đề tài về “ỨNG DỤNG DI TRUYỀN học – CÔNG NGHỆ GEN

Kĩ thuật PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để khuếch đại một hoặc một vài bản sao của một đoạn AND theo cấp lũy thừa, tạo ra hàng ngàn đếnhàn

HỘI CÁC TRƯỜNG CHUYÊN KHU VỰC DUYÊN HẢI VÀ ĐỒNG BẰNG BẮC BỘ

CHUYÊN ĐỀ:

ỨNG DỤNG DI RUYỀN HỌC

– CÔNG NGHỆ GEN

4 Ứng dụng công nghệ gen với sản xuất và đời sống 33

A PHẦN MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Trong chương trình Sinh học phổ thông, Di truyền học là chuyên đề quan trọng nhất và khónhất Trong chuyên đề Di truyền học được chia làm 5 phần nhỏ, bao gồm:

- Cơ chế di truyền và biến dị

- Tính quy luật của hiện tượng di truyền

Vì vậy, để đáp ứng cho yêu cầu nâng cao, chuyên sâu giáo viên và học sinh cần tham khảo thêmnhiều tài liệu khác

Nhận thấy những khó khăn đó, tôi đã tiến hành viết đề tài về “ỨNG DỤNG DI TRUYỀN HỌC – CÔNG NGHỆ GEN”

2 Mục đích của đề tài:

- Biên soạn hệ thống lí thuyết về chuyên đề Ứng dụng di truyền học – Công nghệ gen

- Biên soạn hệ thống câu hỏi vận dụng lí thuyết, bài tập

- Cung cấp cho học sinh những kiến thức chuyên sâu, nâng cao về Ứng dụng di truyền học –Công nghệ gen phục vụ cho thi HSG các cấp, đặc biệt là kì thi chọn HSG Quốc gia

- Rèn luyện tư duy, khả năng vận dụng kiến thức đã học để giải quyết các vấn đề khó đặt ra

B PHẦN NỘI DUNG

I LÝ THUYẾT

1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN TRONG CÔNG NGHỆ GEN

1.1 Công nghệ gen

Công nghệ gen là một quy trình công nghệ dùng để tạo ra những tế bào hoặc sinh vật

có gen bị biến đổi hoặc có thêm gen mới

1.2 Kĩ thuật chuyển gen

Là các thao tác tác động lên ADN để chuyển một đoạn ADN mang một hoặc mộtcụm gen từ tế bào của loài cho sang tế bào nhận

1.3 Kĩ thuật PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để

khuếch đại một hoặc một vài bản sao của một đoạn AND theo cấp lũy thừa, tạo ra hàng ngàn đếnhàng triệu bản sao của một trình tự ADN nào đó

1.4 Kĩ thuật điện di

Điện di trên gel (gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là một kĩ thuật đểphân tích các phân tử ADN, ARN hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kíchthước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích (isoelectric point)

1.5 ADN tái tổ hợp

ADN tái tổ hợp (recombinant ADN) là phân tử ADN được tạo ra trong ống nghiệm bằng

cách kết hợp các ADN từ các nguồn (loài) khác nhau, theo một quy trình kỹ thuật nhất định, gọi

là kỹ thuật tái tổ hợp ADN

Thông thường một phân tử DNA tái tổ hợp bao gồm một phân tử ADN có bản chất là

plasmid hoặc phage nguyên vẹn gọi là vector (thể tải) và một đoạn ADN từ nguồn khác mang

một gene hoặc yếu tố điều hòa mong muốn được cho xen vào; nó được gọi là ADN ngoại lai

(foreign ADN)

1.6 Sinh vật chuyển gen

Sinh vật biến đổi gen (Genetically Modified Organism) là một sinh vật mà vật liệu di

truyền của nó đã bị biến đổi theo ý muốn chủ quan của con người Ngoài ra cũng có thể có nhữngsinh vật được tạo ra do quá trình lan truyền của gen trong tự nhiên Ví dụ quá trình lai xa giữa cỏdại với cây trồng biến đổi gen có cùng họ hàng có thể tạo ra loài cỏ dại mang gen biến đổi

2 CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG CÔNG NGHỆ GEN

2.1 Tách chiết axit nucleic

2.1.1 Tách chiết ADN

a Nguyên tắc chung:

- ADN có kích thước lớn, tan trong nước hoặc đệm, kết tủa trắng trong dung môi cồn Ởtrạng thái kết tủa rất dễ đứt gãy, vì thế mẫu ADN được thường bảo quản ở dạng dung dịch Nếumẫu ADN sử dụng ngay, thường được hòa tan vào nước khử ion Ngược lại, để bảo quản lâu,mẫu ADN thường được bảo quản trong đệm TE (Tris – EDTA) nhằm tránh sự nhiễm nuclease

- Độ sạch của mẫu ADN sau khi tách chiết được xác định theo tỷ lệ giá trị đo huỳnh quang

ở bước sóng A260 và A280 Mẫu ADN được xem là đủ sạch khi tỷ lệ A260/A280≈2,0

- ADN được nhìn thấy trong bản gel điện di dưới ánh sáng UV sau khi đã nhuộm ethidiumbromide

- Phương pháp tách chiết ADN gồm 5 bước chính sau:

+ Bước 1: Phá vỡ thành tế bào bằng biện pháp cơ học enzyme Ở tế bào thực vật hoặcđộng vật, cần có bước tách tế bào ra khỏi mô của chúng

+ Bước 2: Sử dụng chất tẩy rửa (SDS, hoặc sarcosyl) để phá vỡ lớp phospholipid củamàng tế bào và màng nhân Trong một số trường hợp, người ta bổ sung thêm protenase K

+ Bước 3: Loại bỏ thành phần không mong muốn trong mẫu, như các protein,polysaccharide Mẫu được bổ sung hỗn hợp dung dịch (phenol: chloroform: isoamyl alcohol tỉ lệ(25:24:1) Sau ly tâm cao tốc hỗn hợp dung dịch chia làm 3 pha: Pha trên cùng là pha nước chứaADN, ARN; Pha giữa là pha chứa protein và các chất thứ cấp bị kết tủa; Pha dưới là dung dịchphenol: chloroform: isoamyl alcohol

Việc loại bỏ ARN bằng được thực hiện bằng cách thêm ARNase vào dung dịch hỗn hợp

và ủ khoảng 5 – 10 phút

+ Bước 4: Kết tủa ADN bằng isopropanol (ở nhiệt độ -20oC, khoảng 20 phút) hoặc ethanol(ở -80oC, qua đêm) để loại bỏ hoàn toàn các chất không mong muốn còn hòa tan trong dịch mẫu.Sau khi ly tâm, loại bỏ dung dịch lỏng chứa tạp chất, ta sẽ thu được cặn ADN kết tủa

+ Bước 5: Hòa tan cặn ADN bằng nước khử ion hoặc dung dịch đệm TE

b Một số quá trình tách chiết ADN ở các đối tượng khác nhau

* Tách chiết ADN động vật

- Có thể tách chiết ADN từ các nguyên liệu khác nhau như máu, nước bọt, mô lông, tóc(còn nguyên chân tóc, chân lông) và các loại mô khác

- Nguyên tắc chung:

+ Tách tế bào có nhân ra khỏi mô

+ Phá vỡ màng tế bào, màng nguyên sinh chất và phân hủy protein, giải phóng ADN rakhỏi nhân

+ Tách ADN ra khỏi đệm chiết và bảo quản ADN đến -20oC

+ Sử dụng đệm có chất tẩy rửa (CATB) để phá vỡ màng tế bào, giải phóng ADN

+ Sử dụng hóa chất ức chế nuclease (EDTA) nhằm bảo vệ sự nguyên vẹn của ADN trước

sự tác động của nuclease nội bào

+ Tách bỏ các tạp chất, protein ra khỏi hỗn hợp nhờ li tâm phân đoạn nhờ hỗn hợp các hóachất chloroform, isoamyl alkohol, phenol…

+ Thu hồi ADN bằng cách tạo kết tủa với ethanol hoặc isopropanol Sau đó li tâm loại bỏdịch lỏng và thu hồi cặn ADN trong hỗn hợp

+ Hòa tan ADN bằng nước ( sử dụng ngay sau đó) hoặc dung dịch đệm (bảo quản lâu dài)

* Tách chiết ADN vi khuẩn

Về nguyên tắc chung, việc tách chiết ADN từ vi khuẩn cũng giống tách chiết ADN từ thựcvật hay động vật Điều khác cơ bản là phải nuôi vi khuẩn để thu sinh khối tế bào và phương pháp

để phá vỡ màng peptidoglycan của vi khuẩn Có thể sử dụng biện pháp cơ học để phá vỡ thành tếbào vi khuẩn như nghiền, sóng siêu âm… Người ta cũng có thể enzyme lisozym để phá vỡ màng

Quy trình tách chiết ADN plasmid

Quy trình bao gồm 6 bước như sau:

- Bước 1: Dịch nuôi cấy vi khuẩn được li tâm ở 5000 vòng/ phút, thu cặn, loại bỏ dịch nổi

- Bước 2: Hòa tan cặn bằng dịch thủy giải GET Sau đó thêm vào 1,5 thể tích AlkalineSDS (200 mM NaOH và 1% SDS) và ủ hỗn hợp 5p ở nhiệt độ thường Trung hòa hỗn hợp dungdịch bằng dung dịch trung hòa (3 mM CH3COONa) Lắc đều tuýp cho đến khi xuất hiện màutrắng đục, đem li tâm và loại bỏ cặn

- Bước 3: Làm lạnh tuýp và thêm Rnase (3 μ 1) Đảo ngược Eppendorf 2-3 lần cho trộnđều và ủ nhiệt độ 30oC

- Bước 4: Kết tủa protein bằng hỗn hợp chloroform và phenol

- Bước 5: Kết tủa ADN bằng ethanol hoặc isopropanol

- Bước 6: Hòa tan ADN trong dung dịch đệm, kiểm tra và cất giữ

2.1.2 Tách chiết ARN

Các phân tử ARN không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzyme RNase Mặt khác, RNase cómặt khắp nơi, có hoạt tính cao và rất bền với các tác nhân thường dùng để loại bỏ hoạt tínhRNase (xử lí nhiệt ở 90oC trong 1 giờ không làm mất hoạt tính RNase) Vì vậy, việc tách chiếtARN đòi hỏi nhiều biện pháp thận trọng để tránh mọi tạp nhiễm bởi các ARNse từ môi trường.Mặt khác, khi tách chiết ARN, để tránh lẫn lộn người ta thường loại bỏ ADN bằng enzymenuclease

Như ta đã biết, 90-99% tổng số ARN trong tế bào là rARN (80-85%) và tARN (15-20%).Các ARN này có kích thước và trình tự xác định và có thể tách riêng dễ ràng bằng điện di, li tâm.Riêng đối với mARN rất đa dạng nên để tách chiết riêng mARN, người ta tiến hành sắc ký ái lựctrên cột oligo T-celulose dựa vào cấu trúc đuôi polyA trên mARN

2.2 Điện di

Phương pháp này được sử dụng để phân tích định tính và thu nhận mẫu axit nucleic.Nguyên tắc của nó dựa vào đặc tính cấu trúc của các axit nucleic Các nguyên tố phospho đã tạo

điện tích âm trên toàn diện bề mặt, nên khi chịu tác động của điện trường, các phân tử axitnucleic sẽ di chuyển về phía cực dương Tốc độ di chuyển của các phân tử axit nucleic trong gelphụ thuộc vào kích thước, độ đậm đặc của gel và cả đặc tính của phân tử (dạng kép, dạng đơn,dạng vòng, dạng siêu xoắn…).

- Điện di trên gel (gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là một kĩ thuật để

phân tích các phân tử ADN, ARN hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kíchthước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích (isoelectric point) Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch

đệm (buffer) để dẫn diện và tạo điện trường đều, một bản gel (thường là agarose hay

polyacrylamide) đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử, và các chất nhuộm khác nhau(ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di

Kĩ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện vàkích thước lỗ của thể nền (gel) Gel cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử (polymer) được liên kếtchéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với kích thước các mắc lưới tùy thuộc vào nồng

độ chất cao phân tử (agarose, polyacrylamide) và phản ứng tạo liên kết chéo

Các phân tử được phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ vào sựkhác nhau của:

(a) lực của điện trường tác động lên chúng (nếu các phân tử tích điện khác nhau)

(b) kích thước của phân tử so với kích thước lỗ của gel

(c) hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử

- Gel agarose: Là một polysaccharide, thường được chiết xuất từ rong biển đỏ nhất định.

Nó là một polymer tuyến tính được tạo thành từ đơn vị lặp đi lặp lại của agarobiose, là mộtdisaccharide tạo thành từ D -galactose và 3,6-anhydro- L -galactopyranose Agarose là một tronghai thành phần chính của thạch, và được tinh chế từ thạch bằng cách loại bỏ thành phần khác củaagar, agaropectin Agarose có cấu trúc dạng lưới ba chiều các kênh có đường kính từ 50 nm đến>

200 nm tùy thuộc vào nồng độ agarose được sử dụng - nồng độ cao hơn mang lại đường kính lỗchân lông trung bình thấp hơn Cấu trúc 3-D được tổ chức cùng với liên kết hydro và do đó cóthể bị gián đoạn do làm nóng trở lại trạng thái lỏng

Vì có cấu trúc dạng lưới phù hợp nên agarose thường được sử dụng trong sinh học phân tử

để tách các phân tử lớn, đặc biệt là ADN, bằng điện di Các tấm gel agarose (thường là 0,7 - 2%)đối với điện di được chuẩn bị dễ dàng bằng cách đổ dung dịch ấm, lỏng vào khuôn Một loạt cácagaroses khác nhau của trọng lượng phân tử khác nhau và tài sản là thương mại có sẵn cho mụcđích này Agarose cũng có thể được hình thành thành các hạt và được sử dụng trong một sốphương pháp sắc ký để làm sạch protein

- Gel polyacrylamide: Hydrat hóa acrylonitrile dẫn đến sự hình thành các phân tử

acrylamide (C3H5NO) bởi nitrile hydratase Acrylamide monome ở trạng thái bột trước khi bổsung nước Acrylamide là độc hại đối với hệ thần kinh của con người, do đó tất cả các biện pháp

an toàn phải được tuân theo khi làm việc với nó

Acrylamide hòa tan trong nước và khi bổ sung nước, nó polyme hóa dẫn đến sự hìnhthành polyacrylamit Nó rất hữu ích để làm cho gel polyacrylamide thông qua acrylmidehydration vì kích thước lỗ chân lông có thể được điều chỉnh Tăng nồng độ acrylamide dẫn đếngiảm kích thước lỗ chân lông sau khi trùng hợp Polyacrylamide gel có lỗ chân lông nhỏ giúp

kiểm tra các phân tử nhỏ hơn tốt hơn vì các phân tử nhỏ có thể đi vào lỗ chân lông và di chuyểnqua gel trong khi các phân tử lớn bị mắc kẹt tại các lỗ hở.

- Điện di trên gel agarose: Điện di trên gel agarose là phương pháp thông thường để giải

quyết ADN trong phòng thí nghiệm Gel agarose có thấp hơn năng suất phân giải cho ADN hơngel acrylamide, nhưng họ có phạm vi lớn hơn của tách, và do đó thường được sử dụng cho cácđoạn ADN với độ dài của 50-20,000 bp (cặp base), mặc dù độ phân giải của hơn 6 Mb có thể vớixung điện di gel trường (PFGE) Nó cũng có thể được sử dụng để tách các phân tử protein lớn, và

nó là ma trận ưu tiên cho điện di gel của các hạt có bán kính hiệu quả lớn hơn 5-10 nm

Kích thước lỗ chân lông của gel ảnh hưởng đến kích thước của ADN có thể được thuyêngiảm Nồng độ gel càng thấp thì kích thước lỗ càng lớn, và ADN càng lớn thì càng tốt Tuynhiên, gel có nồng độ thấp (0,1 - 0,2%) rất mỏng manh và do đó khó xử lý, và điện di của cácphân tử ADN lớn có thể mất vài ngày Giới hạn độ phân giải của điện di gel agarose chuẩn làkhoảng 750 kb Giới hạn này có thể được khắc phục bởi PFGE, nơi mà các trường điện trực giaoxen kẽ được áp dụng cho gel Các mảnh ADN định hướng lại bản thân khi trường ứng dụngchuyển hướng, nhưng các phân tử ADN lớn hơn mất nhiều thời gian hơn để tự điều chỉnh khiđiện trường bị thay đổi, trong khi điện trường nhỏ hơn, và DNA có thể được phân chia theo kíchthước

Gel agarose được đúc trong khuôn, và khi được đặt, thường chạy theo chiều ngang ngậptrong dung dịch đệm Bộ đệm Tris-acetate-EDTA và Tris-Borate-EDTA thường được sử dụng,nhưng các bộ đệm khác như Tris-phosphate, barbituric acid-sodium barbiturate hoặc Tris-barbiturate buffer có thể được sử dụng trong các ứng dụng khác ADN thường được hình dungbằng cách nhuộm với ethidium bromide và sau đó được xem dưới ánh sáng tia cực tím, nhưngcác phương pháp nhuộm màu khác có sẵn, chẳng hạn như SYBR Green, GelRed, xanh methylen

và tinh thể tím Nếu các đoạn ADN tách rời là cần thiết cho thí nghiệm tiếp tục ở hạ lưu, chúng

có thể được cắt ra từ gel trong lát để thao tác tiếp theo

2.3 Kỹ thuật PCR

PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm nhân bản một đoạn ADN trongống nghiệm dựa trên sự mô phỏng bộ máy sinh tổng hợp của ADN tế bào sống

2.3.1 Nguyên lí của kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR là một phương pháp tổng hợp ADN dựa trên mạch khuôn là một trình tựđích ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờhoạt động của enzyme polymerase Tất cả các ADN polymerase khi hoạt động tổng hợp mộtmạch ADN mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của mồi chuyên biệt, liên kết bổ sung vớimạch khuôn Đoạn mồi trong phản ứng PCR là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổsung với một mạch ADN khuôn

Thông thường, PCR bao gồm một chuỗi khoảng 20-40 lần biến đổi nhiệt độ lặp đi lặp lại,gọi chu kỳ, mỗi chu kỳ thường gồm 2-3 giai đoạn nhiệt độ riêng biệt, thường là ba Các chu

kỳ thường bắt đầu bằng giai đoạn nhiệt độ cao (>90°C), và sẽ dừng lại khi sản phẩm cuối cùngđược tổng hợp hoặc dừng lại ở nhiệt độ thấp để lưu trữ sản phẩm PCR trong thời ngắn Nhiệt độ

và thời gian thực hiện của mỗi chu kỳ phụ thuộc vào nhiều yếu tố Những yếu tố này gồmenzyme tổng hợp ADN, nồng độ ion hóa trị hai, dNTPs dùng trong phản ứng, và nhiệt độ nóngchảy (Tm) của mồi

- Giai đoạn khởi đầu: (Chỉ cần đối với những enzyme ADN polymerase bắt buộc phải

kích hoạt bằng nhiệt độ) Giai đoạn cần tăng nhiệt độ lên 94-96°C (hay 98°C nếu sử dụngpolymerases cực kỳ bền nhiệt) và được tiến hành trong 1-9 phút

- Giai đoạn biến tính: đây là bước đầu tiên của chu kỳ và là quá trình tăng nhiệt độ

lên 94-98°C trong 20-30 giây ADN được biến tính bằng cách phá vỡ liên kết hydro giữa cácbazo, tạo thành phân tử ADN sợi đơn

- Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50-65°C trong 20-40 giây để

mồi gắn vào sợi ADN đơn Nhiệt độ này cần phải đủ thấp để cho phép mồi bắt cặp với sợi ADN,nhưng cũng đủ cao cho quá trình bắt cặp đặc hiệu, nghĩa là, mồi chỉ nên gắn hoàn toàn với phầntrình tự bổ sung trên mạch khuôn Nếu nhiệt độ quá thấp, mồi sẽ gắn không đặc hiệu Nếu quácao, mồi có thể không gắn Thông thường nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn 3-5 °C so với Tmcủa mồi dùng trong phản ứng Liên kết hydro bền giữa phân tử ADN- ADN chỉ được hình thànhkhi mồi bổ sung hoàn toàn với khuôn Polymerase liên kết với các phân tử lai ADN mồi – khuôn

và bắt đầu tổng hợp ADN

- Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ trong giai đoạn này phụ thuộc vào các ADN polymerase sử

dụng; Taq polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 75-80°C , và nhiệt độ 72°C thường được sửdụng với enzyme này Tại giai đoạn này ADN polymerase tổng hợp sợi ADN mới bổ sung vớiADN khuôn bằng cách thêm dNTP theo nguyên tắc bổ sung theo chiều 5′ đến 3′, phản ứng trùngngưng xảy ra giữa nhóm 5′ – phosphate của dNTP với nhóm 3′ – hydroxyl phía cuối của sợiADN vừa mới được hình thành Thời gian của giai đoạn kéo dài phụ thuộc vào ADN polymerase

và độ dài của đoạn DNA cần khuếch đại Thông thường, các ADN polymerase có khả năngkhuếch đại được hàng nghìn bazo nito trên một phút Trong điều kiện tối ưu, tức là, nếu không cóhạn chế do giới hạn của cơ chất hoặc chất phản ứng thì sau mỗi giai đoạn kéo dài, số lượng ADNđược khuếch đại sau mỗi chu kì tuần theo hàm mũ

- Giai đoạn kết thúc kéo dài: Giai đoạn này đôi khi được thực hiện ở nhiệt độ 70-74 °C

(đây là nhiệt độ cần thiết cho hoạt động tối ưu của hầu hết các enzyme polymerase dùng trongphản ứng PCR), với thời gian 5-15 phút sau chu kỳ PCR cuối cùng để đảm bảo rằng tất cả ADNsợi đơn còn lại đều được tổng hợp hoàn toàn

- Giai đoạn bảo quản: Giai đoạn này thực hiện ở nhiệt độ 4-15°C trong một thời gian để

bảo quản ngắn hạn sản phẩm của phản ứng

Bảng 1 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Hình 1: Sơ đồ minh họa các bản sao được hình thành qua các chu kỳ phản ứng PCR

Trong kỹ thuật PCR, sự khuếch đại tối ưu sẽ đạt đượng trong điều kiện sợi khuôn đượctinh sạch Tuy nhiên, ngày nay người ta vẫn tiến hành PCR với dịch chiết thô Lượng ADN mẫucho một phản ứng thường đạt ngưỡng tối thiểu là 100ng Mặt khác, primer là chìa khóa của sựthành công hay thất bại của phản ứng Vì thế, tiêu chuẩn của primer cần được kiểm soát chặt chẽtrong bước thiết kế

Hiện nay, thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử với nhiều ứngdụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiểm nghiệm thực phẩm, kiểm nghiệm vi sinh vật gâybệnh, phát hiện pháp y, xác định huyết thống…

2.4 Đọc trình tự

Hiện nay có 3 phương pháp đọc trình tự phổ biến, bao gồm:

2.4.1 Phương pháp hóa học: Phương pháp Maxam-Gillbert

Phương pháp này dựa vào sự thủy giải đặc trưng phân tử ADN cần xác định trình tự bằngphương pháp hóa học Nguyên lí của phương pháp như sau:

Trước hết các phân tử ADN được đánh dấu một đầu bằng P32 hoặc S35 Sau đó, chúngđược chia thành năm phân đoạn, mỗi phân đoạn chịu một xử lí hóa học chuyên biệt có khả nănglàm biến đổi đặc trưng một loại nucleotide và cắt phân đoạn ADN tại nucleotide đó Năm nhómnucleotide bị tác động là: G, A, C, G+A, T+C

Bảng 2 Các hóa chất sử dụng để biến tính các nucleotide

Kết quả của các xử lí hóa học là sự hình thành nên năm tập hợp oligonucleotide, cácoligonucleotide trong một tập hợp có kích thước khác nhau nhưng đều chấm dứt tại cùng mộtloại nucleotide Cuối cùng, năm phân đoạn trên được đm phân tách trên gel polyacrylamide Vịtrí của các oligonucleotide trên gel tương ứng với kích thước của chúng và được phát hiện nhờđầu có đánh dấu phóng xạ Kết quả được đọc trên bản phóng xạ tự ghi.

2.4.2 Phương pháp enzyme học: Phương pháp Sanger

Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự mạch đơn cần xác địnhtrình tự nhờ enzyme ADN polymerase Nguyên lí của phương pháp là ngoài các nucleotide đã bịbiến tính nhóm OH ở vị trí 3' bằng H Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả nănghình thành liên kết phosphodiester và dẫn đến hiện tượng dừng tổng hợp

Trình tự ADN cần xác định phải được tạo dòng trên vector mạch đơn (thường là phageM13) Phản ứng tổng hợp được tiến hành trong bốn phân đoạn riêng Người ta lần lượt cho vàomỗi phân đoạn một trong bốn loại dideoxynucleotide với hàm lượng thấp Như vậy, với mộtADN khuôn duy nhất với bốn ống phản ứng khách nhau, mỗi ống có bổ sung chỉ một loại ddNTP

và với một mồi trên thì sau khi phản ứng, quá trình tổng hợp sẽ tạo ra các đoạn oligonucleotideđược kết thúc bởi các dideoxynucleotide Tiến hành điện di trên bốn giếng gel polycarylamidkhác nhau và kết quả được đọc trên bản phóng xạ tự ghi

2.4.3 Giải trình tự bằng máy tự động

Các phòng thí nghiệm hiện nay đều dùng phản ứng giải trình tự bằng phương phápenzyme, nhưng khi tiến hành giải trình tự thường dùng các máy tự động chứ không dùng kỹ thuậtphóng xạ tự ghi như trước đây Để thực hiện giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch ADNđơn sản sinh trong ống giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của cácmạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia laser Cấu tạo của một máy tự động giải trình tựgồm hai phần chính yếu, là phần điện di gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di.Phần điện di polyacrylamide có thể là một phần bản gel hay là một ống mao quản chứa gel Phầnphát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó.Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một chùm vạch điện di

đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảmquang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ Từ biểu đồ của các đỉnhcường độ ánh sáng này, máy sẽ đo dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phântích thành trình tự của đoạn ADN

Số mẫu chạy một lần phụ thuộc vào số mao quản của máy Tùy thuộc vào quy mô phòngthí nghiệm cùng với số mẫu giải trình tự mà phòng thí nghiệm có thể trang bị giải trình tự ít haynhiều mao quản

Ví dụ: Máy ABI có nhiều loại: 1, 4, 8, 16, 48 hay 96 mao quản

Một số thế hệ máy mới có những chương trình đi kèm để chẳng những có thể hiển thị tựđộng các ký tự hóa học của trình tự ADN mà còn giúp các nhà nghiên cứu có thể phát hiện đượccác chi tiết cần thiết trên trình tự như mã khởi đầu, mã kết thúc, vùng đọc mở, trình tự nhận biếtcủa enzyme cắt giới hạn, phiên dịch trình tự axit amin trong vùng đọc mở, tự động so sánh trình

tự ADN trong phòng thí nghiệm hay một trình tự ADN nạp vào máy…

2.5 Lai phân tử

2.5.1 Lai axit nucleic

Sau khi hai mạch đơn của sợi ADN kép tách ra dưới tác dụng của tác nhân nhân tạo (nhiệt

độ hoặc NaOH) gây biến tính loại bỏ liên kết hyđro Thông thường, người ta dùng tác nhân nhiệt

độ để biến tính và sử dụng chỉ số nhiệt độ nóng chảy của ADN để xác định thời điểm tách mạch.Khả năng bắt cặp lại của mạch kép theo nguyên tắc bổ sung được thực hiện khi ADN hồi tính.Lợi dụng đặc tính này, người ta tiến hành lai các phân tử ADN sợi đơn với các đoạn đánh dấu.Hiện tượng này được gọi là sự lai phân tử (molecular hybridization)

Do cấu tạo phân tử ADN gồm 2 mạch đơn, mỗi mạch bao gồm trình tự của bốn nucleotideđối xứng với nucleotide mạch kia theo nguyên tắc A = T (2 liên kết hydro), G = C (3 liên kếthydro) Nhiệt độ nóng chảy (Tm) là nhiệt độ tại đó có một nửa số phân tử ADN kép được tách rathành 2 sợi đơn Quá trình chuyển mạch từ kép thành đơn có đặc điểm xảy ra đột ngột, lúc đầuchưa đên Tm thì việc tách sợi kép khó hơn Tuy nhiên, khi nhiệt độ gần Tm, do tính cộng hưởngcủa phản ứng, giống như ta kéo tách sợi dây thừng, lúc đầu tác động một lực vào nhưng vẫn khótách ra, khi đã tách ra rồi thì lại nhanh và dễ

Phân tử ADN nào có tỷ lệ C≡G lớn tức là phân tử đó bền vững và nhiệt độ nóng chảy phảicao và ngược lại Trong điều kiện chuẩn, Tm thường được tính theo công thức: Tm = 69,3 + 0,41(%GC)

Đoạn ADN càng dài thì số cặp nucleotide lớn tức số liên kết hydro lớn nên Tm sẽ cao Sựthay đổi Tm theo chiều dài phân tử ADN được tính theo công thức sau:

∆Tm = -500/ số lượng cặp nucleotide

Những đoạn có bắt cặp sai lệch như A với C và G với T chẳng hạn sẽ làm mất liên kếthydro dẫn đến làm giảm tính ổn định của phân tử lai Theo ước tính thông thường, cứ có 1%nucleotide ghép cặp sai thì Tm sẽ giảm đi 1oC Tuy nhiên, bắt cặp sai chỉ có ảnh hưởng trongtrường hợp đối với đoạn ADN ngắn

Lai axit nucleic có 2 đặc điểm sau:

- Đặc thù tuyệt đối, tức sự bắt cặp trở lại chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung,cho dù chúng chỉ có hai bản sao nằm lẫn lộn giữa hàng triệu trình tự khác

- Các trình tự bổ sung có thể là ADN hoặc ARN dẫn đến tạo thành phân tử lại dưới cácdạng có thể sau: ADN/ADN; ARN/ARN và ADN/ARN

2.5.2 Lai ptotein – Phương pháp Western blotting

Western blotting là phương pháp được sử dụng để nhận diện một kháng nguyên đặc hiệunhờ các kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng tương ứng Dựa trên cơ sở mối liên kết giữa enzymevới kháng thể có liên quan đến việc hình thành liên kết cộng hóa trị bền vững giữa một nhómchức hóa học gắn vào enzyme (horseradish peroxidase – HRPO, urease hay alkalinephosphatase) với một kháng thể đơn hoặc đa dòng đặc thù, làm cho vị trí kết hợp kháng nguyêncủa kháng thể và vị trí hoạt động của enzyme bị thay đổi về chức năng Phương pháp này có 4giai đoạn phản ứng hóa học để nhận biết mối liên kết giữa kháng thể và kháng nguyên đặc thù

Đó là:

- Hoạt hóa HRPO bằng cách oxy hóa gốc đường bằng NaIO4

- Hình thành cầu nối giữa enzyme peroxidase hoạt hóa với gốc amino của kháng thể để tạothành vị trí Schiff base

- Khử Schiff base bằng NaBH4 nhằm biến N thành NH để tạo thành phức hợp bền vữnggiữa HRPO với kháng thể IgG.

- Phát hiện ra kết tủa màu vàng của MUP (4-methylumbellieryl phospate) hay NPP nitrophenyl phosphate) Có 2 phương pháp xác định lai giữa kháng nguyên với kháng thể, trênpha lỏng gọi là phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) và trên pha rắn làWestern blotting

(p-Đầu tiên các mẫu protein kiểm tra được biến tính, phân giải thành các tiểu cấu tử Các hóachất thường sử dụng là SDS (sodium dodecyl sulfate), DTT (dithiothreitol) hoặc 2-ME (2-mercaptoethanol) Sau đó các mẫu protein này được phân tách nhờ điện di SDS-PAGE, hoặcbằng điện di 2 chiều trong một số trường hợp Các vệt vạch protein được chuyển lên và gắn chặttrên bề mặt màng nilon, nitrocelulose hoặc PVDF rồi tiến hành phản ứng lai với phức enzymekháng thể bền vững đã chuẩn bị trước Tất cả các vị trí kháng nguyên tồn tại trên màng được cốđịnh bằng cách cho màng lai chìm ngập trong môi trường chứa một số chất tăng khả năng cốđịnh Sau đó cho lai với kháng thể kết gắn enzyme bền vững, màng lai được rửa sạch nhằm loại

bỏ những kháng nguyên không lai hoặc lai không đặc thù thì sẽ phát sáng màu tùy việc chúng ta

sử dụng enzyme horseradish peroxidase (HRPO), alkaline photphatase hay urease cặp đôi vớikháng thể

2.5.3 Lai tại chỗ (In situ hybridization)

Lai tại chỗ là một kỹ thuật được sử dụng để định vị những đoạn axit nucleic bổ sung vớimẫu dò được đánh dấu đặc thù trên nhiễm sắc thể trong tế bào sinh vật nhân thật hoặc tế bào vikhuẩn Để tiến hành định vị những trình tự ADN đặc thù, người ta tiến hành xử lý mẫu vật đểlàm biến tính ADN và loại bỏ những ARN và protein trong mẫu Đoạn ADN quan tâm sau đóđược phát hiện bằng cách lai với mẫu dò axit nucleic đánh dấu Phân bố của những ARN đặc thùtrong một số tế bào nhiễm sắc thể, có thể được định vị bằng cách lai với những mẫu thử ( chứanhững ARN hoặc ADN mẫu dò thích hợp) được tách cắt thành từng phần hoặc được ép nén

Lai tại chỗ là một kiểu lai phân tử đó trình tự axit nucleic cần tìm (trình tự đính) nằmnguyên ngay trong tế bào hay trong mô Như vậy phương pháp này không cần khâu tách chiếtaxit nucleic ra khỏi mô và tế bào Phương pháp được ứng dụng trong việc định vị gen trên nhiễmsắc thể, trong lai khuẩn lạc có chứa plasmid tái tổ hợp hoặc nghiên cứu quá trình phiên mã từngmARN trong mô chuyên biệt trong tế bào và mô

a Lai khuẩn lạc (colony hybridization)

Là kỹ thuật được dùng để phát hiện những dòng vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp cầntìm trong một ngân hàng gen Để lai khuẩn lạc, người ta tiến hành nuôi cấy tế bào vi khuẩn trênđĩa petri chứa nền agar để tạo các khuẩn lạc (colony) Sau đó chuyển các khuẩn lạc sang bámchặt vào màng nitrocellulose hoặc nylon bằng cách áp màng lai, màng lai sau đó được xử lí bằngNaOH để làm phá vỡ tế bào vi khuẩn, đồng thời làm biến tính ADN giải phóng ADN và ADNnày được cố định trên màng bằng cách nhúng vào nước nhiệt độ 800C Các bước lai tiến hànhnhư đã làm trên pha rắn Sau khi lai với mẫu dò đánh dấu, vị trí của những khuẩn lạc chứa trình

tự mục tiêu được xác định bằng phóng xạ tự ghi không bằng phương pháp không dùng phóng xạ,

ta sẽ biết và thu được những dòng vi khuẩn có chứa gen mục tiêu mong muốn

b Lai nhiễm sắc thể (chromosome hybridization)

Sử dụng phương pháp này để định vị nuôi cấy chính xác và sự phân bố của một trình tựADN mục tiêu trên nhiễm sắc thể nhờ một mẫu dò chuyên biệt Để tiến hành, người ta thườngdùng nhiễm sắc thể ở giai đoạn kỳ giữa (thường lấy nhiễm sắc thể của tế bào bạch cầu) được xử

lý bằng các phương pháp tế bào học trên lam kính Đó là công đoạn loại bỏ ARN bằng cách xử lýenzyme ARNse, loại bỏ protein bằng cách xử lý proteinase K

Sau đó, nhiễm sắc thể cố định trên lam kính được lai với mẫu dò đánh dấu Dùng cácphương pháp phát hiện phân tử lai tùy theo phương thức đánh dấu được sử dụng, chúng ta có thểquan sát và phát hiện được vị trí của phân tử lai trên nhiễm sắc thể bằng kính hiển vi

c Lai trên bào và mô (Cell ADN tissues hybridization)

Trong cơ thể, ở các tế bào và mô khác nhau, các ARN (đặc biệt là các mARN) có sự phân

bố về thời gian và sự khác nhau giữa các tế bào và mô Sự phân bố về thời gian này có liên quanđến chức năng và sự điều hòa biểu hiện của gen cũng như tương tác giữa mARN với các thànhphần khác nhau của tế bào và mô Nếu nghiên cứu các ARN tách chiết thì không thể nắm đượccác thông tin kể trên, muốn hiểu được phải tiến hành sử dụng phương pháp lai trên tế bào và mô

Để tiến hành, người ta xử lý mô qua các bước như: Cố định mẫu, khử nước, tẩm paraffin,cắt thành từng lát mỏng (7-10μm), trải chúng trên lame Cuối cùng thực hiện các thao tác xử lýmẫu, lai và phát hiện ra phân tử có trong mô tế bào cũng tương tự như trong phương pháp lai trênnhiễm sắc thể Kết quả được đọc trên lame bằng kính hiển vi

Phương pháp này thường được sử dụng trong các trường hợp đối tượng nghiên cứu có tổchức phức tạp, bao gồm nhiều tập hợp tế bào khác nhau như não bộ Thông tin này có ý nghĩaquan trọng trong việc xác định vai trò và chức năng của mARN đối với tình hình hiện trạng mô

Trong phương pháp miễn dịch tế bào có thể phát hiện được một protein chuyên biệt cótrong một tế bào thông qua kháng thể đặc trưng của nó Khi phối hợp giữa các phương pháp miễndịch (lai protein) với phương pháp lai tại chỗ ARN, người ta có thể phát hiện sự tồn tại đồng thờigiữa mARN và protein trong mô Từ đó xác định được mối tương quan giữa hoạt động phiên mã

và dịch mã của một gen

Bằng cách lai nhiều lát cắt liên tục của một mô (các cấu trúc của lát cắt gần như đồngnhất) với nhiều mẫu dò khác nhau, người ta có thể xác định được vị trí, sự phân bố và tương quangiữa nhiều mARN cùng tham gia vào một quá trình sống

Hiện nay, nhờ sự tiến bộ rất nhanh trong kỹ thuật đánh dấu mẫu dò bằng hóa chất phátquang, đã giúp đỡ nhiều cho phương pháp lai tại chỗ Đặc biệt giúp chúng ta có thể quan sát đồngthời một lúc nhiều tập hợp các phân tử lai khác nhau nếu ta sử dụng các mẫu dò được đánh dấubằng các hóa chất biểu hiện nhiều màu khác nhau

2.6 Kỹ thuật tạo cADN – Xây dựng thư viện gen

Thư viện gen thực chất là một tập hợp toàn bộ các dòng tế bào mang vector tái tổ hợp màmỗi loại mang các bản sao của đoạn nhất định trong bộ gen ban đầu Mỗi dòng tái tổ hợp trong

bộ gen giống như một cuốn sách chứa đựng thông tin đặc thù

Trong kỹ thuật xây dựng thư viện gen, người ta có hai phương pháp đó là:

- Phương pháp 1: nhân dòng ngẫu nhiên (shotgun) từ các đoạn cắt của enzyme cắt giới hạn

và lưu trữ cADN Trong phương pháp nhân dòng ngẫu nhiên, mỗi một đoạn cắt sẽ được nhândòng vào một vector, sau đó chọn lọc và lưu giữ Phương pháp này cũng được sử dụng nhiều,

song đối với bộ gen của sinh vật nhân thực sẽ gặp khó khăn khi biểu hiện vì sự xuất hiện của genphân mảnh Bộ gen của sinh vật nhân thực có kích thước rất lớn, gồm nhiều gen và cấu trúc rấtphức tạp Sự phân mảnh của các đoạn ADN ở sinh vật nhân thực gây khó khăn cho việc tạo dòng

từ phân tử ADN gốc Người ta sẽ rất khó xác định các đoạn ADN không chứa intron để nhân

dòng, tạo lập một sản phẩm protein hoàn chỉnh

- Phương pháp 2: dùng mARN để tạo và lưu trữ cADN bằng kỹ thuật tạo thư viện củacADN của bộ gen.Người ta thường phải theo cơ chế sao mã ngược từ phân tử mARN trưởngthành Các phân tử ADN tạo ra theo cách này được gọi là cADN (complementary ADN) Tổng

số các đoạn cADN thu được từ một tế bào, ở các giai đoạn khác nhau tạo thành thư viện cADN

Trình tự các bước tạo cADN có thể được tóm tắt như sau:

+ Tách chiết ARN tổng số, sau đó tách riêng mARN Thông thường người ta dùng sắc kývới màng cellulose – oligoT do phân tử mARN trưởng thành ở sinh vật nhân thực có đuôi polyA.Sau khi rửa trôi các loại ARN khác trong hỗn hợp, mARN được tách ra khỏi màng nhờ phức chấtTris-EDTA

+ Sử dụng mARN làm khuôn cùng với enzyme sao mã ngược reverse transcriptase nhằmlắp ghép các nucleotide theo khuôn mARN để tạo phân tử cADN

+ Tạo dòng cADN, lưu giữ để xây dựng thư viện cADN

+ Chọn lọc dòng bằng lai phân tử

Ưu thế của kỹ thuật này là tạo được dòng phân tử không chứa intron, chủ động tạo ra sảnphẩm protein mong muốn nhờ biến nạp vector tạo dòng và vật chủ mới, từ đó có thể sản xuấtsinh khối protein mong muốn Tuy nhiên, kỹ thuật tạo cADN cho ta nhiều gen khác nhau Mặtkhác, mỗi giai đoạn phát triển khác nhau của cơ thể thì sự phiên mã của bộ gen là khác nhau, vìvậy sự thiết lập ngân hàng cADN và chọn lọc gen mong muốn đòi hỏi công phu, tỉ mỉ và tốnnhiều thời gian

3 CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP

3.1 Các enzyme và vector chủ yếu dùng trong kĩ thuật ADN tái tổ hợp

3.1.1 Các enzyme cắt giới hạn

Enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease) hay gọi tắt là enzyme giới hạn (restrictase)

là loại enzyme có khả năng nhận biết đoạn trình tự nucleotide đặc hiệu trên các phân tử ADNvàcắt cả hai sợi ADN bổ sung tại các vị trí đặc thù

a Vai trò của các enzyme cắt giới hạn

Từ 1953 người ta đã phát hiện thấy rằng, khi đưa ADN vào, gọi là ADN ngoại lai hayADN lạ, mất hẳn hoạt tính di truyền và hầu như bao giờ cũng bị phân cắt thành các đoạn ngắn.Chỉ trong một số ít trường hợp ADN lạ đó mới không bị phân cắt và do đó nó có thể tái bản trong

tế bào chủ Điều đó chứng tỏ ADN lạ được sửa đổi bằng cách nào đó dưới sự kiếm soát của tế

bào chủ Các hiện tượng nói trên xảy ra chủ yếu khi các thể thực khuẩn (phage) xâm nhiễm các

tế bào vi khuẩn Cho đến đầu thập niên 1970 người ta mới biết rõ rằng các tế bào vi khuẩn lànhững hệ thống chứa cả hai loại enzyme: các enzyme sửa đổi và các enzyme cắt giới hạn Chúngđều có đối tượng nhận biết là các đoạn trình tự của ADN vật chủ và ADN ngoại lai, nhưng có vai

trò khác nhau Cụ thể, các enzyme sửa đổi (methylase) đóng vai trò bảo vệ DNA vật chủ bằng cách gắn thêm nhóm methyl (-CH3) ở một số base nhất định trong đoạn nhận biết (recognition sequence) hay đoạn đích (target sequence) Hiện tượng methyl hoá (methylation) này thường xảy

ra đối với adenine và biến đổi nó thành N-6 methyladenine Trong khi đó, các enzyme giới hạnlại đóng vai trò vô hiệu hoá hoạt tính di truyền của các ADN lạ bằng cách phân cắt ở các vị trí

đặc thù chừng nào nó chưa được sửa đổi cho giống với ADN vật chủ Như vậy, các enzyme giới

hạn đóng vai trò là hàng rào bảo vệ tự nhiên của các vi khuẩn nhằm chống lại sự xâm nhập của các phage lạ

b Tính chất chung của các enzyme giới hạn

Trước tiên, cần lưu ý rằng các enzyme giới hạn chỉ phát hiện thấy ở các vi khuẩn mà không có ởcác eukaryote Vì vậy, tên gọi của các enzyme giới hạn thông dụng là tên hệ thống, được biểu thịbằng ba hoặc bốn chữ cái viết tắt của vi khuẩn mà từ đó enzyme được chiết xuất Chữ cái đầu

tiên được viết hoa để chỉ chi (genus) và hai chữ cái tiếp theo viết thường để chỉ loài (species), và khi cần thiết thêm chữ cái thứ tư để chỉ nòi hoặc chủng (strain, type) Ngoài ra, để phân biệt các

enzyme cùng một nòi người ta dùng số La Mã kèm theo sau tên hệ thống

Hình 2 Enzyme giới hạn (EcoRI) cắt các DNA khác nhau.

Tính chất quan trọng nhất của các enzyme giới hạn là tính đặc hiệu vị trí, nghĩa là chúng

có thể nhận biết đoạn trình tự DNA đặc thù để cắt ở vị trí xác định

Bảng 3 Trình tự nhận biết và nguồn gốc một số enzyme giới hạn phổ biến

Tên vi sinh vật Enzyme Trình tự nhận biết

Bacillus amyloliquefaciens H BamH I G/GATCC

Bacillus amyloliquefaciens H BamK I G/GATCC

Escherichia coli Ry 13 EcoR I G/AATTC

Haemophilus influenza Rb Hind III A/AGCTT

Streptomyces achromogenes Sac I GAGCT/C

Streptomyces achromogenes Sac II CCGC/GG

c Phân loại các enzyme giới hạn

Sau đó, tùy theo phương thức cắt và nguồn gốc của các enzyme đó, người ta đã chia nóthành 3 nhóm là I, II và III

(1) Enzyme giới hạn loại I có trình tự nhận biết đặc hiệu Vị trí cắt của các enzyme loạinày nằm ngoài trình tự nhận biết của một khoảng cách không nhất định, dao động từ 1.000 đến5.000 nucleotide Do không có tính đặc hiệu trong các đoạn nên sản phẩm của nó không đồngnhất và không phát hiện được bằng cách điện di trên gel Phân tử lượng của chúng vào khoảng300.000 D các bán đơn vị không giống nhau Cần Mg2+ làm co-factor và ATP để cung cấp nănglượng cho enzyme này chuyển động dọc theo phân tử ADN từ điểm nhận biết đến điểm cắt Ví

dụ như EcoK do Meselson và Yuan tách được, cắt ở điểm cách trình tự nhận biết 1.000

nucleotide hoặc xa hơn nữa

(2) Enzyme loại II bao gồm những enzyme có trình tự nhận biết chuỗi nucleotide đặc hiệu.Khi nhận biết được trình tự đó, chúng cắt ngay tại vị trí nhận biết Phân tử lượng thấp hơn loại I

và ở vào khoảng 20.000 đến 100.000 D Chỉ cần Mg2+ là co-factor và không cần năng lượngATP Do có tính đặc hiệu về cắt đoạn ADN nên sản phẩm thủy phân là tập hợp những đoạn ADNđặc hiệu và cho phép phát hiện bằng điện di trên gel agarose Cho đến nay trên 1.000 loạienzyme giới hạn loại II đã được tách ra từ các tế bào sinh vật nhân sơ khác nhau và có hơn 70loại đang được thương mại hóa trên thị trường

(3) Enzyme loại Loại III bao gồm những enzyme sau khi nhận biết một trình tự ADN đặchiệu thì cắt ở vị trí cách đó 20 nucleotide và tạo một số đầu cắt khác nhau Tuy rằng, vị trí điểmcắt rất gần trình tự nhận biết của chúng nhưng khó đoán trước được các điểm cắt đó Vì vậyenzyme giới hạn loại III cũng như enzyme giới hạn loại I không được sử dụng rộng rãi trongcông nghệ di truyền

Trong ba loại enzyme nói trên chỉ có enzyme giới hạn loại II được ứng dụng nhiều hơntrong công nghệ sinh học và công nghệ phân tử

3.1.2 Các enzyme polymerase

a ADN polymerase I của E.coli

Enzyme này dịch chuyển điểm đứt (nick) trên một sợi của ADN sợi đôi Chức năng chínhcủa enzyme là sửa sai dọc theo phân tử ADN Nếu gặp chỗ sai sót, nó sẽ đi ngược lại để cắt bỏ

sau đó mới tổng hợp ADN ADN polymerase I của E.coli mang chuỗi polypeptide có khối lượng

phân tử (M) là 109.000 Da với ba hoạt tính riêng biệt:

- Hoạt tính polymerase 5’-3’: ADN polymerase I của E.coli xúc tác cho sự tổng hợp ADN

theo chiều 5’-3’ bằng cách bổ sung các gốc nucleotide vào đầu tận cùng 3’-OH được tạo ra khimột sợi của phân tử ADN sợi đôi bị đứt

- Hoạt tính exonuclease 3’-5’: ADN polymerase I của E.coli cắt các chuỗi nucleotide ở các

đầu tự do của ADN , xúc tác cho sự thoái biến bậc thang từ đầu 3’ của cả ADN sợi đôi và sợi đơnkhi không có các dNTP Trong trường hợp không có các dNTP, hoạt tính exonuclease trên sợiđôi sẽ bị ức chế bởi hoạt tính polymerase Trong quá trình tổng hợp ADN, hoạt tính exonucleasethực hiện chức năng đọc sửa (proofreading) bằng cách cắt bỏ những nucleotide bị lắp ráp sai

- Hoạt tính exonuclease 5’-3’: ADN polymerase I của E.coli có thể chuyển chỗ các

nucleotide từ phía 5’ của điểm đứt và bổ sung tức thời các nucleotide từ phía 3’ tạo ra chuyểnđộng của điểm đứt dọc theo ADN

- Ứng dụng chính:

+ Đánh dấu đoạn ADN để làm mẫu dò dịch chuyển điểm đứt

+ Khởi đầu cho sự tổng hợp sợi thứ hai trong tạo dòng cADN

+ Xác định trình tự ADN bằng phương pháp Sanger

b Đoạn Klenow của ADN polymerase I của E.coli

Enzyme này có tác dụng lấp đầy các đầu khuyết 3’ của ADN sợi đôi Do ADN polymerase

I có ba hoạt tính, nhưng hoạt tính exonuclease 5’-3’ ít sử dụng nên Klenow đã dùng protease đểcắt bớt đoạn có hoạt tính đó Vì vậy, khối lượng phân tử enzyme chỉ còn lại 76.000 Da (được gọi

là đoạn lớn của ADN polymerase I)

- Ứng dụng chính:

+ Làm hóa đầu khuyết 3’ do enzyme hạn chế tạo ra

+ Đánh dấu đầu tận cùng của các đoạn ADN bằng cách dùng [32P]dNTP để làm đầy đầukhuyết 3’

+ Đánh dấu đầu tận cùng của các phân tử ADN mang đầu lồi 3’ Đầu tiên, hoạt tínhexonuclease 3’-5’ loại bỏ đầu lồi 3’ để tạo ra đầu khuyết 3’ Sau đó, nhờ sự có mặt ở nồng độ caocủa một tiền chất được đánh dấu đồng vị phóng xạ, sự thoái tiến bậc thang được cân bằng do sựhợp nhất của các dNTP ở đầu 3’

+ Tổng hợp sợi thứ hai của cADN trong tạo dòng cADN

+ Tổng hợp ADN sợi đôi từ các khuôn mẫu sợi đơn trong phát sinh đột biến in vitro.

c ADN polymerase của bacteriophage T4 (T4-infected E.coli)

Enzyme này giống đoạn Klenow của ADN polymerase I của E.coli ADN polymerase của

phage T4 (M=144.000 Da) có hoạt tính polymerase 5’-3’ và exonuclease 3’-5’ Tuy nhiên, hoạttính exonuclease của ADN polymerase phage T4 lớn hơn của ADN polymerase I đến 200 lần.Đoạn Klenow phải có đoạn mồi mới tổng hợp ADN được, còn ADN polymerase T4 thì khôngcần mồi cũng tổng hợp được ADN

- Ứng dụng chính:

+ Làm đầy hoặc đánh dấu đầu khuyết 3’ do enzyme hạn chế tạo ra

+ Đánh dấu tận cùng của các phân tử ADN mang đầu lồi 3’, tương tự như ứng dụng củađoạn Klenow.

+ Đánh dấu các đoạn ADN để làm mẫu dò

+ Biến đổi đầu so le của ADN sợi đôi thành đầu bằng

d Taq ADN polymerase

Taq ADN polymerase (Taq pol) là một loại ADN polymerase chịu nhiệt (M= 65.000 Da)

của vi khuẩn Thermus aquaticus Enzyme này được dùng để kiểm tra sự có mặt hoặc không của một gen bằng tìm cách xúc tác cho sự tổng hợp gen đó ở điều kiện in vitro nhờ phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Taq polymerase thay thế cho ADN polymerase I của E.coli do có khả năng

chịu nhiệt cao phù hợp với điều kiện phản ứng của PCR và nó có thể tổng hợp một sợi ADN dài1kb trong vòng 30 giây ở 72oC

Một trong những hạn chế của Taq pol là sự chính xác không cao trong quá trình sao chépcủa nó do bị mất cơ chế đọc sửa (hoạt tính exonuclease 3’-5’) Enzyme Taq pol thương mại có tỷsao chép lỗi 1/10.000 nucleotide và có thể tạo ra 16% sản phẩm PCR dài 1 kb bị đột biến trongphản ứng khuếch đại Mặc dù có nhược điểm trên, Taq polymerase vẫn có thể được dùng trongcác thí nghiệm đòi hỏi một trình tự di truyền chính xác (như trong tạo dòng phân tử) Tuy nhiên,kết quả cho ra một vector mang đoạn chèn (sản phẩm PCR) cần phải được kiểm tra bằng đọctrình tự

Ưu điểm của Taq polymerase là sản xuất các đoạn gen mang hai đầu lồi A Điều này đặcbiệt hữu ích trong “TA cloning” là kỹ thuật mà vector (plasmid) được sử dụng đã có sẵn hai đầulồi T bổ sung với hai đầu lồi A của sản phẩm PCR, nhờ đó đã làm tăng hiệu quả của phản ứnggắn

Ngoài Taq polymerase, nhiều ADN polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trườngvới các chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn Chẳng hạn: Pfu ADN polymerase được tách

chiết từ Pyrococcus furiosus, thường được dùng thay cho hoặc kết hợp với Taq polymerase.

Enzyme này ổn nhiệt hơn và có khả năng đọc sửa, vì thế cho tỷ lệ sao chép lỗi thấp Hoặc Tth

ADN polymerase được tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một

enzyme phiên mã ngược khi có mặt ARN khuôn mẫu và ion Mn2+ Tuy nhiên, trong trường hợp

có sự hiện diện của ADN khuôn mẫu và ion Mg2+, thì Tth polymerase lại xúc tác phản ứngkhuếch đại ADN Enzyme này cho phép khuếch đại khuôn mẫu là ARN thông qua sự hình thànhcủa cADN

e ARN polymerase (ADN-dependent ARN polymerase)

Các bacteriophage SP6, T7 và T3 sản xuất enzyme ARN polymerase để khởi đầu tổng hợpARN trên khuôn mẫu ADN sợi đôi có mang promoter đặc trưng bacteriophage Quá trình tổnghợp này không cần mồi

- Ứng dụng chính:

+ Sản xuất ARN để làm mẫu dò

+ Xác định trình tự của một phân tử ADN được tạo dòng trong một vector có mangpromoter đặc trưng cho bacteriophage SP6, T7 hoặc T3

+ Sản xuất một lượng lớn ARN từ một phân tử ADN được tạo dòng để nghiên cứu về cấutrúc, điều hòa và các mối tương tác của phiên bản ARN.

f Enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase)

Đây là enzyme tổng hợp ADN từ khuôn mẫu ARN Enzyme này có ở trong các virus:AMV (avian myeloblastosis virus), Mo-MLV (moloney murine leukemia virus) thuộc nhómvirus ngược (retrovirus: virus mang ARN) và có hoạt tính sau:

- Hoạt tính polymerase 5’-3’: Tổng hợp ADN theo chiều 5’-3’ Cơ chất của nó là ARNhay ADN (sợi đơn hoặc sợi đôi)

- Hoạt tính Rnase H: Bao gồm hai hoạt tính exoribonuclease 5’-3’ và 3’-5’ phân hủy cácADN hoặc ARN trong tổ hợp lai

Enzyme này được dùng trong kỹ thuật di truyền là nhờ vào khả năng tổng hợp đượccADN của chúng

Người ta có thể tách chiết mARN ở những tế bào tổng hợp protein mạnh, sau đó dùngenzyme phiên mã ngược để tổng hợp cADN Có thể tổng hợp nên oligonucleotide rồi dùng nó đểxác định trình tự ADN

g Teminal transferase

Hoạt tính của enzyme này là xúc tác gắn các nucleotide vào đầu 3’-OH tự do của ADN sợiđôi làm lồi ra một đầu ở cuối sợi ADN Phản ứng này là ngẫu nhiên, do đó thành phần nucleotidecủa đầu lồi phụ thuộc vào nồng độ của bốn loại nucleotide có trong phản ứng

Enzyme ligase thường dùng là của phage T4 xâm nhiễm trong E.coli Chức năng của

enzyme này là nối các đoạn hở bằng liên kết cộng hóa trị, sử dụng năng lượng ATP

a Bacteriophage T4 ADN ligase

Enzyme này là một chuỗi polypeptide (M= 68.000 Da) xúc tác cho sự tạo thành liên kếtphosphodiester giữa đầu 3’-OH tự do của một phân tử ADN này với đầu cuối 5’-PO4 của mộtphân tử ADN khác ADN ligase có tác dụng cho cả trường hợp đầu so le lẫn đầu bằng, tuy nhiênđối với đầu bằng enzyme đòi hỏi nồng độ cao hơn và điều kiện phản ứng cũng khác

b Bacteriophage T4 ARN ligase

Enzyme này xúc tác cho mối liên kết cộng hóa trị giữa nhóm 5’-PO4 của ADN sợi đơnhoặc ARN với nhóm 3’-OH của ADN sợi đơn hoặc ARN

c Bacteriophage T4 polynucleotide kigase

Enzyme này xúc tác cho mối liên kết cộng hóa trị giữa nhóm 5’-PO4 của ADN sợi đơnhoặc ARN Hai loại phản ứng thường có thể xảy ra là phản ứng thuận và phản ứng trao đổi

Trong phản ứng thuận, nhóm γ-phosphate được chuyển tói đầu 5’ của ADN đã đượcdephosphotyl hóa (mất nhóm phosphate) Trong phản ứng trao đổi, khi có một ADP thừa,enzyme sẽ chuyển nhóm 5’ phosphate từ ADN đã được phosphoryl hóa tới ADP, ADN sau đó sẽđược phosphoryl hóa trở lại bằng cách nhận một nhóm γ-phosphate đã được đánh dấu đồng vịphóng xạ từ một phân tử [γ-32P]ATP.

- Ứng dụng chính:

+ Loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi ADN hoặc ARN trước khi đánh dấu 5’ bằng 32P

+ Loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi các đoạn ADN để ngăn cản sự tự gắn Trong kỹ thuậttạo dòng, khi một vector được mở vòng ADN bằng một enzyme giới hạn rồi sau đó được loại bỏnhóm 5’ phosphate thì nó không thể tự gắn lại (tự tái tạo lại vòng) Chỉ khi có đoạn ADN ngoạilai mang các đầu 5’ phosphate cần thiết được đưa vào thì phản ứng gắn giữa vector và ADNngoại lai mới xảy ra

3.1.4 Các enzyme cắt

Là nhóm các enzyme xúc tác thủy phân liên kết phosphodiester trong phân tử ADN hoặcARN, bao gồm các endonuclease (cắt bên trong phân tử axit nucleic) và exonuclease (cắt bênngoài phân tử axit nucleic) Các enzyme giới hạn cũng là các endonuclease, nhưng chúng có tínhđặc hiệu rất cao cho từng trình tự 4 hoặc 6 nucleotide Dưới đây là các nuclease chính thườngđược sử dụng

a Deoxyribonuclease I (Dnase I)

Dnase I xúc tác thủy phân ADN sợi đơn hoặc sợi đôi ở các liên kết phosphodiester nằmbên cạnh các nucleotide pyrimidine, tạo ra các oligonucleotide và các oligonucleotide có đầu tậncùng 5’ monophosphate Khi có mặt Mg2+, Dnase I tác dụng độc lập trên mỗi sợi ADN và các vịtrí cắt được phân bố ngẫu nhiên Trong công nghệ sinh học, Dnase I thường là sản phẩm tách từtụy bò

Khi có mặt Mn2+, Dnase I sẽ cắt cả hai sợi ADN gần như ở cùng một vị trí để tạo ra cácđoạn ADN đầu bằng hoặc đầu lồi nhưng chỉ nhô ra một hoặc hai nucleotide