đề tài về “ỨNG DỤNG DI TRUYỀN học – CÔNG NGHỆ GEN

HỘI CÁC TRƯỜNG CHUYÊN KHU VỰC DUYÊN HẢI VÀ ĐỒNG BẰNG BẮC BỘ CHUYÊN ĐỀ: ỨNG DỤNG DI RUYỀN HỌC – CÔNG NGHỆ GEN MỤC LỤC A PHẦN MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Mục đích đề tài B PHẦN NỘI DUNG I Lý thuyết Các khái niệm công nghệ gen Các kĩ thuật công nghệ gen Công nghệ ADN tái tổ hợp Ứng dụng công nghệ gen với sản xuất đời sống II Câu hỏi, tập vận dụng C KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO Trang 3 4 4 15 33 35 42 43 A PHẦN MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Trong chương trình Sinh học phổ thơng, Di truyền học chuyên đề quan trọng khó Trong chuyên đề Di truyền học chia làm phần nhỏ, bao gồm: - Cơ chế di truyền biến dị - Tính quy luật tượng di truyền - Di truyền học quần thể - Ứng dụng di truyền học - Di truyền học người Trong phần Ứng dụng di truyền học phần có nhiều kiến thức mới, thực tiễn trừu tượng Kiến thức sách giáo khoa phần kiến thức bản, đơn giản, không đáp ứng đủ cho kì thi học sinh giỏi cấp, đặc biệt thi chọn HSG Quốc gia Vì vậy, để đáp ứng cho yêu cầu nâng cao, chuyên sâu giáo viên học sinh cần tham khảo thêm nhiều tài liệu khác Nhận thấy khó khăn đó, tơi tiến hành viết đề tài “ỨNG DỤNG DI TRUYỀN HỌC – CƠNG NGHỆ GEN” Mục đích đề tài: - Biên soạn hệ thống lí thuyết chuyên đề Ứng dụng di truyền học – Công nghệ gen - Biên soạn hệ thống câu hỏi vận dụng lí thuyết, tập - Cung cấp cho học sinh kiến thức chuyên sâu, nâng cao Ứng dụng di truyền học – Công nghệ gen phục vụ cho thi HSG cấp, đặc biệt kì thi chọn HSG Quốc gia - Rèn luyện tư duy, khả vận dụng kiến thức học để giải vấn đề khó đặt B PHẦN NỘI DUNG I LÝ THUYẾT CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN TRONG CƠNG NGHỆ GEN 1.1 Cơng nghệ gen Cơng nghệ gen quy trình cơng nghệ dùng để tạo tế bào sinh vật có gen bị biến đổi có thêm gen 1.2 Kĩ thuật chuyển gen Là thao tác tác động lên ADN để chuyển đoạn ADN mang một cụm gen từ tế bào loài cho sang tế bào nhận 1.3 Kĩ thuật PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng để khuếch đại một vài đoạn AND theo cấp lũy thừa, tạo hàng ngàn đến hàng triệu trình tự ADN 1.4 Kĩ thuật điện di Điện di gel (gel electrophoresis) áp dụng sinh học phân tử kĩ thuật để phân tích phân tử ADN, ARN hay protein dựa đặc điểm vật lý chúng kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích (isoelectric point) 1.5 ADN tái tổ hợp ADN tái tổ hợp (recombinant ADN) phân tử ADN tạo ống nghiệm cách kết hợp ADN từ nguồn (loài) khác nhau, theo quy trình kỹ thuật định, gọi kỹ thuật tái tổ hợp ADN Thông thường phân tử DNA tái tổ hợp bao gồm phân tử ADN có chất plasmid phage nguyên vẹn gọi vector (thể tải) đoạn ADN từ nguồn khác mang gene yếu tố điều hòa mong muốn cho xen vào; gọi ADN ngoại lai (foreign ADN) 1.6 Sinh vật chuyển gen Sinh vật biến đổi gen (Genetically Modified Organism) sinh vật mà vật liệu di truyền bị biến đổi theo ý muốn chủ quan người Ngồi có sinh vật tạo trình lan truyền gen tự nhiên Ví dụ q trình lai xa cỏ dại với trồng biến đổi gen có họ hàng tạo lồi cỏ dại mang gen biến đổi CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG CÔNG NGHỆ GEN 2.1 Tách chiết axit nucleic 2.1.1 Tách chiết ADN a Ngun tắc chung: - ADN có kích thước lớn, tan nước đệm, kết tủa trắng dung môi cồn Ở trạng thái kết tủa dễ đứt gãy, mẫu ADN thường bảo quản dạng dung dịch Nếu mẫu ADN sử dụng ngay, thường hòa tan vào nước khử ion Ngược lại, để bảo quản lâu, mẫu ADN thường bảo quản đệm TE (Tris – EDTA) nhằm tránh nhiễm nuclease - Độ mẫu ADN sau tách chiết xác định theo tỷ lệ giá trị đo huỳnh quang bước sóng A260 A280 Mẫu ADN xem đủ tỷ lệ A260/A2802,0 - ADN nhìn thấy gel điện di ánh sáng UV sau nhuộm ethidium bromide - Phương pháp tách chiết ADN gồm bước sau: + Bước 1: Phá vỡ thành tế bào biện pháp học enzyme Ở tế bào thực vật động vật, cần có bước tách tế bào khỏi mô chúng + Bước 2: Sử dụng chất tẩy rửa (SDS, sarcosyl) để phá vỡ lớp phospholipid màng tế bào màng nhân Trong số trường hợp, người ta bổ sung thêm protenase K + Bước 3: Loại bỏ thành phần không mong muốn mẫu, protein, polysaccharide Mẫu bổ sung hỗn hợp dung dịch (phenol: chloroform: isoamyl alcohol tỉ lệ (25:24:1) Sau ly tâm cao tốc hỗn hợp dung dịch chia làm pha: Pha pha nước chứa ADN, ARN; Pha pha chứa protein chất thứ cấp bị kết tủa; Pha dung dịch phenol: chloroform: isoamyl alcohol Việc loại bỏ ARN thực cách thêm ARNase vào dung dịch hỗn hợp ủ khoảng – 10 phút + Bước 4: Kết tủa ADN isopropanol (ở nhiệt độ -20 oC, khoảng 20 phút) ethanol (ở -80 C, qua đêm) để loại bỏ hoàn toàn chất khơng mong muốn hòa tan dịch mẫu Sau ly tâm, loại bỏ dung dịch lỏng chứa tạp chất, ta thu cặn ADN kết tủa o + Bước 5: Hòa tan cặn ADN nước khử ion dung dịch đệm TE b Một số trình tách chiết ADN đối tượng khác * Tách chiết ADN động vật - Có thể tách chiết ADN từ nguyên liệu khác máu, nước bọt, mơ lơng, tóc (còn ngun chân tóc, chân lông) loại mô khác - Nguyên tắc chung: + Tách tế bào có nhân khỏi mơ + Phá vỡ màng tế bào, màng nguyên sinh chất phân hủy protein, giải phóng ADN khỏi nhân + Tách ADN khỏi đệm chiết bảo quản ADN đến -20oC * Tách chiết ADN thực vật - Tế bào thực vật có vách cellulose bền vững, việc tách chiết ADN từ tế bào thực vật gặp phải khó khăn định - Nguyên tắc chung: + Nghiền mô, tế bào biện pháp học: Nghiền mô đá khô, nitơ lỏng cối, chày sứ để phá vỡ thành cellulose, giải phóng thành phần bên tế bào Trong số trường hợp, người ta dùng thêm enzyme cellulase để phân hủy thành cellulose + Sử dụng đệm có chất tẩy rửa (CATB) để phá vỡ màng tế bào, giải phóng ADN + Sử dụng hóa chất ức chế nuclease (EDTA) nhằm bảo vệ nguyên vẹn ADN trước tác động nuclease nội bào + Tách bỏ tạp chất, protein khỏi hỗn hợp nhờ li tâm phân đoạn nhờ hỗn hợp hóa chất chloroform, isoamyl alkohol, phenol… + Thu hồi ADN cách tạo kết tủa với ethanol isopropanol Sau li tâm loại bỏ dịch lỏng thu hồi cặn ADN hỗn hợp + Hòa tan ADN nước ( sử dụng sau đó) dung dịch đệm (bảo quản lâu dài) * Tách chiết ADN vi khuẩn Về nguyên tắc chung, việc tách chiết ADN từ vi khuẩn giống tách chiết ADN từ thực vật hay động vật Điều khác phải nuôi vi khuẩn để thu sinh khối tế bào phương pháp để phá vỡ màng peptidoglycan vi khuẩn Có thể sử dụng biện pháp học để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn nghiền, sóng siêu âm… Người ta enzyme lisozym để phá vỡ màng Quy trình tách chiết ADN plasmid Quy trình bao gồm bước sau: - Bước 1: Dịch nuôi cấy vi khuẩn li tâm 5000 vòng/ phút, thu cặn, loại bỏ dịch - Bước 2: Hòa tan cặn dịch thủy giải GET Sau thêm vào 1,5 thể tích Alkaline SDS (200 mM NaOH 1% SDS) ủ hỗn hợp 5p nhiệt độ thường Trung hòa hỗn hợp dung dịch dung dịch trung hòa (3 mM CH3COONa) Lắc tuýp xuất màu trắng đục, đem li tâm loại bỏ cặn - Bước 3: Làm lạnh tuýp thêm Rnase (3 ) Đảo ngược Eppendorf 2-3 lần cho trộn ủ nhiệt độ 30oC - Bước 4: Kết tủa protein hỗn hợp chloroform phenol - Bước 5: Kết tủa ADN ethanol isopropanol - Bước 6: Hòa tan ADN dung dịch đệm, kiểm tra cất giữ 2.1.2 Tách chiết ARN Các phân tử ARN không bền, dễ bị phân hủy enzyme RNase Mặt khác, RNase có mặt khắp nơi, có hoạt tính cao bền với tác nhân thường dùng để loại bỏ hoạt tính RNase (xử lí nhiệt 90 oC không làm hoạt tính RNase) Vì vậy, việc tách chiết ARN đòi hỏi nhiều biện pháp thận trọng để tránh tạp nhiễm ARNse từ môi trường Mặt khác, tách chiết ARN, để tránh lẫn lộn người ta thường loại bỏ ADN enzyme nuclease Như ta biết, 90-99% tổng số ARN tế bào rARN (80-85%) tARN (15-20%) Các ARN có kích thước trình tự xác định tách riêng dễ ràng điện di, li tâm Riêng mARN đa dạng nên để tách chiết riêng mARN, người ta tiến hành sắc ký lực cột oligo T-celulose dựa vào cấu trúc đuôi polyA mARN 2.2 Điện di Phương pháp sử dụng để phân tích định tính thu nhận mẫu axit nucleic Nguyên tắc dựa vào đặc tính cấu trúc axit nucleic Các nguyên tố phospho tạo điện tích âm tồn diện bề mặt, nên chịu tác động điện trường, phân tử axit nucleic di chuyển phía cực dương Tốc độ di chuyển phân tử axit nucleic gel phụ thuộc vào kích thước, độ đậm đặc gel đặc tính phân tử (dạng kép, dạng đơn, dạng vòng, dạng siêu xoắn…) - Điện di gel (gel electrophoresis) áp dụng sinh học phân tử kĩ thuật để phân tích phân tử ADN, ARN hay protein dựa đặc điểm vật lý chúng kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích (isoelectric point) Kĩ thuật sử dụng dung dịch đệm (buffer) để dẫn diện tạo điện trường đều, gel (thường agarose hay polyacrylamide) đóng vai trò thể để phân tách phân tử, chất nhuộm khác (ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát vị trí phân tử gel sau điện di Kĩ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo điện trường tác động vào phân tử tích điện kích thước lỗ thể (gel) Gel cấu tạo chuỗi cao phân tử (polymer) liên kết chéo với tạo thành hệ thống mạng lưới với kích thước mắc lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân tử (agarose, polyacrylamide) phản ứng tạo liên kết chéo Các phân tử phân tách di chuyển gel với vận tốc khác nhờ vào khác của: (a) lực điện trường tác động lên chúng (nếu phân tử tích điện khác nhau) (b) kích thước phân tử so với kích thước lỗ gel (c) hình dạng, độ cồng kềnh phân tử - Gel agarose: Là polysaccharide, thường chiết xuất từ rong biển đỏ định Nó polymer tuyến tính tạo thành từ đơn vị lặp lặp lại agarobiose, disaccharide tạo thành từ D -galactose 3,6-anhydro- L -galactopyranose Agarose hai thành phần thạch, tinh chế từ thạch cách loại bỏ thành phần khác agar, agaropectin Agarose có cấu trúc dạng lưới ba chiều kênh có đường kính từ 50 nm đến> 200 nm tùy thuộc vào nồng độ agarose sử dụng - nồng độ cao mang lại đường kính lỗ chân lơng trung bình thấp Cấu trúc 3-D tổ chức với liên kết hydro bị gián đoạn làm nóng trở lại trạng thái lỏng Vì có cấu trúc dạng lưới phù hợp nên agarose thường sử dụng sinh học phân tử để tách phân tử lớn, đặc biệt ADN, điện di Các gel agarose (thường 0,7 - 2%) điện di chuẩn bị dễ dàng cách đổ dung dịch ấm, lỏng vào khuôn Một loạt agaroses khác trọng lượng phân tử khác tài sản thương mại có sẵn cho mục đích Agarose hình thành thành hạt sử dụng số phương pháp sắc ký để làm protein - Gel polyacrylamide: Hydrat hóa acrylonitrile dẫn đến hình thành phân tử acrylamide (C3H5NO) nitrile hydratase Acrylamide monome trạng thái bột trước bổ sung nước Acrylamide độc hại hệ thần kinh người, tất biện pháp an toàn phải tuân theo làm việc với Acrylamide hòa tan nước bổ sung nước, polyme hóa dẫn đến hình thành polyacrylamit Nó hữu ích để làm cho gel polyacrylamide thơng qua acrylmide hydration kích thước lỗ chân lơng điều chỉnh Tăng nồng độ acrylamide dẫn đến giảm kích thước lỗ chân lơng sau trùng hợp Polyacrylamide gel có lỗ chân lông nhỏ giúp kiểm tra phân tử nhỏ tốt phân tử nhỏ vào lỗ chân lông di chuyển qua gel phân tử lớn bị mắc kẹt lỗ hở - Điện di gel agarose: Điện di gel agarose phương pháp thông thường để giải ADN phòng thí nghiệm Gel agarose có thấp suất phân giải cho ADN gel acrylamide, họ có phạm vi lớn tách, thường sử dụng cho đoạn ADN với độ dài 50-20,000 bp (cặp base), độ phân giải Mb với xung điện di gel trường (PFGE) Nó sử dụng để tách phân tử protein lớn, ma trận ưu tiên cho điện di gel hạt có bán kính hiệu lớn 5-10 nm Kích thước lỗ chân lơng gel ảnh hưởng đến kích thước ADN thun giảm Nồng độ gel thấp kích thước lỗ lớn, ADN lớn tốt Tuy nhiên, gel có nồng độ thấp (0,1 - 0,2%) mỏng manh khó xử lý, điện di phân tử ADN lớn vài ngày Giới hạn độ phân giải điện di gel agarose chuẩn khoảng 750 kb Giới hạn khắc phục PFGE, nơi mà trường điện trực giao xen kẽ áp dụng cho gel Các mảnh ADN định hướng lại thân trường ứng dụng chuyển hướng, phân tử ADN lớn nhiều thời gian để tự điều chỉnh điện trường bị thay đổi, điện trường nhỏ hơn, DNA phân chia theo kích thước Gel agarose đúc khuôn, đặt, thường chạy theo chiều ngang ngập dung dịch đệm Bộ đệm Tris-acetate-EDTA Tris-Borate-EDTA thường sử dụng, đệm khác Tris-phosphate, barbituric acid-sodium barbiturate Trisbarbiturate buffer sử dụng ứng dụng khác ADN thường hình dung cách nhuộm với ethidium bromide sau xem ánh sáng tia cực tím, phương pháp nhuộm màu khác có sẵn, chẳng hạn SYBR Green, GelRed, xanh methylen tinh thể tím Nếu đoạn ADN tách rời cần thiết cho thí nghiệm tiếp tục hạ lưu, chúng cắt từ gel lát để thao tác 2.3 Kỹ thuật PCR PCR kỹ thuật phổ biến sinh học phân tử nhằm nhân đoạn ADN ống nghiệm dựa mô máy sinh tổng hợp ADN tế bào sống 2.3.1 Nguyên lí kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR phương pháp tổng hợp ADN dựa mạch khn trình tự đích ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu nhờ hoạt động enzyme polymerase Tất ADN polymerase hoạt động tổng hợp mạch ADN từ mạch khuôn cần diện mồi chuyên biệt, liên kết bổ sung với mạch khuôn Đoạn mồi phản ứng PCR đoạn ADN ngắn có khả bắt cặp bổ sung với mạch ADN khuôn Thông thường, PCR bao gồm chuỗi khoảng 20-40 lần biến đổi nhiệt độ lặp lặp lại, gọi chu kỳ, chu kỳ thường gồm 2-3 giai đoạn nhiệt độ riêng biệt, thường ba Các chu kỳ thường bắt đầu giai đoạn nhiệt độ cao (>90°C), dừng lại sản phẩm cuối tổng hợp dừng lại nhiệt độ thấp để lưu trữ sản phẩm PCR thời ngắn Nhiệt độ thời gian thực chu kỳ phụ thuộc vào nhiều yếu tố Những yếu tố gồm enzyme tổng hợp ADN, nồng độ ion hóa trị hai, dNTPs dùng phản ứng, nhiệt độ nóng chảy (Tm) mồi - Giai đoạn khởi đầu: (Chỉ cần enzyme ADN polymerase bắt buộc phải kích hoạt nhiệt độ) Giai đoạn cần tăng nhiệt độ lên 94-96°C (hay 98°C sử dụng polymerases bền nhiệt) tiến hành 1-9 phút - Giai đoạn biến tính: bước chu kỳ trình tăng nhiệt độ lên 94-98°C 20-30 giây ADN biến tính cách phá vỡ liên kết hydro bazo, tạo thành phân tử ADN sợi đơn - Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ phản ứng giảm xuống 50-65°C 20-40 giây để mồi gắn vào sợi ADN đơn Nhiệt độ cần phải đủ thấp phép mồi bắt cặp với sợi ADN, đủ cao cho trình bắt cặp đặc hiệu, nghĩa là, mồi nên gắn hoàn toàn với phần trình tự bổ sung mạch khn Nếu nhiệt độ thấp, mồi gắn không đặc hiệu Nếu q cao, mồi khơng gắn Thơng thường nhiệt độ gắn mồi thường thấp 3-5 °C so với Tm mồi dùng phản ứng Liên kết hydro bền phân tử ADN- ADN hình thành mồi bổ sung hồn tồn với khn Polymerase liên kết với phân tử lai ADN mồi – khuôn bắt đầu tổng hợp ADN - Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ giai đoạn phụ thuộc vào ADN polymerase sử dụng; Taq polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu 75-80°C , nhiệt độ 72°C thường sử dụng với enzyme Tại giai đoạn ADN polymerase tổng hợp sợi ADN bổ sung với ADN khuôn cách thêm dNTP theo nguyên tắc bổ sung theo chiều 5′ đến 3′, phản ứng trùng ngưng xảy nhóm 5′ – phosphate dNTP với nhóm 3′ – hydroxyl phía cuối sợi ADN vừa hình thành Thời gian giai đoạn kéo dài phụ thuộc vào ADN polymerase độ dài đoạn DNA cần khuếch đại Thông thường, ADN polymerase có khả khuếch đại hàng nghìn bazo nito phút Trong điều kiện tối ưu, tức là, khơng có hạn chế giới hạn chất chất phản ứng sau giai đoạn kéo dài, số lượng ADN khuếch đại sau chu kì tuần theo hàm mũ - Giai đoạn kết thúc kéo dài: Giai đoạn thực nhiệt độ 70-74 °C (đây nhiệt độ cần thiết cho hoạt động tối ưu hầu hết enzyme polymerase dùng phản ứng PCR), với thời gian 5-15 phút sau chu kỳ PCR cuối để đảm bảo tất ADN sợi đơn lại tổng hợp hồn tồn - Giai đoạn bảo quản: Giai đoạn thực nhiệt độ 4-15°C thời gian để bảo quản ngắn hạn sản phẩm phản ứng Bảng Chu trình nhiệt phản ứng PCR Bước Nhiệt độ Thời gian 95oC - phút Biến tính 90 - 95oC 15 - 60 giây Bắt cặp mồi 40 - 70oC 15 - 60 giây 72oC phút/1 kb Biến tính khởi đầu Số chu kỳ Kéo dài Kéo dài kết thúc 72oC (60oC) - 30 phút Như vậy, theo tính tốn lý thuyết, ban đầu qua 35 chu kỳ khuếch đại PCR có 236 sao, tương đương 68 719 476 736 (7.1010), có khối lượng thực tế khoảng 1g Hình 1: Sơ đồ minh họa hình thành qua chu kỳ phản ứng PCR Trong kỹ thuật PCR, khuếch đại tối ưu đạt đượng điều kiện sợi khuôn tinh Tuy nhiên, ngày người ta tiến hành PCR với dịch chiết thô Lượng ADN mẫu cho phản ứng thường đạt ngưỡng tối thiểu 100ng Mặt khác, primer chìa khóa thành cơng hay thất bại phản ứng Vì thế, tiêu chuẩn primer cần kiểm soát chặt chẽ bước thiết kế Hiện nay, thành tựu PCR mở nhiều triển vọng cho sinh học phân tử với nhiều ứng dụng sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiểm nghiệm thực phẩm, kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh, phát pháp y, xác định huyết thống… 2.4 Đọc trình tự Hiện có phương pháp đọc trình tự phổ biến, bao gồm: 2.4.1 Phương pháp hóa học: Phương pháp Maxam-Gillbert Phương pháp dựa vào thủy giải đặc trưng phân tử ADN cần xác định trình tự phương pháp hóa học Ngun lí phương pháp sau: Trước hết phân tử ADN đánh dấu đầu P 32 S35 Sau đó, chúng chia thành năm phân đoạn, phân đoạn chịu xử lí hóa học chun biệt có khả làm biến đổi đặc trưng loại nucleotide cắt phân đoạn ADN nucleotide Năm nhóm nucleotide bị tác động là: G, A, C, G+A, T+C Bảng Các hóa chất sử dụng để biến tính nucleotide (Maxam-Gillbert) Hóa chất Dimethyl sulfate pH = Nucleotide bị tác động G Piperidine formate pH = A+G Hydrazine A+T Hydrazine + 1,5 M NaCl C A>C Nhiệt độ cao (90oC), 1,2 M NaOH Kết xử lí hóa học hình thành nên năm tập hợp oligonucleotide, oligonucleotide tập hợp có kích thước khác chấm dứt 10 plasmid tái tổ hợp mang đầy đủ hai đầu gen Ở bước này, gen nhân dòng kích hoạt PCR, người ta sử dụng phản ứng PCR với cặp mồi sử dụng - Đọc trình tự: Như nói trên, đọc trình tự kỹ thuật cho kết xác nhiều thơng tin Các plasmid tái tổ hợp chọn lọc qua hai bước mang để đọc trình tự nucleotide Việc xác định trình tự giúp nhận biết xác kích thước, trình tự xếp nucleotide gen đích 3.3 Ứng dụng plasmid tái tổ hợp 3.3.1 Công nghệ DNA tái tổ hợp với việc nghiên cứu gene Việc tách dòng tái tổ hợp cho phép nhận số lượng lớn gene vùng điều hoà để tiến hành phân tích trình tự nucleotide, xác định vùng chức chế hoạt động chúng Nhờ đưa lại hiểu biết tổ chức hoạt động gene prokaryote (như khởi điểm tái bản, vùng điều hoà phiên mã, gene … gene eukaryote (như centromere, telomere, gene phân đoạn, gene giả, DNA lặp lại … Bằng thí nghiệm tạo dòng plasmid tái tổ hợp kinh điển vi khuẩn E coli, cách cải tiến sử dụng nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo (yeast artificial chromosome = YAC; hình 10.7), người ta thành lập thư viện gene (gene library) hay thư viện gene (genomic library) để sở tiến hành lập đồ vật lý (physical map) xác định trình tự DNA gene nhiều sinh vật khác nhau, kể gene người (NHGRI 2005) Nếu vào năm 1977, F.Sanger xác định đầy đủ trình tự phage φX174 (5386 nucleotide với gene) phage G4 (5577 cặp nucleotide với 10 gene), đến người ta xác định lập đồ cho DNA có kích thước lớn nhiều; ví dụ: gene phage lambda gồm 48.502 cặp base với khoảng 61 gene (1983), nhiễm sắc thể số nấm men Saccharomyces cerevisiae gồm 370.000 cặp base (1992) v.v Đáng kể là, Dự án Bộ gene Người (Human Genome Project = HGP; hình 10.8) thức vào hoạt động từ 1990 James Watson chủ trì với cộng tác nhiều nhà khoa học giới Việc phân tích trình tự gene người hoàn thành vào 4/2003, cho thấy gene (genome) có trình tự đầy đủ gồm 3.164.700.000 cặp base, chứa đựng khoảng 25.000 gene mã hóa protein chịu trách nhiệm xây dựng nên protein (proteome) gồm khoảng 50.000 protein khác tế bào HGP thực kỳ công thám hiểm vĩ đại lịch sử; lần HGP cho phép đọc tồn thơng tin di truyền tự nhiên làm nên người (NHGRI 2005) 3.3.2 Sử dụng plasmid tái tổ hợp để sản xuất sinh khối Để sản xuất sinh khối, vector biểu mang gen ngoại lai mong muốn thực phiên mã tạo dòng dịch mã mARN chúng tế bào vật chủ Những vector dược dùng để biểu gen sinh vật nhân thực E.coli tăng hiệu suất sản phẩm gen sinh vật nhân sơ Mặc dù E coli vật chủ lý tưởng để biểu gen eukaryote chúng khơng có khả sửa đổi hậu dịch mã cho chuỗi polypeptide protein có cấu trúc phức tạp Tuy nhiên, số trường hợp người ta sử dụng vi khuẩn E coli cho protein có cấu trúc đơn giản Đối với protein có cấu trúc phức tạp, vật chủ thường sử dụng sinh vật nhân chuẩn (ví dụ: nấm men Saccharomyces cerevisiae, nấm mốc Aspergillusniger…) chúng hậu dịch mã 30 - Sản xuất protein dung hợp: Protein dung hợp mã hóa gen lai dung hợp in vitro hai đoạn gen khác Vì vậy, protein dung hợp mang trình tự axit amin hai protein khác biệt Protein dung hợp có đặc điểm sau: +Thường sản xuất với lượng lớn khởi đầu phiên mã dịch mã điều khiển trình tự tiêu chuẩn vật chủ + Có khối lượng phân tử lớn so với hầu hết protein vật chủ dễ dàng nhận biết điện di gel polyacrylamide Từ đó, băng protein dung hợp cắt khỏi gel, đơng khơ (lyophilize) sau nghiền thành bột dùng kháng nguyên + Có thể tiết môi trường nhờ biểu vật chủ gen sinh vật nhân thực gắn với trình tự mã hóa cho peptide tín hiệu (signal peptide), đó, peptide tạo chuyển dịch qua màng Tuy nhiên, tượng xảy vài trường hợp Hiện nay, dựa vào số gen thị riêng biệt, người thiết kế hệ thống vector biểu với protein dung hợp tương ứng họ pUR, pET system với protein dung hợp tương ứng LacZ,CDB, His.tag hay GTS 3.3.3 Sử dụng plasmid tái tổ hợp để chuyển gen Trong chuyển gen, người ta chuyền trực tiếp gen đích từ thể sang thể khác Q trình cần có dạng trung gian, plasmid tái tổ hợp Tùy vào đối tượng vật chủ, người ta thiết kế vector tương ứng để tạo plasmid tái tổ hợp – làm thể truyền để chuyển vào vật chủ 3.3.4 Sử dụng plasmid tái tổ hợp liệu pháp gen Liệu pháp gen phương pháp chữa bệnh cách đưa gen cần thiết (gen liệu pháp) nhằm mục đích chữa bệnh Các gen có chức sử dụng vào điều trị dùng để điều trị bệnh cho người loại gen liệu pháp có đặc điểm chức riêng Các gen liệu pháp gen nguyên vẹn để thay gen bị hỏng Gen liệu pháp gen mã hóa cho protein đặc hiệu nhằm tạo protein đặc hiệu giúp ức chế, kìm hãm gen gây bệnh hìm hãm tăng sinh nhanh tế bào, gây chết tế bào gây bệnh Ngồi ra, gen ức chế, gen hìm hãm, gen phục hồi, gen đột biến sử dụng gen liệu pháp Liệu pháp gen có hai nhóm liệu pháp gen soma liệu pháp gen tế bào mầm Các phương pháp điều trị nhằm thay tế gen bị hỏng, gen bệnh tế bào soma, giúp thể sống bình thường xem liệu pháp gen soma (somatic gene therapy) Liệu pháp gen tế bào mầm (germline gene therapy)là phương pháp điều trị, chữa, thay tế bào hỏng cho giao tử nhằm tạo hệ sau bình thường Theo quy định nhiều quốc gia điều trị liệu pháp gen cần tuân thủ số nguyên tắc sau: - Theo dõi hiểu biết cặn kẽ trình phát sinh bệnh, chế phát sinh bệnh tính di truyền bệnh - Nắm vững cấu trúc chức gen gây bệnh, gen hỏng, gen đột biến… đồng thời nắm vững cấu trúc, chức gen liệu pháp dùng thay 31 - Dự đoán hiệu liệu pháp Nếu hiệu cao áp dụng, đặc biệt liệu pháp cho tế bào mầm - Cần có thử nghiệm chặt chẽ trước tiến hành thể người Chỉ áp dụng có hiệu cao lặp lại đối tượng thử nghiệm Thách thức liệu pháp gen Nhiều nhà nghiên cứu nhận thấy ưu liệu pháp gen nỗ lực tham gia vào phát triển ứng dụng liệu pháp cho liệu trị ca bệnh di truyền dòng mầm gặp Tuy nhiên, liệu pháp gen ngành khoa học mới, thời gian phát triển ngắn Do kỹ thuật đưa gen lạ vào tế bào thể người phức tạp người chưa làm chủ hồn tồn vị trí gắn gen mới, nên gây hậu khơng mong muốn kích hoạt gen tiền ung thư, gen lão hóa, gây đột biến gen bình thường khác… thế, nhà nghiên cứu liệu pháp gen phải giải ba thách thức lớn: - Vector vận chuyển ADN: ADN phân tử lớn mang điện tích âm việc vận chuyển xuyên qua màng tế bào màng nhân tế bào động vật không dễ dàng Mặt khác, chuyển gen hiệu quả, việc xuất lượng lớn tế bào quan mục tiêu tiếp nhận gen ngoại lai Sự tiếp nhận gen vừa đủ đảm bảo cho tế bào tránh stress, gây độc tính thách thức lớn cho nhà khoa học Giải pháp tìm vector chuyển gen an toàn, đặc biệt vỏ virus bị bất hoạt gen độc để vận chuyển gen mục tiêu Các virus có ưu điểm dễ dàng xâm nhập qua hệ thống tế bào chất để vào nhân, đưa gen mục tiêu cần chuyển vào tế bào nhận - Truyền tải chức năng: Việc đưa ADN vào tế bào đích khơng có giá trị trừ đoạn ADN phiên mã thành ARN dịch mã thành protein sản phẩm mong muốn Nếu vector có nguồn gốc từ virus thiết kế để tích hợp vào nhiễm sắc thể người (nhằm tránh trường hợp đoạn ADN tồn tự do), vị trí tích hợp mang tính định Có nhiều trường hợp, đoạn ADN đưa vào thành công lại bị bất hoạt cấu trúc bên cạnh, đưa vào khơng vị trí promotor enhancer… Nhưng ADN không gắn vào nhiễm sắc thể, nồng độ ADN bị pha lỗng q trình phân bào, hiệu liệu pháp khơng có - Đáp ứng miễn dịch: Các vius coi phương tiện hiệu việc truyền tải ADN, mã hóa cho protein lạ protein hệ miễn dịch nhận diện nhanh Mặc dù có nhiều nỗ lực lớn việc cải tiến lại virus nhằm thoát khỏi nhận diện, nhiên hệ miễn dịch thường tìm quy luật tìm để phá hủy tế bào biểu gen điều trị Ngày nay, liệu pháp gen thực tế bào gốc (liệu pháp tế bào gốc), đặc biệt q trình hồn góc tế bào soma (liệu pháp iPS) phần khắc phục thách thức trình thực liệu pháp gen Triển vọng cho tương lai Hiện nay, liệu pháp gen ngày ứng dụng điều trị chữa bệnh có hiệu Tùy theo loại bệnh, nguyên nhân bệnh mức độ biểu bệnh cần sử dụng biện pháp cụ thể khác để đảm bảo hiệu liêu pháp gen Cùng với xuất tế bào gốc cảm ứng (iPS), số chiến lược liệ pháp gen nhà khoa học quan tâm là: - Thay gen 32 - Tăng cường hiệu hoạt động gen - Sửa chữa gen - Tiêu diệt tế bào đích nhờ sản phẩm đặc hiệu gen liệu pháp - Ức chế biểu gen hỏng tế bào đích ỨNG DỤNG CƠNG NGHỆ GEN VỚI SẢN XUẤT VÀ ĐỜI SỐNG 4.1 Nhận biết cá thể phân tích ADN Nền tảng phân tích ADN xác định cá thể đặc trưng trình tự xếp nucleotide chuỗi polynucleotide Các nhóm cá thể có chung nguốn gốc thường có tương đồng định trình tự xếp thành phần số lượng nucleotide tạo nên tính đa hình di truyền sinh vật Sự đa hình xem xét khía cạnh sau: - Đa hình theo trình tự: Các nucleotide xếp ngẫu nhiên cá thể khác Ví dụ: Ở cá thể thứ có trình tự: ATTGGCCCTCTTC Ở Cá thể thứ hai có trình tự: ATGGGCCTCTCC Như vậy, vị trí thứ ba vị trí thứ mười có khác biệt loại nucleotide - Đa hình chiều dài: Có đoạn lặp lại với tần số khác số nucleotide chiều dọc gen phân tử ADN Ví dụ: Ở cá thể thứ có năm đoạn lặp lại ATAT, cá thể thứ hai có ba đoạn lặp lại ATAT Những trạng thái khác biểu thành trạng thái alen locus gen Trong điện di ADN, alen thể băng điện di vị trí khác bảng gel Nếu hai alen locus có trình tự hồn tồn giống cá thể đồng hợp tử thể băng gel ngược lại Trong q trình tiến hóa sinh vật, xuất nhiều đột biến nên dẫn đến tồn nhiều trình tự tần số lặp lại khác nhau, hình thành alen khác locus Do đa dạng alen locus nên người ta phải xây dựng thang alen cho tùng locus Tahnh alen thước đo chuẩn cho trạng thái locus cần thiết để định danh cho alen Thang alen có tầm quan trọng lớn việc xác định xác kiểu gen mẫu phân tích 4.2 Cơng nghệ gen phân loại sinh vật Sự tổng hợp chuỗi polypeptide tất cá hệ thống sống thực ribosome Ribosome vi khuẩn có khối lượng khoảng chừng 2.5 triệu Dalton, có hệ số lắng 70S, protein chiếm 1/3 khối lượng, phần lại acsc rARN Tất ribosome hình thành từ hai tiểu đơn vị ribonucleoprotein có kích thước khơng Ở vi khuẩn, tiển đơn vị có hệ số lắng 50S 30S Có ba loại rARN tham gia cấu trúc tiểu đơn vị 5S,16S 23S 16S rARN E coli có chiều dài khoảng 1.54 2ribonucleotide tham gia cấu tạo tiểu đơn vị nhở ribosome Tiểu đơn vị lớn ribosome cấu tạo từ hai loại rARN 5S 23S 33 Từ năm 1967 ZuckecrkADN Pauling đưa ý kiến cho phân tử sinh học “tài liệu lịch sử tiến hóa” hay “thước đo tiến hóa” Để thước đo tiến hóa, phân tử chọn có đặc điểm sau: - Phân tử phải có mặt tất sinh vật khảo sát - Phân tử không truyền qua lại lồi - Trình tự phân tử phải có độ bảo tồn biến động thích hợp khoảng cách tiến hóa khảo sát - Phải có kích thước đủ lớn để chứa nhiều thơng tin Mặc dù, tARN phải có mặt hầu hết vi sinh vật chúng không chọn làm thước đo tiến hóa kích thước chúng nhỏ (khoảng 75 ribonucleotide) Vào năm 1977, Woese cộng xác định 16S rARN phân tử thích hợp làm thước đo tiến hóa 16S r ARN phân tử cổ, thành phần máy tổng hợp protein có từ lâu đời Hơn nữa, rARN phân tử có chức không thay đổi, phân bố hầu hết cá hệ thống sống có độ bảo tồn vừa phải, cho phép phản ánh liên quan tiến hóa loài sinh vật Ba loại rARN thành phần ribosome có số tính chất để làm thước đo tiến hóa Tuy nhiên, 5S rARNcó kích thước q nhỏ (khoảng 120 ribonucleotide), mang thơng tin q trình tiến hóa nên chọn 23S rARN phân tử lớn (khoảng 2900 ribonucleotide), có đầy đủ tính chất để làm thước đo tiến hóa Tuy nhiên kích thước 23S rARN lớn nên thao tác nghiên cứu phân tử khơng thuận lợi Vì thế, phân tử 16S rARN chọn lựa thước đo tiến hóa phổ biến hiệu Để tránh rủi ro thao tác với ARN, người ta chuyển việc so sánh 16S rARN so sánh gen mã hóa cho 16S rARN gọi gen 16S Cho đến nay, số lượng gen 16S giải trình tự lên đến khoảng 10.000 4.3 Cơng nghệ gen chẩn đốn bệnh Hiện có khoảng cách 4000 bệnh có nguồn gốc di truyền người xác định nhiều số bệnh nghiên cứu phương pháp phân tích biểu cấu trúc gen liên quan đến bệnh Một phát quan trọng sử dụng phương pháp đa hình chiều dài đaon cắt giới hạn (RFLP) giải trình tự ADN để chẩn đốn bệnh 4.4 Chẩn đốn bệnh rối loạn chuyển hóa Ngun lí phương pháp so sánh mẫu ADN thai nhi với ADN mấu bình thường phương pháp RFLP, từ phát sai khác cấu trúc phân tử mẫu phân tích Ví dụ: Để chẩn đốn bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm, người ta khơng lấy mẫu thửu trực tiếp từ máu thai nhi mà dùng RFLP để phân tích đoạn ADN tế bào dịch ối so sánh với đoạn ADN tương ứng tế bào hồng cầu bình thường, từ phát gen hỏng Phương pháp an tồn mà khơng gây hại cho thai nhi 4.4.1 Chẩn đoán ung thư Ung thư bệnh nan y gây tử vong cao Một số dạng ung thư phổ biến như: 34 - Carcinoma: Là dạng ung thư xuất phát từ tế bào phơi phơi ngồi Các loại ung thư gồm ung thư phổi, ung thư vú, ung thư thực tràng,… - Sarcoma: Là dạng ung thư xuất phát từ tế bào có nguồn gốc từ phôi Các loại ung thư ung thư sụn, ung thư mô liên kết, ung thư - Lymphoma: Là dạng ung thư nguy hiểm, thường biểu sớm, xuất phát từ tế bào máu non hệ tủy xương Các loại ung thư ung thư bạch cầu cấp tính Ngày nay, người ta phát có nhóm gen liên quan đến trình phát sinh phát triển ung thư là: - Nhóm gen gây ung thư (oncogene): Đây dạng đột biến nhóm gen proto-oncogene chịu trách nhiệm mã hóa cho yếu tố phát triển tăng trưởng tế bào Các gen có vai trò điều hòa q trình sinh trưởng biệt hóa tế bào Nếu nhóm proto-oncogene bị rối loạn, tăng sinh kiểm soát diễn - Nhóm gen ức chế oncogene: Nhóm gen có vai trò ức chế gen thuộc nhóm oncogene Một nhóm gen bị đột biến, Oncogene kierm soát thúc đẩy tăng sinh tế bào liên tục - Nhóm gen sửa chữa ADN (ADN repair gene): Chúng có vai trò sửa chwuax sai sót q trình tái ADN tế bào Hậu việc gen hoạt tính sai hỏng không sửa chữa kịp thời, làm tăng đột biến, gây rối loạn chuyển hóa phân chia tế bào 4.4.2 Chẩn đoán bệnh vi sinh vật gây nên Trong việc phát tác nhân virus, vi khuẩn, ký sinh trùng… việc sử dụng phương pháp sinh học phân tửu có nhiều thuận lợi so với phương pháp chẩn đốn thơng thường vì: - Giúp chẩn đốn nhanh, khơng cần qua cơng đoạn nuôi cấy Chẳng hạn, để phát virus HIV người ta sử dụng phương pháp PCR lai phân tử Thời gian tối đa để phát cần ngày Trong đó, để ni cấy nhằm phát tế bào cần tuần - Là biện pháp để chẩn đoán bệnh virus vi khuẩn nuôi cấy mức độ nguy hiểm điều kiện môi trường nhân tạo không cho phép - Tạo mẫu dò phân tử dễ dàng việc tạo lập mẫu dò kháng thể đơn dòng Ngồi ra, tính đặc hiệu mẫu dò phân tử mềm dẻo so vói kháng thể nên phát nhiều kiểu gen tác nhân gây bệnh II CÂU HỎI, BÀI TẬP VẬN DỤNG Câu 1: Thế enzyme giới hạn? Chúng có tính chất mà coi công cụ thiết yếu công nghệ ADN tái tổ hợp? Bằng hai ví dụ enzyme giới hạn, chứng tỏ có hai phương pháp thành lập phân tử DNA tái tổ hợp in vitro Câu 2: Có thể sử dụng chất kháng sinh để xác định xem liệu plasmid pBR322 nhận đoạn xen vị trí EcoRI hay khơng? Tại sao, không? 35 Câu 3: Giả sử bạn cắt hai ADN khác nhau, với BamHI với BglII, sau nối chúng lại với thơng qua đầu dính tương thích Một khâu nối rồi, bạn tách hai ADN lần hai enzyme giới hạn hay không? Tại sao, không? Câu 4: Giả sử bạn biến nạp ADN tái tổ hợp cho vi khuẩn nhầm lẫn, bạn đặt tế bào biến nạp mơi trường khơng có chất kháng sinh Kết mà bạn quan sát gì? Tại sao? Câu 5: Giả sử bạn chiết xuất enzyme cắt giới hạn từ lồi vi khuẩn có tên khoa học Xenobacterium giganticus Theo danh pháp học, bạn viết tên enzyme nào? Câu 6: Cho biết trình tự đoạn ADN có chứa vị trí nhận biết đối xứng xi ngược (palindromic recognition site) cho enzyme giới hạn GACGATATCAACT Hãy tìm trình tự vị trí nhận biết Câu 7: Thế phân tử ADN tái tổ hợp, vector tách dòng? Hãy nêu bước quy trình tạo dòng gene tái tổ hợp cho sơ đồ minh hoạ Câu 8: Giả sử tinh chế plasmid pBR322 phân tử ADN người có chứa gene cần nghiên cứu Hãy phân tích kỹ thuật tạo dòng gene nói E coli Câu 9: Enzyme phiên mã ngược gì? Nó tinh chế từ loại sinh vật ứng dụng vào khâu cơng nghệ ADN tái tổ hợp? Giải thích cho sơ đồ minh hoạ Câu 10: ( Đề thi HSG QG năm 2017) Ở người, đa hình đơn nuclêơtit gen X, biểu cặp nuclêôtit A-T thay G-X vị trí nuclêơtit 136 (kí hiệu SNP A136G) vùng mã hóa, xác định phương pháp nhân ADN nhờ PCR kết hợp với cắt enzim giới hạn Alen kiểu dại mang A-T vị trí 136 (kí hiệu alen A) có vị trí nhận biết enzim giới hạn (RE) vị trí nuclêơtit 136 240 vùng mã hóa Alen đột biến mang G-X vị trí 136 (kí hiệu alen G) vị trí nhận biết RE vị trí Để nhân đoạn gen PCR, người ta dùng cặp đoạn mồi dài 25 bp gồm đoạn mồi liên kết trước vùng mã hóa đoạn mồi liên kết sau vị trí nuclêơtit 550 (xem hình dưới) Alen A 25 bp 136 bp 104 bp 310 bp 25 bp 310 bp 25 bp Alen G 25 bp Chú thích: 240 bp : Vị trí cắt enzim cắt giới hạn : Cặp đoạn mồi; bp: Cặp bazơ Sản phẩm PCR sau cắt hồn tồn RE điện di gel agarơzơ để xác định kiểu gen cá thể 36 a) Hãy nêu số lượng phân đoạn ADN kích thước phân đoạn gel điện di thu (đơn vị bp) tương ứng với kiểu gen đồng hợp tử dị hợp tử alen A G b) Một nghiên cứu nhằm xác định mối liên quan SNP A136G gen X với mẫn cảm dị ứng phấn hoa cho thấy phân bố kiểu gen nhóm đối chứng nhóm nghiên cứu sau: Số lượng cá thể kiểu gen Tổng số cá thể AA AG GG Nhóm đối chứng (khơng dị ứng phấn hoa) 108 144 48 300 Nhóm nghiên cứu (dị ứng phấn hoa) 156 212 72 440 Hãy xác định tần số kiểu gen alen nhóm cá thể Có thể kết luận mối liên quan SNP A136G với mẫn cảm dị ứng phấn hoa? Giải thích Nhóm cá thể Câu 11: (Đề thi HSG QG năm 2015) Trong công nghệ tạo động vật chuyển gen, gen chuyển gắn vào vị trí (locut) nhiễm sắc thể tế bào động vật Bằng phương pháp tạo động vật có kiểu gen đồng hợp gen chuyển ? Câu 12: Trong tế bào, hầu hết plasmid tồn dạng siêu xoắn Trong đó, plasmid trở lại trạng thái tở xoắn sử dụng topoimerase IA Người ta sử dụng enzyme cắt hạn chế R để cắt tạo dạng plasmid mạch thẳng Và mạch thẳng plasmid khơng tạo vòng trở lại xử lí phosphatase (AP) (Hình 1) Trong thí nghiệm, plasmid xử lí với loại enzyme cắt hạn chế khác (R , R R ) điều kiện Sau đó, mẫu phản ứng phân tách gel agarose đồng thời với mấu khơng xử lí (P ) marker chứa đựng đoạn kích thước mạch thẳng ADN Topoimerase IA AP xử lí với R ống chứa mẫu bị lẫn (R +E R 3 +E ) gel agarose (Hình 2) a) Hãy xác định vị trí cắt hạn chế R , R R gel Giải thích b) Xác định tên E E phản ứng xử lí với R 37 Câu 13: Một nhà nghiên cứu nhận plasmid tái tổ hợp từ nhà nghiên cứu khác gửi đến Do thất lạc thông tin nên người nhận biết plasmid tái tổ hợp từ gen đích có kích thước 1500 cặp nucleotit vector có kích thước 3000 cặp nucleotit Trên vector có chứa vị trí cắt giới hạn enzym EcoRI, BamHI HindIII Để xác định vị trí nhân dòng gen đích, nhà nghiên cứu thực số phản ứng cắt thu kết sau: Enzym tham gia phản ứng EcoRI BamHI EcoRI HindIII BamHI HindIII EcoRI, BamHI HindIII Kích thước đoạn thu 2000 cặp, 1500 cặp 1000 cặp 1800 cặp, 1500 cặp 1200 cặp 3700 cặp 800 cặp 1500 cặp, 1200 cặp, 1000 cặp 800 cặp Hãy xác định đồ cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp Câu 14: Dưới gel điện di mẫu ADN (ở hai locut thuộc nhiễm sắc thể khác nhau) người con, người mẹ bốn người đàn ông nghi cha đứa bé (được kí hiệu A, B, C D) 1) Giả sử locut kí hiệu M có tối đa alen; locut kí hiệu N có tối đa alen Dựa vào điện di này, xác định số alen locut kiểu gen người locut nói 2) Dựa vào hai locut gen trên, cho biết người cha đứa bé? Giải thích 3) Giả sử quần thể người cân di truyền, alen locut nói có tần số nhau, việc xác định quan hệ bố dựa vào hai locut nói trên, xác suất để người đàn ơng thuộc quần thể khẳng định cha đứa bé nói bao nhiêu? Câu 15: Một nhà nghiên cứu yêu cầu đánh giá độ tinh enzim cắt giới hạn từ công ty khác (Công ty Antigen, Công ty Genomics, Công ty Expression) Các yếu tố nhiễm bẩn enzim EcoRI bao gồm exonuclease phosphatase Exonuclease cắt đoạn đầu dính từ 38 sản phẩm cắt giới hạn để tạo đầu bằng, enzim phosphatase loại bỏ nhóm phosphate đầu 5’của sản phẩm cắt giới hạn Sự đánh giá thực theo bước sau: Bước 1: Plasmid X chứa vị trí cắt EcoRI ủ với EcoRI từ công ty để tạo đầu cắt: 5’-G 5’-AATTC-3’ 3’-CTTAA-5’ G’5’ Bước 2: Plasmid X từ bước nối lại ADN ligase Bước 3: Plasmid X nối lại cắt thêm lần EcoRI công ty Nhà nghiên cứu chăc schawns phản ứng thực tốt khơng có phản ứng cắt khác Kết thu bước kiểm tra điện di Hình ảnh điện di hình Hãy phân tích kết thu Câu 16: Một nhà nghiên cứu nhân dòng trình tự mã hóa (coding sequence –CDS) gen vào vector đặt tên plasmid tạo thành pHB2017 CDS chèn vị trí nhận biết SacII nằm vùng MSC (multi cloning site) vùng gen lacZ vector (Hình dưới) CDS chèn có vị trí cắt giới hạn PstI cách ba kết thúc 0.8kb Để xác định kích thước hướng CDS chèn, nhà nghiên cứu cắt plasmid với enzym cắt giới hạn khác sản phẩm cắt trình bày hình 39 Nếu plassmid pHB2017 cắt hai enzym EcoRI SpeI đệm Tango (EcoRI SpeI cắt mức tương ứng 100% 20%) thu đoạn cắt gel điện di? (Giả sử không quan sát đoạn nhỏ 50bp) Câu 17: TP53 gen ức chế ung thư nằm vị trí p13.3 nhiễm sắc thể số 17, mã hóa protein p53 - protein nhóm điều hòa chu kỳ tế bào Các nghiên cứu gần cho thấy số SNPs gen TP53 có liên quan đến bệnh ung thư Một SNP biết đến nhiều Arg72Pro, SNP vị trí codon 72 exon gen TP53 Sự thay trình tự nucleotit codon 72 dẫn đến thay ba CGC (mã hóa cho arginin) thành CCC (mã hóa cho prolin) Để đánh giá liên quan SNP Arg72Pro với bệnh ung thư tế bào gan nguyên phát, người ta tiến hành khảo sát SNP 40 nhóm bệnh nhân Kết điện di sản phẩm cắt enzym BstUI (CG CG)như hình Hãy xác định kiểu gen mẫu nghiên cứu Câu 18: Ở người, đa hình đơn nucleotit gen X biểu cặp nucleotit A - T thay G - X vị trí nucleotit 136 (ký hiệu SNP A136G) vùng mã hóa, xác định phương pháp nhân ADN nhờ PCR kết hợp với cắt enzym giới hạn Alen kiểu dại mang A - T vị trí 136 (kí hiệu alen A) có hai vị trí nhận biết enzym giới hạn vị trí nucleotit 136 240 vùng mã hóa Alen đột biến mang G - X vị trí 136 (kí hiệu alen G) vị trí nhận biết enzym giới hạn vị trí Để nhân đoạn gen PCR, người ta dùng cặp đoạn mồi dài 25bp gồm đoạn mồi liên kết trước vùng mã hóa đoạn mồi liên kết sau vị trí nucleotit 550 (hình dưới) Sản phẩm PCR sau cắt hoàn toàn enzym giới hạn điện di gel agarose để xác định kiểu gen cá thể Hãy cho biết số lượng phân đoạn ADN kích thước phân đoạn thu gel điện di (đơn vị bp) tương ứng với kiểu gen đồng hợp tử dị hợp tử alen A G Câu 19: Để đánh giá hiệu chuyển gen thực vật thông qua số gen chuyển (gen đích), người ta thường sử dụng kỹ thuật lai ADN (lai Southern) Trong kỹ thuật này, người ta sử dụng enzym cắt giới hạn co vị trí nhận biết khơng nằm gen đích (hay vùng thiết kế mấu dò) để xử lí ADN tổng số dòng chuyển gen Hình mô kết lai Southern mẫu nghiên cứu Trong đó, giếng M mẫu ADN chuẩn (marker); P (positive control) mẫu đối chứng dương (vector mang gen đích chưa bị cắt); giếng từ đến 16 sản phẩm cắt mẫu ADN tổng số enzym cắt giới hạn 16 dòng chuyển gen Từ kết thu hình sau, xác định dòng dòng chuyển gen mong muốn? Giải thích 41 C PHẦN KẾT LUẬN Qua việc viết chuyên đề Ứng dụng di truyền học – Công nghệ gen sử dụng giảng dạy đội tuyển, nhận thấy: + Đa số em hiểu bài, tiếp thu tốt nội dung chuyên đề + Kiến thức Di truyền học phức tạp em hiểu sâu, nắm kiến thức, vận dụng linh hoạt câu hỏi vận dụng, giải thích tốt nhiều vấn đề có tính thực tiễn cao + Các em liên hệ phần kiến thức có liên quan giải câu hỏi vận dụng tổng hợp + Giúp học sinh hình thành kĩ đọc khai thác hình, sơ đồ + Giúp em hiểu làm tốt thực hành Di truyền học + Các em hứng thú học, tích cực chủ động trình học để lĩnh hội kiến thức + Nội dung chuyên đề sử dụng tốt công tác bồi dưỡng học sinh giỏi cấp 42 Trong trình xây dựng nội dung chuyên đề khó tránh khỏi thiếu sót Tơi mong nhận quan tâm, đóng góp ý kiến bạn đồng nghiệp để chuyên đề ngày hồn thiện Tơi xin trân trọng cảm ơn! TÀI LIỆU THAM KHẢO Sách giáo khoa Sinh học 12 NXB Giáo dục, 2011 Sách giáo khoa Sinh học 12 nâng cao NXB Giáo dục, 2011 Phạm Văn Lập (chủ biên) Tài liệu giáo khoa chuyên Sinh học phổ thông – Di truyền tiến hóa NXB Giáo dục Việt Nam, 2009 Phạm Văn Lập (chủ biên) Tài liệu giáo khoa chuyên Sinh học phổ thông – Bài tập Di truyền tiến hóa NXB Giáo dục Việt Nam, 2009 Vũ Đức Lưu (chủ biên) Bồi dưỡng học sinh giỏi Sinh học trung học phổ thông – Di truyền tiến hóa NXB Giáo dục Việt Nam, 2011 Vũ Đức Lưu (chủ biên) Bồi dưỡng học sinh giỏi Sinh học trung học phổ thông – Bài tập Di truyền tiến hóa NXB Giáo dục Việt Nam, 2011 Hồng Vĩnh Phú (chủ biên) Giáo trình Cơng nghệ sinh học NXB Đại học Vinh, 2016 43 Đỗ Lê Thăng (chủ biên) Giáo trình Di truyền học NXB Giáo dục Việt Nam, 2011 Đinh Đoàn Long (chủ biên) Cơ sở di truyền học phân tử tế bào NXB Đại học quốc gia Hà Nội, 2008 10 N.A Campbell, J.B Reece, L.A Urry, M.L Cain, S.A Wasseman, P.V Minorsky R.B Jackson Sinh học Campbell (Biology) NXB Giáo dục Việt Nam, 2011 11 Một số địa Website: thuviensinhhoc.com baigiang.violet.vn 44 ... chuyên đề Ứng dụng di truyền học – Công nghệ gen - Biên soạn hệ thống câu hỏi vận dụng lí thuyết, tập - Cung cấp cho học sinh kiến thức chuyên sâu, nâng cao Ứng dụng di truyền học – Công nghệ gen. .. đề Di truyền học chia làm phần nhỏ, bao gồm: - Cơ chế di truyền biến dị - Tính quy luật tượng di truyền - Di truyền học quần thể - Ứng dụng di truyền học - Di truyền học người Trong phần Ứng dụng. .. PHẦN MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Mục đích đề tài B PHẦN NỘI DUNG I Lý thuyết Các khái niệm công nghệ gen Các kĩ thuật công nghệ gen Công nghệ ADN tái tổ hợp Ứng dụng công nghệ gen với sản xuất đời