm Helicobacter pylori: Như biết có nhiều phương pháp dùng để chẩn đoán nhiễm H.p, dùng phương pháp phải theo mục đích hiệu chẩn đốn xác cao, nhanh chóng tiện lợi Tuy phụ thuộc vào giá nghiệm, khả phòng xét nghiệm, điều kiện, hồn cảnh địa phương Ngồi phụ thuộc vào mục tiêu, đối tượng bệnh nhân nghiên cứu Trên lâm sàng sử dụng sơ đồ sau: Chẩn đốn nhiễm Helicobacter pylori Các thử nghiệm qua nội soi dày tá tràng Urease ( CLO test) Mô bệnh học Nuôi cấy PCR Các thử nghiệm không qua nội soi dày tá tràng Doctor test /chẩn đoán huyết Nghiệm pháp thở 13C 14C Tìm kháng nguyên phân Immunoblot Tìm kháng thể kháng CagA PCR chẩn đốn H.p phân Ngồi việc chẩn đốn nhiễm H.p, khảo sát tổn thương niêm mạc dày quan trọng cần thiết Vì vậy, thực hành nên nội soi dày tá tràng làm thử nghiệm xâm hại qua nội soi Hiện nay, việc phát tầm soát ung thư dày giai đoạn sớm chiến lược quan trọng mà muốn phải nội soi cho bệnh nhân Các thử nghiệm khơng qua nội soi DD –TT ngồi ý nghĩa chẩn đốn thích hợp cho nghiên cứu dịch tể học, cho đối tượng bệnh nhân trẻ em người lớn tuổi Riêng chẩn đốn huyết khơng định đánh giá kết điều trị tiệt trừ H.p dùng để phát nhiễm khuẩn H.p bệnh nhân sử dụng loại thuốc kháng tiết kháng sinh trước V/ KẾT LUẬN Chẩn đốn nhiễm Helicobacter pylori có nhiều phương pháp chia thành hai nhóm chính: thử nghiệm xâm hại (invasive test) thử nghiệm không xâm hại (noinvasive test) Mỗi thử nghiệm có ưu, khuyết điểm Tùy theo mục đích, đối tượng thử nghiệm, hoàn cảnh cụ thể địa phương,…, mà chọn lựa thử nghiệm cho thích hợp Việc vận dụng linh hoạt thử nghiệm có để đạt mục tiêu chẩn đoán đánh giá sau điều trị tiệt trừ Helicobacter pylori TÀI LIỆU THAM KHẢO Vo Thi My Dung, P H P (1997) Danh gia thu nghiem huyet chan doan nhiem Helicobacter pylori Y hoc Ho Chi Minh, 1, 35 - 40 BUI HUU HOANG (2009) Cap nhat thong tin ve Helicobacter pylori Tap chi khoa hoc Tieu hoa VIET NAM, IV(17), 1109 _ 1112 Ta Long (2003) Benh ly da day ta trang va vi khuan Helicobacter pylori NXB Y hoc: Ha Noi Hoang Thang (2007) Helicobacter pylori va benh ly lien quan den da day ta trang TAP CHI KHOA HOC TIEU HOA VIET NAM, II(6), 362 369 Nguyen Van Thinh (2009) Ty le nhiem Helicobacter pylori viem da day man tinh qua ket hop nhieu phuong phap phat hien Tap chi khoa hoc Tieu hoa Viet Nam, IV(17), 1113 _ 1119 Tran thien Trung (2008) Benh Da day-ta trang va nhiem Helicobacter pylori (2 ed.) NXB Y hoc Ho chi Minh city Can, F., Karahan, C., Dolapci, I., Demirbilek, M., Tekeli, A & Arslan, H (2008) Urease activity and urea gene sequencing of coccoid forms of H pylori induced by different factors Curr Microbiol, 56(2), 150-155 Koido, S., Odahara, S., Mitsunaga, M., Aizawa, M., Itoh, S., Uchiyama, K., et al (2008) [Diagnosis of Helicobacter pylori infection: comparison with gold standard] Rinsho Byori, 56(11), 1007-1013. ... Yousfi(1996) CLOtest/ n= 100 Hp Fast Pyloritek 93 98.5 100 Laine (1996) CLOtest 71 86 n= 87 Hp Fast 66 82 Pyloritek 89 Bảng 3.2 Độ nhạy thử nghiệm urease : so sánh Pyloritek với CLOtest Hp Fast 93 88 - _... Helicobacter pylori TÀI LIỆU THAM KHẢO Vo Thi My Dung, P H P (1997) Danh gia thu nghiem huyet chan doan nhiem Helicobacter pylori Y hoc Ho Chi Minh, 1, 35 - 40 BUI HUU HOANG (2009) Cap nhat thong... HOA VIET NAM, II(6), 362 369 Nguyen Van Thinh (2009) Ty le nhiem Helicobacter pylori viem da day man tinh qua ket hop nhieu phuong phap phat hien Tap chi khoa hoc Tieu hoa Viet Nam, IV(17), 1113