chuyên đề “hệ thống lí thuyết và câu hỏi vận dụng chuyên đề ứng dụng di truyền học

Số lượng chu kỳ cho một phản ứng PCR thông thường trong khoảng từ 30 đến 40 chu kỳ.Bởi vì phản ứng diễn biến theo hai giai đoạn: Ở giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theocấp số nhân,

HỘI THẢO CHUYÊN ĐỀ KHOA HỌC VÙNG DUYÊN HẢI VÀ ĐỒNG BẰNG BẮC BỘ NĂM 2019

HỆ THỐNG LÍ THUYẾT VÀ CÂU HỎI VẬN DỤNG CHUYÊN ĐỀ ỨNG DỤNG DI TRUYỀN HỌC

Năm học 2019- 2020

MỤC LỤC

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

PHẦN 2 NỘI DUNG 2

A Hệ thống lí thuyết về chuyên đề Ứng dụng di truyền học 2

I MỘT SỐ KĨ THUẬT DI TRUYỀN 2

1 Tách chiết và định lượng acid nucleic 2

1.1 Tách chiết acid nucleic 2

1.2 Định lượng acid nucleic 7

2 Điện di 8

2.1 Nguyên tắc điện di 8

2.2 Điện di agarose 9

2.3 Điện di polyacrylamide 11

3 Thu hồi đoạn DNA từ gel điện di 14

3.1 Phương pháp sử dụng giấy DEAE (DE 81) 14

3.2 Phương pháp thu hồi bằng điện di 15

3.3 Phương pháp chiết xuất DNA từ gel nghiền (từ gel polyacrylamide) 15

3.4 Thu hồi từ gel agarose tan chảy nhiệt độ thấp 15

4 PCR (polymerase chain reaction) 16

4.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR 16

4.2 Các bước tiến hành thí nghiệm 16

4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 17

4.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp PCR 19

4.5 Ứng dụng PCR 19

4.6 Nguyên lý cơ bản của phản ứng RT-PCR (PCR ngược) 20

5 Lai phân tử 20

5.1 Cơ sở của lai phân tử 20

5.2 Các phương pháp lai phân tử 22

5.3 Ứng dụng của phương pháp lai phân tử 30

6 Giải trình tự nucleotide 31

6.1 Phương pháp hoá học của Maxam và Gilber 31

6.2 Phương pháp enzyme của Sanger 33

6.3 Giải trình tự bằng máy giải tự động 35

6.4 Ứng dụng 36

II ỨNG DỤNG TRONG CHỌN TẠO GIỐNG 37

1 Các nguồn vật liệu 37

1.1 Bộ sưu tập giống 37

1.2 Lai tạo giống 37

1.3 Đột biến nhân tạo 37

1.4 Bảo tồn sự đa dạng của nguồn gen thiên nhiên 37

1.5 Nguồn gen và kĩ thuật di truyền 38

2 Các phương pháp chọn giống 38

2.1 Các phương pháp đánh giá sự di truyền số lượng 38

2.2 Hệ số di truyền 39

2.3 Các phương pháp chọn lọc 39

2.4 Các phương pháp giao phối 40

3 Chọn giống vi sinh vật 40

3.1 Chọn giống đột biến 40

3.2 Tạo các giống vi sinh vật nhờ kĩ thuật di truyền 40

4 Chọn giống thực vật 40

4.1 Chọn và tạo giống theo phương pháp cổ điển – phương pháp lai cổ điển……… 41

4.2 Chọn giống tế bào thực vật in vitro 41

4.3 Chọn giống cây trồng bằng chỉ thị phân tử (Marker assisted selection) 43

4.4 Các phương pháp chuyển gen ở thực vật 49

4.5 ARN can thiệp (iARN - RNA interference) 63

5 Chọn giống ở động vật 67

5.1 Các phương pháp chuyển gen 67

5.2 Các tính trạng được chuyển gen 67

5.3 Thay gen đúng mục tiêu 67

5.4 Tạo giống từ phôi 68

III DI TRUYỀN HỌC NGƯỜI 69

1 Các đặc điểm và phương pháp nghiên cứu 69

1.1 Con người là đối tượng của di truyền học 69

1.2 Phương pháp phân tích phả hệ 70

1.3 Phương pháp nghiên cứu trẻ đồng sinh 70

1.4 Phương pháp quần thể 71

2 Phân tích bộ gen người 71

2.1 Bản đồ liên kết gen 71

2.2 Các phương pháp xây dựng bản đồ vật lý của bộ gen người 73

2.3 Xây dựng bản đồ vật lý bộ gen người 73

2.4 Chương trình xác định nucleotide bộ gen người 73

2.5 Phân tích chức năng của bộ gen 74

3 Di truyền y học 74

3.1 Chẩn đoán mầm bệnh 74

3.2 Sản xuất vaccine tái tổ hợp 76

3.3 Sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học 76

3.4 Liệu pháp gen 76

3.5 Ứng dụng sinh học phân tử trong giám định 77

3.6 Một số ứng dụng điển hình 77

4 Một số vấn đề xã hội của di truyền học 83

4.1 Di truyền trí năng 83

a Chỉ số thông minh IQ 83

4.2 Ưu sinh học 83

4.3 Đạo lí sinh học 84

4.4 Kĩ thuật di truyền có đáng sợ không? 84

B Các dạng câu hỏi vận dụng chuyên sâu 85

PHẦN 3 KẾT LUẬN 96

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

Di truyền học ra đời năm 1900, là ngành khoa học tự nhiên nghiên cứu thế giới sinhvật, nó có vị trí và vai trò đặc biệt đối với con người Mendel là người đặt nền móng đầu tiêncho di truyền học Suốt thế kỉ 20, di truyền học đã phát triển nhanh như vũ bão, sự hiểu biếtsâu sắc về bản chất của tính di truyền đã có vai trò cách mạng hóa đối với sinh học Nếu thế

kỉ 21 là thế kỉ của sinh học thì di truyền học là một trọng tâm của sự phát triển đó Di truyềnhọc ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp, y học Với những ứngdụng cụ thể như chọn, tạo giống vật nuôi và cây trồng, chuẩn đoán sớm bệnh tật di truyền ởngười và có khả năng chữa bệnh, dùng trong điều tra tội phạm …

Trong thực tế, di truyền học, đã và đang được đẩy mạnh nghiên cứu mạnh mẽ, càngđào sâu tìm hiểu chúng ta càng thấy được sự logic, chặt chẽ và vô tận của nó Các đề thi họcsinh giỏi Quốc tế, học sinh giỏi Quốc gia trong nhiều năm gần đây đều khai thác triệt để cácvấn đề xoay quanh lĩnh vực di truyền học Trong biển kiến thức dường như “vô tận” của lĩnhvực này, những vấn đề về chuyên đề ứng dụng di truyền học đang rất được các nhà khoa họcquan tâm Vì vậy, nhằm biên soạn một bộ tài liệu với hệ thống lí thuyết tổng thể và nhữngdạng câu hỏi vận dụng chuyên sâu phục vụ cho việc giảng dạy của các thầy cô và việc ônluyện của các em học sinh giỏi, tôi chọn chuyên đề: “Hệ thống lí thuyết và câu hỏi vận dụngchuyên đề Ứng dụng di truyền học”

Cấu trúc chuyên đề gồm 3 phần:

Phần 1: Mở đầu

Phần 2: Nội dung

1 Hệ thống lí thuyết về chuyên đề Ứng dụng di truyền học.

2 Các dạng câu hỏi vận dụng chuyên sâu.

Phần 3: Kết luận

PHẦN 2 NỘI DUNG

A Hệ thống lí thuyết về chuyên đề Ứng dụng di truyền học

I MỘT SỐ KĨ THUẬT DI TRUYỀN

1 Tách chiết và định lượng acid nucleic

I.1 Tách chiết acid nucleic

a Phương pháp tách chiết DNA

Yêu cầu:

- Có được đủ một lượng axit nucleic mong muốn, còn nguyên vẹn

- Không bị phân huỷ, bị gãy bởi tác động cơ giới, hoặc bị phân giải bởi một số

enzyme nội, ngoại bào và hoá chất

- Không hoặc ít lẫn tạp protein, RNA và một số đại phân tử khác như lipid,

gluxit và các xác tế bào khác

Nguyên lý:

- Vận dụng tính kị nước của phenol để kết tủa protein => loại bỏ protein

- Sử dụng hỗn hợp phenol:phenol-chloroform và chloroform để loại bỏ hoàn

toàn protein và lipit

Trong cả bước trên, DNA vẫn tan trong nước

- Kết tủa DNA trong Ethanol 70o để tinh sạch hoàn toàn

Các bước cơ bản:

1 Thu mẫu, phá vỡ tế bào, nhân => giải phóng các thành phần bên trong

Phá vỡ màng tế bào và màng nhân Ở tế bào động vật hoặc thực vật, bằng cáchnghiền tế bào hoặc mô trong nitơ lỏng – 1960C hoặc dùng hỗn hợp chất tẩy (SDS,Sarcosyl) và proteinase K

Hình 1 Nghiền tế bào bằng cối chày sứ

2 Hòa tan DNA và loại bỏ các thành phần không mong muốn như các protein,polysaccharide

Mẫu được bổ sung hỗn hợp dung dịch (phenol: chloroform: isoamine tỉ lệ

25:24:1), lắc mạnh cho đến khi dung dịch có dạng trắng sữa

Protein sẽ bị biến tính và kết tủa

DNA, RNA được hoà tan trong nước

Sau ly tâm cao tốc hỗn hợp dung dịch chia làm 3 pha:

+ Pha trên cùng là pha nước chứa DNA, RNA

+ Pha giữa là pha chứa protein và các chất thứ cấp bị kết tủa

+ Phá dưới là dung dịch phenol: chloroform: isoamine

Hình 2 Li tâm mẫu

3 Kết tủa DNA

+ Tủa bằng ethanol tuyệt đối (tỉ lệ 2:1), tủa tốt nhất ở - 20oC trong 30 phút hoặc ở

0oC qua đêm Hầu như toàn bộ các phân tử axít nucleic đều kết tủa

+ Tủa bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1) ở 0oC, các phân tử DNA có trọng lượng phân tửthấp không bị kết tủa

Sau đó ly tâm ta sẽ thu được cặn (DNA, RNA), cặn được rửa bằng cồn 70% để loạibỏ muối và isopropanol còn lại

4 Hòa tan DNA, loại bỏ ARN

Hoà tan cặn (DNA, RNA) và xử lý loại bỏ RNA bằng enzyme Rnase Sau đó kếttủa lại được DNA

Tách chiết DNA động vật

1

Chuẩn bị tế bào: Cắt càng nhanh càng tốt lấy mẫu mô động vật bỏ vào ống

nghiệm, đặt ngay vào nitơ lỏng Trường hợp nếu lấy mô gan thì phải bỏ mật ra vì mật chứa nhiều enzym phân rã DNA

2

Lấy từ 200 mg đến 1 g mô, nghiền trong cối và chày đã được làm lạnh trước trong nitơ lỏng

3

Hòa tan cứ 100 mg mô nghiền thành bột trên với 1,2 ml dung dịch phân giải Vừa

ủ mẫu và vừa lắc nhẹ ở nhiệt độ 500C từ 12 – 18h, nhớ đậy chặt ống nghiệm, bước này nhằm phá hủy và phân rã màng tế bào

Tinh lọc DNA, chuyển lớp dung dịch phía trên (chứa DNA) sang ống nghiệm mới, rồi thêm dung dịch 7,5 M amonium acetate với lượng bằng 1/2 dung tích mẫu và 2 lần thể tích ban đầu 100% ethanol=> DNA sẽ kết tủa

77

Thu nhận DNA kết tủa bằng cách quay ly tâm với tốc độ 1700 x g trong 2 phút Khâu này nếu nồng độ muối trong mẫu cao sẽ làm giảm lượng RNA trong dung dịch DNA

88

Rửa pellet bằng cồn 70%, để bay hơi làm khô ethanol cần đặt ống nghiệm trong bình hút chân không hoặc úp ngược ống nghiệm để khô tự nhiên trong phòng

Tinh sạch DNA

Hòa tan pellet với 9 ml dung dịch TE, ủ 550C, + 9,7g CsCl đặc rồi trộn nhẹ

Ủ mẫu trong đá 30 phút, ly tâm 10 phút 8000rpm ở 40C => thu lấy dịch phía trên + 0,5ml dung dịch 10mg/ml ethidium bromide vào rồi ủ trong đá 30 phút

Ly tâm 8000 x g ở 40C trong 10 phút

Chuyển dung dịch phía trên sang 2 ống nghiệm dung tích 5 ml có thể ly tâm vàbịt miệng được

Ly tâm 4 tiếng 80.000 x g ở 20 0C hoặc ly tâm qua đêm với tốc độ 60.000 x g ở

20 0C

Thu nhận băng DNA

Loại bỏ ethidium bromide bằng cách chiết tách lặp lại mẫu DNA thu được vớiisopropanol

Thêm 2 thể tích nước và 6 thể tích ethanol vào dung dịch chứa DNA, trộn đềurồi ủ 1h ở nhiệt độ – 200C

Làm khô pellet, hoà tan trong TE

b Phương pháp tách chiết RNA

Tách chiết RNA tổng số và mRNA

- Chú ý:

+ Phân tử RNA không bền, dễ bị phân huỷ bởi enzyme Rnase.

+ Rnase lại có mặt khắp nơi (ở đầu ngón tay, trong nước bọt, trong không

khí…)

+ Rnase là một enzyme có hoạt tính cao, bền nhiệt

Do đó: Thao tác tách chiết RNA tốt nhất là ở điều kiện vô trùng, tránh tiếp xúc bằng tay trần

Phương pháp tách chiết RNA toàn phần cũng tương tự DNA Chỉ khác là ở bướccuối cùng dùng enzyme Dnase loại bỏ DNA

• Tách chiết mRNA

- Dựa vào phân tử mRNA có đuôi poly A

- Do đó sau khi tách chiết được RNA toàn phần, cho qua cột sắc ký ái lực

(oligod T-cellulose hoặc các viên bi từ gắn đoạn oligod T)

- mRNA có đuôi poly A sẽ liên kết bổ sung với đoạn oligod T.

- Dùng dung dịch rửa cột, các rRNA, tRNA sẽ bị rửa trôi chỉ còn mRNA được

Sắc ký ái lực: trên poly U-Sepharose hay oligoT-xenlulose, dùng để tinh sạchmARN

Sắc ký lọc gel dùng trong phân tách các acid nucleic và các nucleotit tự do trongquá trình tạo mẫu dò đánh dấu

Sắc ký trao đổi ion trên vi cột để thu hồi những lượng DNA rất nhỏ

Sắc ký lỏng hiệu suất cao: Có độ phân giải rất cao, dùng trong tinh sạch cácoligonucleotit tổng hợp, plasmit, các phân đoạn DNA

I.2 Định lượng acid nucleic

Trong các thí nghiệm DNA tái tổ hợp thường cần phải biết liều lượng DNA hoặc RNAtham gia phản ứng Định lượng DNA và RNA có thể dựa vào nguyên lý hóa học và vật lý.Tuy nhiên trong các thí nghiệm công nghệ DNA thì có thể sử dụng nucleic acid đã được tinhchế vừa phải, nghiêm ngặt định lượng là không hoàn toàn cần thiết (sai mấy % không thànhvấn đề) và yêu cầu phương pháp trắc định càng đơn giản và càng nhanh càng tốt Dưới đâytrình bày ba phương pháp định lượng nucleic acid thường áp dụng với mục đích nêu trên

a Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế

Đây là phương pháp lợi dụng tính hấp phụ tử ngoại của nucleic acid và làphương pháp định lượng nhanh DNA và RNA Nucleic acid chứa các loại base (A,

T, G, C, U) có độ hấp phụ cực đại bức xạ có bước sóng gần 260 nm Các base khácnhau có bước sóng bức xạ hấp thụ cực đại cũng như hệ số hấp thụ quang khác nhau,thậm chí cùng loại base nhưng với pH khác nhau cũng có hệ số hấp thụ khác nhau.Tuy nhiên, bình quân phân tử DNA hai sợi có hệ số hấp thụ A260 = ~20 có nồng độ

1 mg/ml còn dung dịch có A260 = 1 có nồng độ 50 µg/ml, với RNA cũng như DNAmột sợi thì A260 = ~33 có nồng độ 1 mg/ml còn dung dịch có A260 = 1 có nồng độ

40 µg/ml Máy trắc định DNA/RNA có thể được kết nối máy in để ghi lại kết quảđo

Với phương pháp này có thể định lượng chính xác DNA tinh chế, nhưng do cácđường và protein cũng hấp thụ UV nên với DNA chiết xuất từ động vật cũng như từ

vi khuẩn có thể xác định sai nồng độ Ngoài ra, các hợp chất dùng tinh chế DNA(như phenol, mercaptoethanol, EDTA ) cũng hấp thụ UV nên cần chú ý khi địnhlượng DNA bằng phương pháp này Đặc biệt phenol có độ hấp thụ UV cao và cũngtan trong nước nên sau khi chiết xuất DNA bằng phenol và kết tủa bằng ethanol rồihòa tan trong nước thì khả năng phenol hấp thụ UV là rất cao Vì vậy, chú ý xử lýchloroform sau xử lý phenol

b Phương pháp định lượng bằng điện di

Trong nhiều trường hợp trắc định DNA bằng UV vẫn để lại nỗi lo cho nhà nghiên cứu,khi đó cần điện di một lượng mẫu trong gel agarose hoặc gel polyacrylamide chứa ethidiumbromide và quan sát băng DNA dưới UV Nếu điện di đồng thời với DNA đã biết nồng độđược pha loãng dần thì có thể xác định được nồng độ DNA cần nghiên cứu Phương phápnày không chỉ giúp định lượng DNA hay RNA mà còn biết trong DNA có chứa nhiều RNAhay không cũng như các nucleic acid cần nghiên cứu có bị phân giải hay không, làm yên tâmtrong quá trình nghiên cứu

c Phương pháp nhỏ giọt định lượng acid nucleic

Trong nhiều trường hợp việc định lượng nucleic acid được thực hiện bằng cácphương pháp trên nhưng khi đó phải có nhiều DNA và phải cô đặc lại hoặc khả năng tạpnhiễm nuclease là rất cao

Trong trường hợp tinh chế poly(A)-RNA, lượng nucleic acid có được thường rất ít(dưới 1 µg) nên thực hiện định lượng theo các phương pháp trên thường gặp nhiều trở ngại

và hao tổn vật liệu Khi đó có thể dùng phương pháp nhỏ giọt để định lượng nucleic acid.Với phương pháp này có thể nhận ra lượng nucleic acid khoảng 1 ng Lấy các dung dịchchứa 0,1 - 5 ng nucleic acid có thêm 1 µg/ml ethidium bromide làm dung dịch nucleic acidchuẩn được nhỏ lên tờ giấy bóng mỏng (Saran wrap) đặt trên máy chiếu xạ UV thành nhiềuđiểm mỗi điểm 3 µl Lại nhỏ 3 µl dung dịch nguyên liệu nghiên cứu có chứa ethidiumbromide tương tự bên cạnh dãy nucleic acid chuẩn nêu trên Bật đèn tử ngoại để đối chiếunồng độ nucleic acid mẫu với nucleic acid chuẩn mà xác định nồng độ mẫu Sau đó, có thểdùng pipet để hút thu hồi mẫu

2 Điện di

2.1 Nguyên tắc điện di

Phương pháp điện di trong gel (keo) thường được sử dụng để phân li (phânđoạn) DNA, RNA, oligonucleotide, protein sau đó có thể dùng để giám biệt (đồngđịnh) và tinh chế các chất đó Việc phân li các chất dựa trên độ lớn, điện tích cũngnhư hình thái của các chất Thông thường sử dụng gel agarose và gelpolyacrylamide nhưng gel agarose cho phép phân li nucleic acid lớn hơn 1 kb, còngel polyacrylamide thường dùng để phân li các đoạn nucleic acid nhỏ hơn 1 kb Nguyên lý của việc điện di DNA là khi ở trong điện trường, do tích điện âm nêncác phân tử DNA dịch chuyển về phía anode và với tốc độ dịch chuyển của chúngkhác nhau phụ thuộc vào khối lượng phân tử Các đoạn DNA càng lớn thì dịchchuyển càng chậm Kết quả là từ một điểm chung (lỗ hay "giếng" tải mẫu) các đoạnDNA khác nhau dịch chuyển về một hướng tạo thành một làn (lane), và trên làn đó

có các đoạn DNA khác nhau phân bố ở các vị trí (các băng - band) khác nhau tươngứng với độ lớn của chúng

Trong khi đó, các phân tử protein do tích điện bề mặt khác nhau nếu điện ditrong gel không gây biến tính thì dịch chuyển theo các hướng khác nhau với tốc độkhác nhau phụ thuộc cả khối lượng phân tử lẫn điện tích bề mặt, nhưng nếu điện ditrong gel sau khi xử lý bằng SDS thì do bề mặt protein trở nên tích điện âm đồngnhất nên chúng dịch chuyển về anode với tốc độ khác nhau hầu như chỉ phụ thuộckhối lượng phân tử

2.2 Điện di agarose

- Chế tác gel agarose

Dưới đây giới thiệu phương pháp chế gel agarose điện di DNA

1 Cho đủ lượng agarose (Seakem Agarose, Nusieve Agarose ) cần pha vào dung dịchTAE 1× trong một bình tam giác theo bảng dưới đây để có độ phân li nucleic acid thích hợp

Để có dung dịch TAE 1× cần cho thêm 19 lần nước khử ion vào dung dịch gốc TAE 20×

Nồng độ agarose (%) Độ lớn DNA phân ly

(kb)

2 Gia nhiệt bằng cách hấp 5 phút trong nồi hấp cao áp ở 115 °C hoặc bằng vi sóng Chú

ý khi dùng lò vi sóng cần quan sát để tránh trào gel ra ngoài, nên chờ đến khi gel sôi thì cắtđiện, lấy ra (coi chừng bỏng) lắc đều rồi cho vào làm sôi lần nữa Lặp lại ba lần cho agarosetan hoàn toàn

3 Cho vào chậu bảo ôn ~50 °C cho đến khi dịch gel đạt đến khoảng 50 - 60 °C (taychạm vào được) thì cho vào gel một lượng dung dịch ethidium bromide để có hàm lượngcuối cùng của chất màu này là 50 μg/ml (Nếu không cho ethidium bromide vào gel lỏngg/ml (Nếu không cho ethidium bromide vào gel lỏngtrước khi rót gel vào khuôn thì ngâm bản gel vào dung dịch này sau khi đã điện di)

Chú ý: Ethidium bromide là chất độc gây ung thư, vì vậy cần tránh tiếp xúc trực tiếp vào cơ

thể và phải có nơi đựng chất thải riêng sau khi sử dụng, không được thải ra ngoài môi trườngkhi chưa được xử lý thích hợp

4 Rót gel vào khuôn đã được chắn hai đầu bằng băng dán hoặc bằng kẹp, đã cài sẵnlược (comb) và đặt trên mặt phẳng (xác định bằng thủy bình kế, tức ligô)

5 Chờ cho đến khi gel rắn hoàn toàn thì cẩn thận tháo lược ra khỏi gel

- Điện di agarose

1 Tháo bản gel ra khỏi kẹp hoặc băng chắn, đặt khuôn gel trong chậu điện di ngang, rótdung dịch đệm vào cho ngập gel, chú ý đầu có lỗ lược nằm ở phía cathode

2 Pha nucleic acid cần điện di với dung dịch màu tải mẫu (điện di) 6× hoặc bằng hợp

chất màu tương tự Dịch màu có tỷ trọng cao này giúp nucleic acid không bị xáo động bởidòng đối lưu của dung dịch nên khi tải vào lỗ răng lược thì nằm gọn trong đó và có màu rõràng

Dung dịch màu tải mẫu 6× (dịch nạp mẫu) chứa 30% glycerol, 0,25% bromophenol blue(BPB) và 0,25% xylencyanol (XC)

3 Bằng micropipet hút mẫu DNA nhỏ vào lỗ răng lược

4. Bật điện một chiều để thực hiện điện di Cường độ dòng điện khoảng 50 - 150 V tùyloại thiết bị điện di Thời gian điện di thay đổi phụ thuộc vào độ lớn của DNA, nồng độagarose của gel và cường độ dòng điện

Chú ý: Lượng DNA có thể điện di trong mỗi lỗ răng lược nhiều ít tùy kích thước răng

lược, nếu quá nhiều sẽ xuất hiện hiện tượng "tailing" (kéo đuôi) khó phân li

- Kiểm tra băng DNA

1) Nếu điện di DNA trong gel có pha sẵn ethidium bromide thì chiếu tia tửngoại cũng có thể phát hiện được các băng DNA trong quá trình điện di cũng như sau khiđiện di Kiểu dạng (pattern) các băng phụ thuộc vào thành phần DNA có trong mẫu cần điện

Chú ý: Đèn tử ngoại (UV) có hai loại bức xạ với bước sóng 254 nm (UV sóng ngắn) và

366 nm (UV sóng dài) UV sóng ngắn giúp quan sát rõ DNA nhưng làm tổn hại cấu trúc chấtnày, cho nên nếu cần thu hồi DNA từ gel thì không nên áp dụng

Hình 4:

Hai làn hai bên là dấu khối lượng phân tử (DNA molecular marker), mỗi băng (vệtsáng) của mỗi làn này cách nhau 100 base pair (bp), băng nhỏ nhất (dưới cùng)

"nặng" 100 bp, băng nặng nhất 2.000 bp (giữa 1.000 bp và 2.000 bp không có cácbăng trung gian) Để ước định khối lượng phân tử làn DNA nào đó thì có thể đặtmột thước thẳng lên nó và dóng ngang xem nó tương ứng với băng nào trong làndấu khối lượng phân tử, trường hợp không trùng khít thì có thể ước lượng

Gel tập trung (stacking gel) có tác dụng làm nguyên liệu tập trung tạo nên một băngmẫu vật gọn, mảnh (các thành phần của mẫu nằm sát nhau nên có cùng điểm xuất phát),trước khi chúng đi vào lớp gel phân tách Tuy nhiên, nhiều khi do lượng mẫu cần điện di rấtnhỏ, không cần lớp gel tập trung này

Dưới đây cách chế bản gel chỉ gồm gel polyacrylamide phân tách thường dùng trongđiện di DNA Khuôn gel thường làm từ hai tấm thủy tinh khác nhau: một tấm hình chữ nhật,tấm khác có kích thước hoàn toàn tương tự nhưng được cắt bớt một phần ở một cạnh trừ haigóc, hai phần chừa lại này làm thành hai "tai" ("rabbit ear") Phần cắt bớt của tấm kính là nơiráp "lược" tạo các lỗ tải mẫu và sau đó, trong quá trình điện di, là nơi dung dịch đệm điện dikết nối với gel duy trì dòng điện giữa hai đầu (đầu có tai và đầu đáy) của bản gel

Để chế gel polyacrylamide phân tách DNA cần thực hiện các bước sau:

B1) Rửa sạch các tấm thủy tinh kỹ bằng nước sạch, để khô rồi lau lại bằng ethanol.Ráp các tấm thủy tinh theo hướng dẫn của hãng sản xuất sao cho tạo được khoảng hở giữahai tấm thủy tinh được bịt kín ba phía để không làm chảy nguyên liệu tạo gel khi rót vào.Trước tiên đặt tấm thủy tinh nguyên, đặt các thanh cách dọc theo mép tấm thủy tinh đó, rồiđặt tấm thủy tinh có "tai" lên trên sao cho các cạnh của hai tấm thủy tinh trùng khít nhau.Trong một số trường hợp, tùy thiết kế, có thể cần dán các mép bên và khe hở đáy bản gelbằng băng keo rồi dùng kẹp để kẹp các tấm thủy tinh (kẹp trước để các tấm thủy tinh ổn

Hình 5:

định, dán từng cạnh rồi thay kẹp) Tuy nhiên, cũng có thiết kế gài vào khuôn ngoài khôngcần kẹp.

B2) Chế gel theo nồng độ thích hợp cho việc phân tách DNA như trình bày trong bảngsau (pha 100 ml):

B3) Bổ sung vào dung dịch này 15 µl TEMED (N,N,N',N' tetramethylethylenediamine)lắc nhẹ cho đều rồi rót vào giữa khuôn thủy tinh sao cho không hình thành bọt khí trong gel.Thông thường, nên rót gel từ một mép trong khuôn Trong quá trình này, nếu bản gel khôngđược cố định trước (như gel dùng cho việc giải trình DNA) thì cần nâng dần miệng bảnkhuôn gel từ thế nằm ngang lên cao dần để gel không bị chảy ra ngoài còn bọt khí (nếu có)cũng từ từ thoát lên trên mà ra khỏi gel Bọt khí thường gây biến dạng các băng sản phẩmnhưng điều quan trọng là ôxy làm giảm khả năng polymer hóa của acrylamide Khi gel lỏng

đã đầy khuôn bản gel, cắm lược vào đầu khuôn gel (khoảng giữa hai tai) rồi kẹp chặt (chú ýchỉ nên kẹp lược với bản thủy tinh nguyên, không kẹp cả hai tấm thủy tinh để không tạo khe

hở giữa gel và hai tấm thủy tinh sau khi bỏ kẹp khỏi khuôn bản gel, do có sự đàn hồi các tấmthủy tinh bị ép vào nhau thẳng trở lại sau khi bỏ kẹp)

Trong trường hợp cần bổ sung lớp gel tập trung ở trên thì khuôn bản gel phải cố địnhtheo đúng phương thẳng đứng (kiểm tra bằng thủy bình kế), sau khi rót đủ lượng gel phântách (chừa lại một khoảng ở trên) cần bổ sung lớp nước cất ở phía trên mà không cần càilược Chờ đến khi gel phân tách hóa rắn thì rót bỏ lớp nước này, thay bằng gel tập trung (gelnồng độ thấp) rồi ráp lược lên trên để tạo các lỗ giếng tải mẫu điện di

Thông thường gel cứng trong vòng 30 phút Tuy nhiên, thời gian hóa rắn của gel tăngkhi nhiệt độ hạ cũng như khi nồng độ TEMED và ammonium persulfate tăng

- Điện di gel polyacrylamide

1)Sau khi gel cứng lấy lược ra khỏi khuôn bản gel, tháo khuôn bản gel khỏi khuônngoài hoặc kẹp cũng như vật chắn khác sao cho gel có hai đầu (trên và dưới) thông với bênngoài Gắn khuôn bản gel vào chậu điện di

2)Gắn điện cực vào chậu điện di sao cho cực âm (cathode) ở trên còn cực dương(anode) ở dưới (Các cặp dây dẫn và ổ cắm trên máy có màu tương phản, thường là đỏ vàđen; trong khi thực hiện không làm giao chéo)

3)Điện di tiền khởi bằng điện áp 20 V trong 30 - 60 phút

4)Trộn 0,1 - 1 µg DNA với dung dịch màu tải mẫu điện di 6×, cho vào mỗi lỗ răng lượckhoảng 20 µl (với lỗ 0,5 cm)

5)Điện di với 100 - 200 V điện một chiều trong khoảng 1 - 3 giờ, có thể quan sát thấy vịtrí của dịch màu trong gel để quyết định dừng điện di (Hình dưới)

Bảng dưới chỉ mối quan hệ giữa độ lớn của DNA với dịch màu BPB và XC khi dịchchuyển trong gel agarose Trong quá trình điện di vệt cần theo dõi băng màu lam dịchchuyển, dừng nguồn điện khi băng này cách mép dưới của bản gel khoảng 0,5 - 1 cm

Hình 6: Sơ đồ ráp bản gel vào bể điện di đứng với trường hợp chạy một bản gel.

Bên trái đã ráp gel điện di, bên phải không điện di nhưng cần ráp một tấm thủy tinh đểgiữ nước cho bể dung dịch đệm ở cathode Nếu điện di hai gel thì ráp đối xứng

6) Sau khi điện di tháo gel khỏi khuôn, nhỏ lên bề mặt gel dung dịch ethidiumbromide 5 µg/ml, để 15 - 30 phút cho ngấm, rửa gel rồi soi UV để quan sát các băng DNA

Hình 7: Kết quả điện di trong gel polyacrylamide DNA để giải trình.

Các làn có các băng tách biệt là kết quả của quá trình dịch chuyển từ một điểm (giếng tảimẫu) với vận tốc khác nhau phụ thuộc độ lớn của các DNA

3 Thu hồi đoạn DNA từ gel điện di

Nếu có nhu cầu sử dụng các phân đoạn DNA đã được phân li và tinh chế nhờ điện dicho các thí nghiệm tiếp theo thì thao tác để thu hồi DNA từ gel là cần thiết Có một sốphương pháp thu hồi DNA được trình bày và chúng có những ưu điểm và nhược điểm nhấtđịnh như thời gian thao tác, độ phức tạp và tỷ lệ thu hồi, cũng như khả năng lẫn các polymerhòa tan hoặc các chất hỗn tạp có trong gel agarose và gel polyacrylamide làm cản trở đếncác phản ứng sẽ thực hiện trong thí nghiệm sau đó

Phương pháp dùng giấy DEAE cần thời gian ngắn và lượng chất hỗn tạp tương đối ítnhưng từ gel polyacrylamide tỷ lệ thu hồi các đoạn DNA dài hoặc DNA một sợi thườngthấp

Phương pháp thu hồi nhờ điện di có thể thực hiện để thu hồi DNA từ gel agarosecũng như polyacrylamide nhưng lượng thu hồi được dưới dạng dung dịch với lượng tươngđối lớn cần phải cô đặc, cho nên chất hỗn tạp lẫn nhiều Hơn nữa, từ gel agarose việc thu hồithường khó khăn Phương pháp hồi thu từ agarose tan chảy nhiệt độ thấp có thể thu hồi DNAtrong thời gian ngắn thao tác cũng đơn giản, tỷ lệ thu hồi cao không phụ thuộc vào độ lớncủa các đoạn DNA nhưng hỗn tạp nhiều

3.1 Phương pháp sử dụng giấy DEAE (DE 81)

1) Trong khi điện di DNA trong gel agarose (có ethidium bromide trong gel hoặc phatrong dịch đệm điện di), quan sát các băng DNA đích dưới UV khi thấy băng đó đã phân lihoàn toàn thì dùng dao cắt thành rãnh ở trước và sau băng DNA rồi chèn giấy Whatman DE

81 vào đó

2) Tiếp tục điện di cho đến khi băng DNA bám hết vào giấy DE 81 thì cắt điện

3) Lấy giấy DE 81 ra khỏi gel, cho vào ống Eppendorf 0,5 ml đã được chọc thủng ở đáy(hoặc ống bơm tiêm 1 ml) rồi lắp vào trong một ống li tâm lớn hơn (như ống Eppendorf 1,5

ml đối với ống 0,5 ml, hoặc ống li tâm 10 ml đối với bơm tiêm 1 ml) rồi cho vào đó mộtlượng dung dịch đệm TAE có 50 mM NaCl, quay li tâm và lặp lại 3 lần như vậy để rửa sạch

Dung dịch đệm TAE có 50 mM NaCl chứa Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, NaCl 50mM(không hòa tan DNA).

4) Thêm 100 µl TE chứa NaCl 1M, quay li tâm nhẹ rồi để yên cho ngấm đều vào giấy

DE khoảng 5 phút, sau đó li tâm lại làm cho dung dịch đệm thoát xuống hết Lặp lại ba lần

để cho DNA thoát hết khỏi giấy DE theo dung dịch đệm

5) Chiết xuất bằng phenol và bằng chloroform mỗi thứ một lần để loại bỏ tạp chất rồikết tủa bằng ethanol ba lần mỗi lần đều kết tủa ở nhiệt độ −70 °C rồi quay li tâm thu hồi

3.2 Phương pháp thu hồi bằng điện di

1) Xác nhận các băng DNA (bằng UV với gel đã nhuộm ethidium bromide) rồi cắt băngDNA đích đã hoàn toàn phân li khỏi gel Cho mẫu gel đó vào túi thẩm tích đã buộc kỹ mộtđầu, để cho dung dịch đệm ngấm đều rồi kẹp đầu còn lại

2) Đặt túi thẩm tích vào chậu điện di nằm ngang sao cho hướng điện di vuông góc vớitúi thẩm tích

3) Cứ để vậy mà điện di với điện áp 100 - 200 V, soi dưới UV xác nhận băng DNA đãthoát hết ra khỏi gel Để tăng độ thu hồi cần điện di ngược chiều vài phút (cho DNA đã bámvào túi thoát ngược trở lại dung dịch) rồi mở túi hút hết dịch ra (nhưng cần tránh hút gel)cho vào ống nghiệm, chiết xuất bằng phenol và chloroform rồi kết tủa bằng ethanol để thuhồi DNA

3.3 Phương pháp chiết xuất DNA từ gel nghiền (từ gel polyacrylamide)

1) Xác nhận (bằng UV) vị trí DNA đã phân li cần thu hồi, cắt thu lấy gel

2) Cho mẫu gel vào ống 1 ml, nghiền nát, hoặc cho vào ống Eppendorf rồi dùng đũathủy tinh nghiền nát

3) Cho gel nát vào ống nghiệm rồi cho vào đó dung dịch đệm dung xuất (thường làlượng ngập không quá 2 lần lượng gel, nhiều hay ít tùy nồng độ của DNA trong gel), ủ mấygiờ cho đến qua đêm ở 37 °C (nếu cần, khi lượng nhỏ DNA khó tạo kết tủa thì thêm RNAnấm men đến nồng độ 10 µ g/ml).Dung dịch đệm dung xuất chứa ammonium acetate ở nồng

độ 500mM, MgCl2 10mM, EDTA 1mM và SDS 1%

4) Li tâm nhẹ rồi thu lấy nước mặt, dùng cột DEAE cellulose để tinh chế, cô đặc (xemphần sau) Chiết xuất bằng phenol-chloroform rồi chloroform và sau đó kết tủa bằng ethanol

để thu hồi DNA

3.4 Thu hồi từ gel agarose tan chảy nhiệt độ thấp

Gel agarose tan chảy nhiệt độ thấp có nhiệt tan chảy 60 °C và gel hóa ở 30 °C do một

số hãng (như BioRad, Takara ) sản xuất và phát mại

1) Chế gel nêu trên bằng cách pha vào dung dịch đệm, làm tan chảy ở khoảng 70 °C,pha ethidium bromide ở khoảng 37 °C rồi đổ bản gel, hạ nhiệt cho gel trở nên cứng

2) Điện di với điện áp thấp để tránh tăng nhiệt độ làm tan chảy gel

3) Soi UV với sự trợ giúp của ethidium bromide, cắt băng DNA đích đã phân li

4) Thêm vào 5 lần TE, ủ ở 65 °C cho gel tan chảy

5) Thêm một lượng tương đương phenol-chloroform, trộn đều rồi quay li tâm thu lấynước mặt rồi chiết xuất bằng chloroform lần nữa

6) Kết tủa bằng ethanol để thu hồi DNA

Chú ý: Một số hãng đã sản xuất và phát mại kit thu hồi DNA bằng cách nghiền và làm

tan gel agarose thông thường Chẳng hạn "QIAquick Gel Extraction Kit" của hãng QIAGEN

Co dùng máy li tâm cỡ nhỏ cao tốc, có thể chiết xuất và làm sạch các đoạn DNA dài từ 70

bp đến 10 kb từ gel (thông thường cũng như nóng chảy thấp) điện di trong dung dịch đệmTAE hoặc TBE Bộ kit này gồm dung dịch QG (màu vàng), dung dịch PE, dung dịch đệm

EB, ethanol, các cột hấp phụ (QIAquick spin column) và ống chứa 2 ml

4 PCR (polymerase chain reaction)

Phương pháp tạo dòng invivo mà chúng ta đã đề cập trong Module “Công nghệ DNAtái tổ hợp và sự tách dòng” tuy đã giải quyết về vấn đề số lượng, nhưng đòi hỏi thao tác quáphức tạp và thời gian quá dài Trong sự ra đời của các phương pháp khuếch đại (tái bảnnhanh) invitro có chọn lọc, chúng ta phải kể đến phương pháp PCR

Phương pháp PCR - phản ứng dây chuyền nhờ hoạt động của enzyme polymerase - do K Mulis cùng cộng sự phát minh năm 1985, đã đưa lại một cuộc cách mạngtrong di truyền học phân tử Đây là phương pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu, phântích gen và hệ gen Khó khăn lớn nhất trước đây trong việc phân tích gen là ở chỗ chúng lànhững mục tiêu đơn lẻ và rất nhỏ trong một hệ gen phức tạp khổng lồ Kỹ thuật PCR ra đời

DNA-đã thay đổi tất cả, giúp chúng ta có thể tạo ra một số lượng lớn các bản sao của một đoạnDNA mong muốn

Do những ưu điểm tuyệt đối trong nghiên cứu sinh học phân tử, kỹ thuật PCR đượcnhanh chóng áp dụng rộng rãi để chuẩn đoán các bệnh về virus, vi khuẩn, các bệnh ký sinhtrùng và cho kết quả rất chính xác Mặt khác, sự phân tích thành phần và trật tự nucleotidetrên phân tử DNA trong hệ gen còn có ý nghĩa to lớn trong phân loại các loài sinh vật Chínhnhờ tính thực tiễn to lớn của kỹ thuật này mà tác giả của PCR, Kary Mulis, được tặng giảithưởng Nobel vào năm 1993

Thực chất đây là phương pháp tạo dòng invitro, không cần đến sự hiện diện của tếbào và dựa trên nguyên tắc được trình bày sau đây:

4.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR

Nguyên tắc của phương pháp là tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ DNA khuôn dựatrên cơ sở hoạt động của DNA-polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung

Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR bao gồm:

 Sợi khuôn DNA chỉ cần biết trình tự nucleotide của đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn cần nhân

để thiết kế hai mồi oligonucleotide

 Hai đoạn mồi ngắn để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp DNA Là tín hiệu chỉ hướng

đi (5’ → 3’) của enzyme DNA-polymerase Mồi dài khoảng 20 nucleotide và các nucleotide

ở hai đầu của mồi không tự kết hợp với nhau theo nguyên tắc bổ sung

 Có đầy đủ các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP

 Môi trường đệm cung cấp ion Mg và nước tinh khiết không có enzyme RNase vàDNase

 Enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq)

Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 20 µl đến 50µl

Đặc điểm của phản ứng PCR là chọn lọc, nhạy và nhanh

4.2 Các bước tiến hành thí nghiệm

Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ và mỗi chu kỳ gồm 3 bước (Hình dưới)

Bước 1 - Thực hiện qúa trình biến tính DNA bằng nhiệt

Đưa DNA vào dung dịch phản ứng (gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép), tăngnhiệt độ của dung dịch lên tới 90÷98°C, thời gian lưu tương ứng khoảng từ 30s÷1 phút Tạinhiệt độ này, các phân tử DNA mạch kép bị tách ra (do liên kết hydrô bị đứt), tạo nên cácsợi đơn dùng để làm khuôn tổng hợp sợi mới

Bước 2 - Thực hiện phản ứng lai

Sau bước 1, ngay lập tức nhiệt độ được hạ xuống từ từ và nhỏ hơn nhiệt độ Tm của mồi,vào khoảng 37÷68°C và thời gian lưu 30s÷1 phút Bổ sung mồi để mồi bắt cặp với sợikhuôn Mồi được tổng hợp hóa học, có mồi ngược và xuôi Người ta còn có thể dựa vàotrình tự nucleotide ở đầu 3’ của khuôn để tổng hợp mồi Sau đó bổ sung DNA-polymerase

để kéo dài mồi

Hình 8: Quá trình PCR Hình 9: Sơ đồ phản ứng PCR nhiều chu kỳ

Bước 3 - Tổng hợp mạch mới hay còn gọi là kéo dài (extension)

Nâng nhiệt phản ứng lên 72°C trong vài chục giây đến 1 phút để DNA- polymerase tổnghợp sợi mới Trong thực tế, thời gian và nhiệt độ phản ứng phụ thuộc vào sợi DNA cầnkhuếch đại

Kết thúc một chu kỳ từ một DNA kép mẹ tổng hợp 2 sợi DNA kép con Cứ như vậy,phản ứng xảy ra trong 25 đến 40 chu kỳ Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ được duy trì ở 72°C trongkhoảng từ 5 đến 10 phút sao cho tất cả các sợi đơn xoắn lại và tạo nên sản phẩm của PCR.Sau đó hạ xuống 4°C để bảo quản sản phẩm

Các bước thực hiện phản ứng PCR một chu kỳ

Sản phẩm của PCR được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose nồng độ từ0,8%÷2% để phát hiện sự đa hình của các đoạn DNA đặc thù, hoặc các đoạn DNA bị thayđổi do các tác nhân nào đó (đột biến, tái tổ hợp).

4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

- DNA mẫu làm khuôn

Phản ứng PCR tối ưu xảy ra khi mẫu DNA không được dài quá, thường khuếch đại tốtnhất đối với đoạn DNA dài khoảng 1÷1,5kb

Mẫu DNA tinh sạch sẽ cho kết quả tốt, tuy nhiên, kỹ thuật chuẩn đoán bằng phương phápnày vẫn đạt kết quả tốt trong trường hợp mẫu DNA không cần có độ tinh sạch cao, như vếtmáu khô, những mẫu vật khảo cổ (tóc, móng tay người đã chết) Phương pháp này cho phépxác định DNA với một lượng thấp, khoảng nhỏ hơn 100 ng (1g = 109ng)

- Enzyme DNA-polymerase

Chất lượng của phương pháp phụ thuộc vào khả năng chịu nhiệt của enzymepolymerase (do phản ứng luôn phải thực hiện ở nhiệt độ khác nhau) Đầu tiên người ta sửdụng các đoạn Klenow của DNA-polymerase I từ E Coli ở 37°C (cắt nhỏ mảnh DNA-polymerase I thành đoạn Klenow mất hoạt tính exonuclease) do đó đã nhận được đoạn cầnnhân không tinh sạch vì đây không phải là enzyme chịu nhiệt

Phương pháp PCR chuyển sang một bước ngoặt mới cùng với sự phát hiện enzymeTaq-polymerase có nguồn gốc vi khuẩn (Thermus aquaticus) tách từ suối nước nóng nênchịu được nhiệt độ cao Với enzyme này cho phép nhận được các sản phẩm DNA tinh sạch.Điều này cho phép tự động hóa tất cả các bước của chu trình nhân bản DNA Từ đó máy chutrình nhiệt PCR ra đời và có khả năng điều khiển về cả nhiệt độ lẫn thời gian Ngày nay córất nhiều hãng trên thế giới sản xuất máy chu trình nhiệt PCR như: Perkin Elmer, MJ,Eppendorf,

Nhược điểm của enzyme này là không tổng hợp được trình tự DNA dài quá 3kb, hơnnữa, enzyme này không có khả năng sửa sai trong quá trình sao chép Hiện nay có nhiềuenzyme polymerase chịu nhiệt mới được đưa ra thị trường với nhiều chức năng chuyên biệt

và hoàn thiện hơn, như là Tth- polymerase tách từ vi khuẩn Themus thermophilus, Elogase(bao gồm nhiều enzyme kết hợp trong đó có sự tham gia của Taq-polymerese)

- Mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi

Mồi là một chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quảcao Chọn mồi phải tuân theo nguyên tắc sau đây:

- Trình tự của mồi được chọn không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, vàcũng không tạo những cấu trúc kẹp tóc

- Mồi phải chọn đặc trưng cho DNA cần khuếch đại và không trùng với các trình tự lặplại trên gen

- Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn (1kb)

- Độ dài mồi cần chọn khoảng 18 đến 30 nucleotide, nếu mồi nhỏ hơn 10 nucleotide,mồi bám không đặc hiệu Còn mồi dài hơn 30 nucleotide sẽ ảnh hưởng đến cơ chế tổng ởBước 3

- Tm mồi xuôi và mồi ngược không cách nhau quá xa, thông thưòng trong khoảng từ4÷5°C, và nhiệt độ nóng chảy của mồi khoảng 72°C

- Ảnh hưởng của các nuleotit

Cần phải có bốn loại nucleotide dạng triphosphat như: dATP, dTTP, dGTP, dCTP Nồng

độ mỗi loại nucleotide phải ở dạng cân bằng, ứng với khoảng 20÷200µM cho mỗi loạinucleotide Nếu mất trạng thái cân bằng thì sẽ gây ra lỗi khi sao chép, nếu nồng độ cácnucleotide cao hay thấp hơn sẽ dẫn đến hiện tượng sao chép giả

 Môi trường phản ứng

Ion Mg2+ là thành phần không thể thiếu được của phản ứng PCR, nồng độ Mg2+ tối ưu đểthực hiện PCR từ 150÷200µM Nồng độ chuẩn cho từng khoản tương ứng, phải được xácđịnh trong điều kiện thí nghiệm nhất định

Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải là nước tinh khiết, không chứa bất kỳ ion lạ nào.Không được chứa các enzyme cắt hạn chế và các enzyme phân hủy axit nucleic

Môi trường dung dịch đệm phải ổn định

 Thời gian và số lượng chu kỳ

Qua nghiên cứu cho thấy: tổng thời gian cho mỗi bước của một chu kỳ và của chu kỳ đầuvới các chu kỳ tiếp theo là khác nhau Ngoài ra, thời gian cho mỗi phản ứng còn phụ thuộcvào độ dài của đoạn DNA cần nhân dòng

Số lượng chu kỳ cho một phản ứng PCR thông thường trong khoảng từ 30 đến 40 chu kỳ.Bởi vì phản ứng diễn biến theo hai giai đoạn: Ở giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theocấp số nhân, và đến một giới hạn nào đó thì số bản sao giảm, hiệu quả khuếch đại giảm docác nguyên nhân:

 Nồng độ nucleotide giảm

 Xuất hiện sản phẩm phụ

 Do các bản sao không bắt cặp với mồi mà chúng lại bắt cặp với nhau

Ngoài ra, số chu kỳ phụ thuộc vào số bản mẫu ban đầu, nếu số bản mẫu là 105 thì thựchiện 25÷30 chu kỳ, còn số mẫu 102÷103 thì thực hiện 35÷40 chu kỳ

 Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị cần đáp ứng yêu cầu thay đổi được nhiệt độ nhanh và chính xác Tránh tối đa sựbốc hơi nước trong quá trình phản ứng Tuy nhiên, ứng với mỗi phản ứng cụ thể có các thiết

bị và dụng cụ khuếch đại riêng

4.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp PCR

 Ưu điểm:

Thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể khuếch đại được một trình tự đángquan tâm Thực hiện đơn giản và ít tốn kém (nó được thực hiện trong ống nghiệm plasticnhỏ gồm thành phần tối thiểu được thực hiện đồng thời) Yêu cầu về độ tinh sạch của mẫukhông cao (vết máu khô, mẫu vật khảo cổ, những vết tích để lại của người đã chết)

 Nhược điểm:

Cần phải có DNA mồi đặc trưng cho DNA cần khuếch đại Để có đoạn mồi này ít nhấtphải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại Kích thước DNA cần khuếch đại không

vượt quá 3kb Khả năng ngoại nhiễm lớn (do thao tác nhiều lần) Sai sót còn do sử dụng Taq-polymerase khoảng 10 4 (sai sót cho một lần sao chép).

mã ngược: mRNA → cDNA Từ cDNA, ta đánh giá được mRNA

Khuếch đại DNA và RNA ngay tại hệ mô: Gọi là kỹ thuật insitu, kỹ thuật này có nguyêntắc như trên, được tiến hành ngay trên lát cắt mô, tế bào cố định trên lame trong thiết bị PCR

có bộ phận tạo nhiệt cho lame

Trong nuôi cấy mô tế bào, kỹ thuật PCR được dùng để nghiên cứu những thay đổi ở mức

độ DNA của các dòng mô nuôi cấy và các cây tái sinh từ mô sẹo, để nghiên cứu sự có mặtcủa các gen ngoại lai trong các cây biến nạp

Định lượng DNA: Khi nồng độ DNA thấp, dùng phương pháp PCR nhân lên đến mứcxác định Người ta xác định được số lượng bản mẫu ban đầu qua tính toán dựa vào sản phẩmcuối cùng và số chu kỳ nhân Điều quan trọng là số chu kỳ nhân không được vượt quá giaiđoạn đầu của phản ứng, khi mà số lượng bản sao còn tỷ lệ thuận với số lượng bản mẫu banđầu

Ứng dụng trong pháp y, chuẩn đoán những bệnh di truyền, nghiên cứu mẫu khảo cổ, bảotồn và duy trì những gen quí

4.6 Nguyên lý cơ bản của phản ứng RT-PCR (PCR ngược)

Phản ứng RT-PCR thực chất là phản ứng nhân một đoạn giới hạn của khuôn RNA, theonguyên lý của phản ứng PCR gồm có hai giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất là sao chép RNAkhuôn thành DNA sợi đôi nhờ hoạt động của enzyme sao chép ngược Giai đoạn này đượcthực hiện ở 50÷55°C và thời gian là 30 phút Giai đoạn 2 là dùng chính DNA vừa sao chéplàm khuôn cho phản ứng PCR, quá trình được thực hiện theo ba bưóc như đã trình bày ởtrên

Sau khi phản ứng kết thúc, sản phẩm của phản ứng PCR ngược được giảm xuống 4°C đểbảo quản cho tới khi sử dụng Để đánh giá và phát hiện sản phẩm PCR ngược người ta cũngđiện di trên gel agarose 0,8÷1% Và DNA chuẩn là DNA λ được cắt bởi enzyme HindIII có

độ dài 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb

5 Lai phân tử

5.1 Cơ sở của lai phân tử

a Khái niệm nhiệt độ nóng chảy của DNA

Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá “nhiệt độ nóngchảy” (Tm) thì hai mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết hidro nối liền hai mạch

Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn xảy ra đột ngột sau khi nhiệt độ daođộng rất ít xung quanh Tm, do tính “cộng hưởng” của phản ứng Hiện tượng “cộng hưởng”này giống như trên một dây kéo, khi ta tác động một lực kéo dưới một ngưỡng nhất định thìhoàn toàn không có tác dụng Nhưng nếu lực kéo đủ mạnh để làm bật chỉ một nút nhỏ thìtoàn bộ dây kéo sẽ bung ra mà không cần thêm một lực tác động nào Sự chuyển từ mạch đôi

sang mạch đơn được xác định rõ ràng thông qua việc đo biến động giá trị của mật độ quang(OD) ở bước sóng 260nm Giá trị của mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyểnthành mạch đơn, hiện tượng này có tên gọi là “hiệu ứng siêu sắc” (hyperchromic effect).Nguyên nhân của hiện tượng này là do trong phân tử DNA mạch đôi, các base (thành phầnhấp thụ ánh sang ở bước sóng 260nm) nằm chồng lên nhau trên những mặt phẳng song song;cấu trúc đó che lấp một phần các base khiến chúng không hấp thụ ánh sang như những đơn

vị toàn vẹn khác với ở DNA mạch đơn

b Các nhân tố ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA

Hai mạch đôi của phân tử DNA bắt cặp với nhau nhờ các phân tử hydro Sự tách rờihai mạch tương ứng với sự phá liên kết ấy Do đó, số lượng các liên kết và yếu tố làm thayđổi tính ổn định của chúng sẽ làm thay đổi “nhiệt độ nóng chảy” của phân tử DNA

 Ảnh hưởng của thành phần các base trong phân tử DNA

Trong phân tử DNA, khi tăng nhiệt độ các mối liên kết A-T dễ bị đứt trước, khi nhiệt

độ >900C các liên kết G-C bị đứt Do đó thành phần các base cấu tạo một DNA mạch đôi cóảnh hưởng rất quan trọng cho sự bền vững của phân tử này, đặc biệt các base G, C trongđiều kiện chuẩn DNA có tỉ lệ G-C cao sẽ có điểm nóng chảy cao, DNA có 60% G-X thìđiểm nóng chảy là 950C Biểu thức thể hiện sự phụ thuộc của Tm vào thành phần các base:

Tm=69,3+0,41 (%G+C)

 Ảnh hưởng của độ dài DNA

Đoạn DNA càng dài bao nhiêu thì số lượng liên kết hydro nối hai mạch càng lớn bấynhiêu và do đó “nhiệt độ nóng chảy” cũng càng cao Sự thay đổi Tm theo chiều dài phân tửDNA được tính theo công thức sau:

Tm=-500/số lượng cặp baseCông thức trên cho thấy ảnh hưởng của độ dài chỉ quan trọng đối với nhũng đoạnDNA ngắn điều này chính là kết quả của tính “hợp tác” đã đề cập ở phần trên

 Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch)

Những điểm bắt cặp sai lệch (A bắt cặp với C, G bắt cặp với T,…) sẽ làm giảm tính

ổn định của một phân tử lai Thông thường người ta ước lượng Tm giảm 10C cho mỗi 1%phần trăm bắt cặp sai lệch Nhưng cũng như các thành phần các base, các mismatch chỉ có ýnghĩa thực tiễn đối với các đoạn DNA ngắn

 Ảnh hưởng của môi trường phản ứng

- Ảnh hưởng của nồng độ muối

Sự giảm lực ion (nồng độ muối) của môi trường sẽ làm giảm rất mạnh nhiệt độ nóngchảy Tm sẽ làm giảm khoảng 150C cho mỗi logarithm nộng độ đối với các ion hóa trị I cáccation hóa trị II cón có tác động mạnh hơn Như vậy, một dung dịch càng loãng thì càng làmmất ổn định chuỗi xoắn kép của DNA

- Ảnh hưởng của formamide

Hóa chất này có khả năng hạ thấp Tm rất nhiều, đối với những đoạn dài hơn 100 cặpnucleotide, sự giảm Tm có thể được ước lượng theo công thức sau:

Tm= -0.6x(%formamide)

Formamide được sử dụng trong các phương pháp li phân tử nhằm làm giảm nhiệt độlai Nồng độ thông dụng là 50% tương ứng với việc hạ nhiệt độ tương ứng tới 300C.

Trong thực tế cần lưu tâm đến tất cả các chỉ tiêu nêu trên khi tính toán Tm Công thứcthực nghiệm sau đây cho phép tập hợp mọi yếu tố để ước lượng Tm:

Tm=16,6 log [m]+0.41(%GC)+81,5-%mismatch-675/chiều dài (cặp

base)-0,65(%formamide)

Công thức này dùng cho những đoạn DNA ngắn hơn 100 cặp nucleotide; trong đó[M] biểu thị nồng độ ion Na+

c Khái niêm về lai phân tử

Hai mạch đơn của phân tử DNA gắn với nhau nhờ các liên kết hydro Khi đun nóngDNA từ từ, vượt quá nhiệt độ nóng chảy Tm, các liên kết hydro giữa hai mạch bị phá vỡ, haimạch sẽ tách rời nhau

Nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột thì sự bắt cặp sẽ không xảy ra Lúc đó phân

tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn dưới một cấu hình vô trật tự

Ngược lại, nếu sau khi hai mạch tách rời, nhiệt độ được làm giảm từ từ cộng với điều kiệnthích hợp, chúng sẽ bắt cặp trở lại Hiện tượng này được gọi là lai phân tử (molecularhybridization)

d Đặc điểm của lai phân tử

Đặc hiệu tuyệt đối: sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung vớinhau dẫu chúng chỉ có hai bản sao nằm lẩn giữa hàng triệu trình tự khác

Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA, dẫn đến sự hình thành các phân tửDNA-DNA, RNA-RNA hay các phân tử lai DNA-RNA

e Các yếu tố ảnh hưởng đến lai phân tử

 Độ dài của các trình tự

Tốc độ lai tăng tỉ lệ thuận vối căn bậc hai của tốc độ dài các trình tự bổ sung

 Lực ion

Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng lên từ 5-10 lần Nồng độ NaCl >1,2 Mlại hoàn toàn không còn tác dụng.

5.2 Các phương pháp lai phân tử

a Lai trong pha lỏng

 Nguyên tắc

Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm trong môi trường lỏng là một dung dịchđệm Sự lai phân tử này chỉ xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khinhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ

Trong thực tế, nhiệt độ lai được chọn thấp hơn Tm khoảng 15˚C , hơn nữa người tacòn thêm formamide để giảm nhiệt độ lai Đối với những trình tự ngắn nhiệt độ lai được tínhtheo như công thức ở phân trên, đối với trình tự dài, nhiệt độ lai thông dụng là 42˚C

 Phân tích định lượng các phân tử lai

- Phương pháp dùng quang phổ kế

DNA mạch đôi hấp thu ánh sáng yếu hơn DNA mạch đơn Sự chuyển từ DNA mạchđôi sang dạng mạch đơn được xác định thông qua giá trị của mật độ quang (OD) ở bướcsóng 260nm Do đó, trong phản ứng lai, sự tăng OD 260nm tương ứng với sự tăng số lượngcác phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn, hiện tượng này gọi là hiệu ứng siêu sắc(hyperchromic effect)

Các giá trị OD được đo với một quang phổ kế trong đó cuvet đựng mẫu đo có bộphận điều chỉnh nhiệt độ

Hiệu ứng siêu sắc: Nhuộm tím phân tử DNA, nếu đem chúng đun lên và làm lạnh từ từ thì

kết quả là các phân tử DNA sẽ trở nên tím đậm hơn lúc đầu một chút Nếu hạ nhiệt độ mộtcách đột ngột thì chúng sẽ trở nên rất đậm Đó là do hiện tượng các mạch đơn DNA hấp thutia UV mạnh hơn DNA mạch đôi

- Phương pháp dùng Nuclease S1

Nuclease S1 là một enzyme có khả năng thuỷ giải các nucleic acid mạch đơn bất kểDNA hay RNA, trong một số điều kiện thực nghiệm nhất định Dung dịch phản ứng lai đượctrích ra một phần, đem xử lý với Nuclease S1 Các mạch đơn đều sẽ bị thuỷ giải, sản phẩmcủa phản ứng là oligonucleotides hoặc nhóm nucleotide 5' phosphoryl Các nucleic còn lạitương ứng với các phân tử lai, chúng được thu nhận qua phương pháp tủa rồi đem địnhlượng

- Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite

Hydroxylapatite là những tinh thể phosphat calci Kĩ thuật này sử dụng các mồi đánhdấu (đoạn nucleotide hoặc kháng thể) để lai với DNA, RNA hoặc với các protein ở trong các

tế bào mà không cần tách chiết

Ở nồng độ muối cao, chỉ những nucleic mạch đôi mới gắn vào giá thể này, phầnnucleic không gắn vào giá thể sẽ được thu nhận Sau đó, nếu tăng nồng độ phosphate lên,các nucleic acid đã gắn sẽ tách rời giá thể và được thu nhận riêng Số lượng DNA gắn (mạchđôi) và không gắn vào giá thể (mạch đơn) được xác định bằng quang phổ kế, từ đó tính được

% tỉ lệ phân tử lai

 Các ứng dụng của phương pháp lai trong pha lỏng

- Tính tỉ lệ % các trình tự giống nhau ở hai loài gần nhau

Nếu không hiện diện với số lượng quá lớn, các mismatch (bắt cặp sai lệch) khôngngăn cản hoàn toàn quá trình lai giữa những DNA lớn Chúng chỉ giảm Tm (nghĩa là giảm

độ bền vững) của các phân tử lai Như vậy DNA có nguồn gốc từ hai loài gần nhau, dùkhông tuyệt đối giống nhau vần có thể lai được với nhau Để tránh sự tái bắt cặp giữa 2mạch của cùng một phân tử ban đầu, DNA của 2 loài phải có nồng độ rất khác nhau Nếuphản ứng xảy ra hoàn toàn, tỷ lệ % các phân tử lai có thể được xem như tương ứng với tỷ lệ

% các trình tự giống nhau giữa 2 loài đó Tỷ lệ càng cao thì 2 loài càng gần nhau trong câytiến hoá

Ở prokaryote, động học của sự tái bắt cặp biểu thị dưới dạng một đường cong đơngiản, điều này cho thấy vận tốc tái bắt cặp của tất cả các trình tự trên bộ gen là như nhaunghĩa là không có trình tự nào được lặp lại

Ở Eukaryote, đó là một đường cong phức tạp bao gồm nhiều đường cong đơn giản,điều này cho thấy có 3 loại trình tự DNA:

1.DNA có khả năng bắt cặp tức thời, tương ứng với các trình tự lặp lại rất nhiều lần.2.DNA tái bắt cặp chậm hơn, tương ứng với các trình tự lặp lại vừa vừa

3.DNA tái bắt cặp rất chậm tương ứng với các trình tự duy nhất

- Phân tích các trình tự lặp lại

Trong 1 dung dịch DNA, một trình tự lặp lại nhiều lần sẽ có nhiều cơ may gặp mạch

bổ sung hơn so với một trình tự duy nhất Động học tái bắt gặp của nó sẽ nhanh hơn so vớitrình tự duy nhất, động học này càng lớn khi số lượng bản sao của trình tự lặp lại càng cao,như bộ gen của động vật có vú

- So sánh kích thước các bộ gen không chứa trình tự lặp lại

Ở prokaryote, bộ gen không chứa các trình tự lặp lại nên động học lai của tất cả cáctrình tự là như nhau Do đó giá trị Cot1/2 chỉ phụ thuộc kích thước của bộ gen Tính chất nàyđược sử dụng để so sánh kích thước bộ gen ở các loài sinh vật prokaryote

a Lai trên pha rắn

- Nguyên tắc

Lai trên pha rắn có cùng nguyên tắc với lai trên pha lỏng Điểm khác biệt ở đây làmột trong hai trình tự bổ sung (thường là trình tự đích, trình tự cần tìm) được cố định trênmột giá thể rắn

Thuận lợi của việc sử dụng giá thể rắn là dễ dàng trong thao tác và trong việc tách cáctrình tự không lai ra khỏi các phân tử lai, mặt khác còn ngăn sự tái bắt cặp giữa hai mạch củacùng một phân tử

Hạn chế là, việc phân tích và định lượng các phân tử lai sau đó kém chính xác và hiệuquả lai thấp Mặt khác, vận tốc lai trên pha rắn kém gấp 10 lần vận tốc lai trên pha lỏng domột phần các nucleic trên giá thể bị che khuất, không tiếp xúc được với các trình tự bổ sung

- Các yếu tố kỹ thuật

Giá thể rắn dùng để cố định nucleic acid là các màng lai

Có 2 loại màng lai:

- Màng lai bằng nitrocellulose

Là loại giá thể được sử dụng đầu tiên, hiện nay không còn thông dụng do 2 nhược điểm :

 Độ bền cơ học kém nên khó thao tác

 Không thể tách rời các phân tử lai trên màng để lai trở lại với một mẫu dò khác

- Màng lai bằng nylon

Có độ bền cơ học cao và cho phép lai nhiều lần với nhiều mẫu dò khác nhau, tuynhiên cần phải loại bỏ mẫu dò cũ trước khi lai với mẫu dò mới

 Ứng dụng của các phương pháp lai trên pha rắn

Có rất nhiều ứng dụng của phương pháp lai trên pha rắn, hiện nay có 4 phương pháp

cơ bản sau:

 Southern blot

 Northern blot

 Western blot

 Dot (SLot) blot

Trong đó có 3 phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất là: Southern, Northern và Dotblot

- Phương pháp Southern blot

Mục đích : Phương pháp này dùng để định vị những trình tự đặc biệt trên DNA bộ

gen, hay những DNA kích thước nhỏ như DNA plasmid, phage…

Cơ sở của phương pháp là kỹ thuật chuyển (transfer) DNA tử gel lên màng lai doSouthern mô tả năm 1975

Các bước tiến hành:

1 Đoạn DNA phân tích, được cắt thành những đoạn có kích thước khác nhau bằngenzyme cắt giới hạn Đối với sinh vật có hệ gen phức tạp, quá trình cắt có thể tạo ra hàngtriệu mảnh vỡ

2 Hỗn hợp phức tạp các mảnh vỡ được đem điện di trên gel agarose, để tách các mảnhtheo kích thước Nếu có một số các mảnh vỡ DNA lớn hơn 15 kb (1kb = 1000 cặp base củaDNA hoặc RNA), trước khi thực hiện quá trình thấm, gel có thể được xử lý bằng một acid,

ví dụ như acid HCL loãng, các mảnh DNA bị phá vỡ thành các phần nhỏ hơn, do đó chophép chuyển giao hiệu quả hơn

3 Những đoạn DNA ngắn trong gel bị biến tính bằng chất kiềm, trong dung dịch kiềmDNA sợi kép bị tách thành các DNA sợi đơn Sau đó, chúng được chuyển vào lên màngnitrocellulose hoặc nylon bằng cách thấm Thủ tục này duy trì sự phân bố của các mảnh vỡtrong gel, tạo ra một bản sao của gel trên bộ lọc

Màng tế bào sau đó được nướng trong lò chân không hoặc đun nóng ở 80°C trong 2 giờ(ở điều kiện tiêu chuẩn; sử dụng màng nitrocellulose hoặc nylon) hoặc tiếp xúc với tia cựctím (sử dụng màng nylon) để vĩnh viễn gắn DNA được chuyển trên màng tế bào

4 Đem lai các DNA được cố định trên màng này với các mẫu dò có đánh dấu phóng xạ.Sau quá trình lai, người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp chuyên biệt vớiDNA cố định trên màng

5 Cuối cùng, người ta dùng kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) để định vị cácphân tử lai Người ta sẽ đặt một phim nhạy cảm với tia xạ áp sát vào màng lai, các mẫu dòđược đánh dấu phóng xạ sẽ tác động lên phim và kết quả được thể hiện qua các chấm đentrên phim.

Ứng dụng của phương pháp lai Southern blot.

 Lập bản đồ giới hạn của một gen

 Phát hiện các đa dạng trình tự (fragment polymorphism) của cùng một gen ở cácchủng hay các cá thể khác nhau qua sự so sánh bản đồ giới hạn của chúng

 Phát hiện các đột biến mất đoạn, đột biến điểm hay tái tổ hợp trên một gen vì chúnglàm thay đổi bản đồ giới hạn

- Phương pháp Nortnern blot

Mục đích

Nhằm xác định kích thước và hàm lượng của một RNA thông tin cụ thể (mRNA)

Các bước thực hiện

1 Để chiết xuất RNA từ mô, sử dùng các tác nhân chaotropic, chẳng hạn nhưguanidinium isothiocyanate Các đại lý như vậy phá vỡ các tế bào và làm biến tính proteincũng như hoà tan các RNA mRNA chiếm 2-5% tổng số RNA, và để chiết xuất nó đòi hỏimột bước chọn lọc, sử dụng mRNA có đuôi poly(A)

2 Các RNA được điện di trên gel agarose để phân tách theo kích thước

3 Chuyển RNA lên màng lai nylon hoặc bộ lọc nitrocellulose thông qua một hệ thốngthấm bằng mao mạch hoặc chân không Theo phương pháp truyền thống, sử dụng thấm maomạch vì nó không cần đến các thiết bị đặc biệt Tuy nhiên, ngày nay xu hướng sử dụng thấmchân không ngày càng nhiều vì nó đem đến lợi thế về tốc độ và khả năng tái tạo

Các bộ đệm chuyển giao được sử dụng trong hệ thống thấm thường chứa formamide, vì

nó làm giảm nhiệt độ ủ của sự tương tác thăm dò-RNA, do đó ngăn ngừa suy thoái RNA bởinhiệt độ cao

4 Sau khi RNA đã được chuyển giao, nó là di động thông qua mối liên kết cộng hóa trịmàng bằng ánh sáng tia cực tím hoặc nhiệt Việc hình thành các mối liên kết cộng hóa trị củaRNA trên màng tế bào, giúp ngăn cản axit nucleic không bị rửa trôi trong bước xử lý tiếptheo

Đem lai RNA trên màng với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ Điều kiện thí nghiệm có thểảnh hưởng đến hiệu quả và độ đặc hiệu của lai bao gồm: lực ion, độ nhớt, các cặp cơ sởkhông phù hợp và các thành phần cơ bản

5 Màng được rửa sạch để loại bỏ các đầu dò không bị ràng buộc

6 Các phân tử lai được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi

Ứng dụng

Phương pháp Northem blot cho phép quan sát mô hình biểu hiện gen của các mô, cơquan, giai đoạn phát triển, nhiễm mầm bệnh… Kĩ thuật này dùng để hiển thị sự xuất hiệnquá mức các gen gây ung thư và giảm các gen ức chế quá trình ung thư khi so sánh với môbình thường, cũng như biểu hiện sự từ chối các cơ quan khi cấy ghép Kết quả thu được khiquan sát mô hình biểu hiện gen sẽ cung cấp một cái nhìn sâu sắc vào chức năng của gen đó

Phương pháp này cũng cung cấp một cái nhìn sâu sắc vào kích thước của sản phẩm,

có thể thấy các mối nối thay thế sản phẩm trên cùng một gen hoặc các mẫu có trình tự lặp đi

lặp lại Một sản phẩm gen không đúng kích thước có thể do xóa bỏ hoặc sai sót trong xử lýbản sao, bằng cách thay đổi mục tiêu thăm dò được sử dụng theo trình tự được biết đến, nó

có thể xác định khu vực của RNA mất tích

- Phương pháp Western blot

Mục đích

Là một phương pháp phổ biến, được sử dụng rộng rãi để phát hiện protein

Các bước thực hiện

1 Chiết tách protein từ tế bào, sử dụng các chất tẩy rửa, muối và các bộ đệm để khuyếnkhích sự phân giải tế bào và hòa tan protein Các chất ức chế protease và phosphatasethường được thêm vào để ngăn chặn sự tiêu hóa của mẫu bởi các enzyme Chuẩn bị môthường được thực hiện ở nhiệt độ lạnh để tránh làm biến tính và suy thoái protein

2 Protein sau khi được chiết tách, sẽ đem đi điện di gen polyacrylamide Trong quátrình này khả năng tách protein có thể nhờ vào điểm đẳng điện (pI), trọng lượng phân tử,điện tích, hoặc sự kết hợp của những yếu tố này Bản chất của sự khác biệt này phụ thuộcvào việc xử lý mẫu và tính chất của gel Đây là một cách rất hữu ích để xác định một protein

3 Gel sẽ được chuyển lên màng nitrocellulose hoặc PVDF Protein cố định trên màngtạo ra những vệt có thể thăm dò được nhờ sử dụng kháng thể đặc hiệu với protein mục tiêu

4 Màng được đem ủ với một loại protein (ví dụ như protein sữa hoặc BSA), các proteinnày liên kết với bất cứ nơi nào còn trống trên nitrocellulose Điều này giúp giảm thiểu hiệntượng gắn không đặc hiệu của kháng thể lên màng

5 Sau đó một loại kháng thể (primary antibody) có kháng nguyên chính là protein đượcxác định được thêm vào và kháng thể này sẽ gắn lên các vệt protein trên màng tạo ra một lớpphân tử kháng (nhưng vị trí của nó không thể nhìn thấy vào thời điểm này)

6 Một kháng thể khác (secondary antibody) có mang một lọai enzyme sẽ bắt cặp vớikháng thể ban đầu, enzyme trên phản ứng với cơ chế đặc hiệu tạo ra sản phẩm kết tủa cómàu tại vị trí của phức hợp kháng nguyên-kháng thể

Ứng dụng của phương pháp

 Các thử nghiệm khẳng định HIV sử dụng phương pháp Western blot để phát hiệnkháng thể chống HIV trong một mẫu huyết thanh của con người

 Một Western blot cũng được sử dụng như kiểm tra xác định cho bệnh não ở bò (BSE,thường được gọi là bệnh bò điên)

 Western blot cũng có thể được sử dụng như một thử nghiệm xác minh về nhiễm viêmgan B

 Trong y học thú y, blot phương Tây đôi khi được sử dụng để xác nhận FIV tình trạng

Cách tiến hành

1 Trong phương pháp này người ta không chuyển acid nulceic từ gel lên màng mà đặttrực tiếp một lượng mẫu nhỏ lên màng lai ( thành một điểm-Dot hay một khe-Slot)

2 Sau đó các phân tử được phát hiện bằng các đầu dò nucleotide hoặc kháng thể

3 Bản phóng xạ tự ghi sau đó đươc phân tích bằng kỹ thuật mật độ kế cho phép ướclượng số lượng các phân tử lai có trong mẫu Trong thực nghiệm, người ta sử dụng một dụng

cụ (tên là manifold) cho phép đặt một lúc nhiều mẫu DNA hay RNA lên màng lai

Ưu và nhược điểm

Dot blot đơn giản hơn các phương pháp Southern blot, Northern blot, Western blot.Phương pháp này giúp tích kiệm thời gian, bỏ bớt bước điện di gen, không cần các enzymecắt giới hạn và quá trình thấm

Tuy nhiên phương pháp này không cung cấp thông về kích thước phân tử sinh học.Hơn nữa, nếu hai phân tử kích cỡ khác nhau được phát hiện, nó vẫn sẽ xuất hiện như là mộtdấu chấm duy nhất

Do đó phương pháp này chỉ có thể xác nhận sự hiện diện hay vắng mặt của một phân

tử sinh học hoặc phân tử sinh học, được phát hiện bởi các đầu dò hoặc kháng thể

Ứng dụng

Một ví dụ của việc ứng dụng Dot blot trong sinh học phân tử:

Vào năm 1990, Tiến sĩ Siwo de Kloet, một cựu giáo sư di truyền học tại Đại học bangFlorida, đã dùng phương pháp Dot-blot để xác định giới tính của một loạt các loài chim.Phương pháp này được chứng minh là cực kỳ đáng tin cậy, khi có thể thu thập đầy đủ sốlượng phân tử DNA di truyền

c Phương pháp lai tai chỗ

Phương pháp này cung cấp thông tin chính xác về vị trí và sự phân bố của một trình

tự DNA cần tìm trên NST nhờ một mẫu dò chuyên biệt

Các bước thực hiện

1 Các NST ở giai đoạn trung kì (các NST này thường có nguồn gốc từ bạch cầu) được

xử lí bằng các kỹ thuật tế bào học trên lame

2 NST cố định trên lame được đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ

3 Để phát hiện phân tử lai, người ta sẽ phủ lên lame một huyền dịch (emulsion) nhạycảm với tia xạ Sau một thời gian cho tia xạ tác động lên huyền dịch Lame được quan sátdưới kính hiển vi, kết quả thể hiện thành những hạt nằm trong lớp huyền dịch ngay trên vị trí

có phân tử lai

Kĩ thuật FISH

Một trong số các kỹ thuật thường dùng của phương pháp này là kỹ thuật lai tại chỗnhiễm sắc thể gắn huỳnh quang (FISH), kỹ thuật này thường được áp dụng để phát hiện yếu

tố HER-2/NEU trong ung thư biểu mô

Cũng như các phương pháp xét nghiệm dựa trên DNA khác, FISH có lợi điểm là cácnuclieotid có khả năng biến tính và tái tổ hợp lại Một đặc tính rất quan trọng là ở dạng chuỗiđơn DNA, mỗi axít nucleic sẽ bắt cặp với một acid nucleic khác theo nguyên tắc bổ sung đểtái cấu trúc lại chuỗi xoắn kép DNA

Trong kỹ thuật FISH thường quy định đoạn DNA đích được cố định trên bề mặt tiêubản sẽ được lai với đoạn DNA đã được đánh dấu huỳnh quang (đầu dò DNA), tạo thành 1chuỗi xoắn kép DNA lai

FISH là một phương pháp xét nghiệm cho kết quả khách quan hơn Nó được coi làmột xét nghiệm tiêu chuẩn với độ nhạy và độ đặc hiệu cao để phát hiện sự khuyếch đại củagene HER-2/neu Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là giá thành khá cao, mấtnhiều thời gian hơn, phải quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, việc đọc kết quả khó khănhơn do khó ghi nhận những dấu hiệu hình thái học kèm theo, đôi khi rất khó xác định vùngung thư xâm lấn trên tiêu bản FISH, tiêu bản không thể lưu giữ lâu để có thể xem lại vì tínhiệu huỳnh quang bay màu dần theo thời gian…

- Lai trên khuẩn lạc

Quy trình thực hiện chung

1 Mỗi khuẩn lạc sẽ để lại vài tế bào vi khuẩn trên màng lai

2 Màng lai sau đó sẽ được xử lí bằng NaOH để làm vỡ tế bào vi khẩn và làm biến tínhDNA

3 Việc cố định DNA trên màng và thao tác lai diễn biến theo cá bước tương tự như ởcác phương pháp lai trên pha rắn khác

4 Kết quả phóng xạ tự ghi của dấu ấn cho phép xác định dòng vi khuẩn cần tìn trên hộppetri ban đầu Dòng này sẽ được thu nhận và phân tích

ra các plaque (vết tan ) có dạng hình tròn chu vi khoảng 2-3 mm có màu sáng trên thảm vikhuẩn (bacterial lawn) của đĩa agar

Các phage được trộn với các tế bào E.coli trong môi trương nuôi rồi dàn mỏng(plating) lên dĩa petri trong bottom agar (nuôi cấy top agar) Sau khi ủ qua đêm ở 370C, các

tế bào vi khuẩn mọc nên thảm vi khuẩn, ở trên đó các vùng bị nhiễm phage hình thành cácvết trong, do hiện tượng sinh tan vi khuẩn của phage, gọi là vết tan.

Các vector, như mô tả ở trên, thường chứa các gen chỉ thị cho phép chọn lọc những tếbào vật chủ mang vector (thể biến nạp) thông thường các chỉ thị này là gen kháng sinh vàcác tế bào biến nạp sinh trưởng trên môi trường chứa kháng sinh tương ứng

Ngoài ra, các vector còn chứa các gen bổ sung để phân biệt các tế bào biến nạp chứađoạn chèn của DNA ngoại lai với các tế bào chứa các vector tự tái tạo lại vòng

Một dòng chứa các chuỗi DNA quan tâm đặc biệt có thể được xác định bởi lai khuẩn lạc.một lương nhỏ khuẩn lạc biến nạp nhỏ hặcvết tan được chuyển lên màng nitrocellulose hoặcnylon đã được phủ lên trên đĩa agar trước đó DNA được biến tính và cố định trên màngbằng cách đun nóng hoặc chiếu tia cực tím, và sau đó được lai trong đệm chứa mẫu dò đượcđánh dấu đồng vị phóng xạ có trình tự bổ sung một phần của chuỗi được xác định

Gần đây, một phương pháp sàng lọc khác được thiết kế theo hướng này các khuẩnlạc vi khuẩn hoặc nấm men được nhặt riêng rẽ và chấm ngay ngắn thành hang lên mànghoặc trong giếng của đĩa microtiter Mỗi dòng có thể được xác định bằng tọa độ đường kẻriêng rẽ của nó So với các phương pháp truyền thống, phương pháp này dễ dàng hơn trongviệc tự động hóa, sắp xếp và đối chiếu số liệu giữa các phòng thí nghiệm khác

- Lai trên tế bào và mô

Mục đích

Trong tế bào và mô, các RNA, đặc biệt là các mRNA có sự phân bố không gian xácđịnh Sự phân bố không gian này liên quan đến chức năng, sự điều hòa biểu hiện cũng nhưtương tác giữa mRNA với các thành phần khác của tế bào và mô Nghiên cứu trên mRNA đãtách chiết và tinh sạch không cho phép thu nhận các thông tin vừa kể Trong trường hợp đó,người ta thường sử dụng phương pháp lai trên tế bào và mô

Mô được xử lí bằng phương pháp mô học (cố định, khử nước ; tẩm parafin, cắt thànhnhững lát mỏng (7 đến 10 micromet trải trên lame) Kết quả được đọc trực tiếp trên lamenhờ kính hiển vi

Ứng dụng

Đối tượng nghiên cứu có tổ chức phức tạp, bao gồm nhiều tập hợp tế bào khác nhaunhư não bộ Ở đây người ta có thể định chính xác vị trí và sự phân bố của mRNA trong mộtnhóm tế bào chuyên biệt của tổ chức Các thông tin này sẽ góp phần vào việc xác định vaitrò của mRNA trong tổ chức đó

Các phương pháp miễn dịch tế bào cho phép xác định 1 protein chuyên biệt thông quakháng thể đặc trưng của nó Khi phối hợp phương pháp mhiễn dịch tế bào và lai tại chỗ,người ta sẽ phát hiện đồng thời mRNA và proteincủa nó ; từ đó, xác định được mối tươngquan giữa các hoạt động phiên mã và dịch mã của cùng một gen,

Bằng cách lai nhiều lát cắt liên tục (có cấu trúc gần như đồng nhất) với nhiều mẫu dòkhác nhau, người ta có thể xác định vị trí, sự phân bố và tương tác giữa các mRNA cùngtham gia vào một quá trìng sống

Hiện nay, kỹ thuật đánh dấu bằng mẫu dò bằng hóa chất đã có nhiều tiến bộ rất lớn.Điều này đã tạo những bước nhảy vọt rất lớn cho các phương pháp lai tại chỗ, đặc biệt là chophép quan sát đồng thời nhiều tập hợp phân tử lai khác nhau do các mẫu dò được đánh dấubằng các hóa chất cho nhiều màu khác nhau

5.3 Ứng dụng của phương pháp lai phân tử

a Một con thoi sinh học mới – tRNA

Nghiên cứu RNA không phải là một điều mới mẻ trong lĩnh vực sinh học phân tử,nhưng chỉ kể từ khi “kỷ nguyên RNA” được thiết lập chừng mười năm trở lại đây, các nhàsinh học đã chứng kiến nhiều khám phá ngọan mục liên quan đến RNA Các bằng chứngtrước đây cho thấy tRNA (transfer RNA–RNA vận chuyển) được tạo ra trong nhân sau đóđược tống xuất ra khỏi nhân chỉ một lần duy nhất Nhưng sự trưởng thành và quá trìnhchuyển vận của nó từ nhân ra tế bào chất thật sự không đơn giản như trước nay người ta vẫnnghĩ, thực tế nó phức tạp hơn rất nhiều

Trên tờ Science (Vol 309, Issue 5731, 140-142, 1 July 2005), nhóm tác giả TohruYoshihisa đã cho tho thấy các tRNA trưởng thành trong tế bào chất đã chủ động quay trở lạinhân nơi mà chúng được sinh ra Các tác giả sử dụng kỹ thuật lai tại chỗ có sự hỗ trợ chấtphát hùynh quang (fluorescence in situ hybridization) để lần theo sự di chuyển của chúngtrong nấm men Hơn nữa quá trình tái xâm nhập của tRNA vào nhân này là một quá trìnhphụ thuộc năng lượng

b Trong y học

Ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong lĩnh vực y học có nhiều thuận lợi hơncác phương pháp cổ điển vẫn dùng Đối với các tác nhân gây bệnh khó nuôi cấy hay khôngthể nuôi cấy thì kỹ thuật sinh học phân tử là giải pháp duy nhất, chẳng hạn Chlamydia,Brucella, viêm gan B Việc tạo dòng một gen dùng làm đầu dò đơn giản hơn việc sản xuấtkháng thể đặc hiệu, hơn nữa với một đầu dò người ta có thể phát hiện tất cả các kiểu huyếtthanh

Đặc biệt phương pháp lai tại chỗ còn cho phép xác định trực tiếp virus trên lát cắtsinh thiết Đối với các tác nhân vi khuẩn, đã có nhiều bộ kit chẩn đoán sinh học phân tửđược thương mại hóa cho các loài: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacteriumpneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Salmonella Đối với cáctác nhân ký sinh trùng, người ta cũng đã thành công trong chẩn đoán Plasmodium,Schistosoma, Trypanosoma, Toxoplasma, Leishmania bằng lai phân tử

Trong lĩnh vực y học, dùng phương pháp này với những con thú cần để thực thửnghiệm việc trị bệnh cho người Nếu một loài thú được tìm thấy có sự di truyền tương đồngvới người qua việc lai DNA, có khả năng rằng những phương pháp chữa bệnh cho ngườiđược khám phá bởi việc thực hiện những cuộc phẫu thuật dựa trên kinh nghiệm về nhữngloài thú

c Trong nông nghiệp

Phương pháp chẩn đoán bằng lai phân tử không chỉ giới hạn trong y học mà nó cònđược ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp Chẩn đoán các virus gây bệnh thực vật có ýnghĩa quan trọng trong bảo vệ cây trồng Ví dụ: phát hiện các viroid ở thực vật, vì chúngkhông có vỏ protein nên không thể phát hiện bằng các kỹ thuật miễn nhiễm như ELISA.Chẩn đoán các bệnh di truyền Cho đến nay, người ta đã biết được hàng trăm bệnh di truyền

do gen lặn Các bệnh này hầu như chưa có cách chữa trị, hiện chỉ hy vọng liệu pháp gen.Chiến lược hiện nay ở nhiều nước là dự phòng

Trong ngành thủy sản, dùng phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) để chẩnđoán bệnh virus đốm trắng của tôm.

d Trong ngành thực phẩm

Dùng phương pháp lai phân tử để kiểm tra thực phẩm biến đổi gen: DNA được chiếtxuất từ mô, sau quá trình xử lý sẽ đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ Các tín hiệuthông tin về kết quả lai DNA, sẽ được phản ánh trong DNA microarry (một cảm biến sinhhọc) Từ kết quả thu được trên DNA microarry sẽ cho phép xác định sự đột biến gen trongcác mẫu thực phẩm

6 Giải trình tự nucleotide

Thông tin di truyền của mọi cơ thể sinh vật được chứa đựng trong phân tử có tên là DNA(acid deoxynucleic), đó là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn được tạo thành từ bốn loạinucleotide gồm A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine) Các nucleotide nàynối tiếp nhau theo một trình tự xác định, và khác nhau ở từng loài, thậm chí ở từng các thể.Giải trình tự DNA là kỹ thuật giúp xác định sự sắp xếp của bốn loại nucleotide A, T, C, Gtrên phân tử DNA, nhờ đó nghiên cứu được đặc điểm di truyền ở mức độ sinh học phân tử

Ý nghĩa: Giúp xác định vị trí của gen trên NST, cho phép kết luận về bản chất của gen Có ý

nghĩa trong việc tìm hiểu những chức năng cấu trúc của gen cũng như các dòng gen

6.1 Phương pháp hoá học của Maxam và Gilber

Vào năm 1977, hai nhà khoa học người Mỹ Allan Maxam và Walter Gilbert đã phátminh ra một phương pháp hóa học có thể xác định được trình tự các nucleotide trong chuỗiDNA

- Sử dụng hoá chất để phân huỷ DNA ở các vị trí bazơ đặc hiệu, tạo ra các đoạn cóchiều dài khác nhau 1 nucleotit

 Theo phương pháp này để giải trình tự DNA thì trước hết phân tử DNA được đánhdấu bằng đồng vị phóng xạ 32P ở đầu 5’

Hình 10: Phương pháp hoá học của Maxam và Gilber

 Sau đó chúng được chia thành 4 nhóm, mỗi nhóm sẽ xử lý hóa chất khác nhau nhằmlàm biến đổi đặc trưng một loại nucleotide và cắt phân tử DNA ngay tại nucleotide đó Bốnnhóm bị tác động bao gồm: G, A+G, T+C, và C

Hoá chất tác dụng Bazơ bị đứt gãy

 Các đoạn này được phân tách trên gel polyacrylamide và hiển thị bằng kỹ thuật phóng

xạ tự ghi Từ kết quả phóng xạ tự ghi của bốn nhóm trên có thể xác định được vị trí của bốnloại nucleotide trong chuỗi DNA

Bảng đọc kết quả trình tự theo phươngpháp Maxam và Gilber

Phương pháp hóa học xác địnhtrình tự DNA của Maxam và Gilbert trênthực tế không phải dễ thực hiện vì cầnphải xác định khá nhiều thông số tối ưucho thí nghiệm, trong đó khó nhất là phảixác định được nồng độ giới hạn của cácchất hóa học sao cho khi xử lý mẫu DNAthì trên mỗi đoạn DNA chỉ có một base bị biến đổi Chính vì sự phức tạp này, phương phápMaxam-Gilber hiện nay ít được sử dụng,

mà thay vào đó các nhà khoa học dùng

phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm

vượt trội hơn

6.2 Phương pháp enzyme của Sanger

Nguyên lý: Dựa vào sự tổng hợp

mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ

hoạt động của enzyme DNA Polymerase Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotid(ddNTP) và các deoxynucleotid thông thường.

- Cũng như dNTP, didNTP được kết hợp vào chuỗi bằng cách hình thành liên kếtphosphodiester tại đầu cuối C-5 Tuy nhiên, didNTP thiếu một nhóm -OH ở đầu C-3′ cầnthiết cho việc hình thành liên kết với nucleotide kế tiếp Điều này có nghĩa là việc thêmnucleotide mới tiếp vào sau vị trí của didNTP sẽ không thực hiện được:

 Dựa vào đó, Sanger thiết lập 4

phản ứng diễn ra tại 4 lọ thí nghiệm

riêng biệt – từ đó có thể truy ra thông tin

về trật tự liên kết của các nucleotides

trong template strand Mỗi lọ phản ứng

gồm: 1 template DNA (giống nhau cho

cả 4 lọ), 1 primer ngắn (là chuỗi gồm

khoảng 20 nucleotides – đề làm “mồi”

cho quá trình gắn kết nucleotide vào tiếp

– cũng giống nhau cho cả 4 lọ), DNA polymerase III (chất xúc tác cho quá trình tổng hợpnucleotide strand), và hỗn hợp chứa 4 loại dNTPs tự do – dATP, dGTP, dTTP, dCTP –(trong đó một loại được đánh nhãn phóng xạ hoặc được nhuộm màu huỳnh quang tùy vào lọ,

ví dụ: lọ 1 thì có dATP được đánh nhãn phóng xạ, lọ 2 thì có dGTP được đá được đánh nhãnphóng xạ)

 Sau đó, mỗi loại didNTP – A, T, C, hoặc G – được thêm vào mỗi lọ thí nghiệm độclập ở trên (ví dụ: lọ 1 thì được thêm didNTP Adenine, lọ 2 thì được thêm didNTPCytosine…) Với các

nguyên liệu nêu trên, quá

trình tổng hợp ra nucleotide

strand mới sẽ được diễn ra

trên mỗi lọ Nó sẽ dừng lại

khi có một didNTP được

gắn vào Do đó, chiều dài

của DNA strand mới là ngẫu

nhiên và dài ngắn khác nhau ở mỗi lọ phản ứng Nồng độ (concentration) của didNTP đượcthêm vào thấp hơn rất nhiều so với các dNTP có sẵn –> giúp đảm bảo là DNA strand tạo ra

đủ dài

Lưu ý là phân tử DNA tồn tại ở dạng double strands, do đó để có DNA template, ta cần

bẻ gãy liên kết hydrogen bonds (giữa 2 strands) Để tách chúng ra, ta nung bằng nhiệt độ,

hydrogen bonds sẽ nhanh chóng đứt gãy, primer sẽ có dịp gắn vào DNA template tương ứngvới nó (Chú ý là với một primer xác định, chỉ có 1 strand là có thể làm template).

 Quá trình phản ứng, lấy lọ 1 là nơi có DNA strand mới kết thúc bằng didATP làm ví

dụ

 Tại lọ 1: Ban đầu, phân tử

double-strand DNA tách thành 2

dải riêng biệt tại gần 100độ

(near-boiling temperature) Vì ở nhiệt độ

cao, chuyển động động học

(kinetic motion) của phân tử DNA

giúp phá hủy liên kết hydrogen

(liên kết yếu) giúp giữ hai DNA

strands với nhau Khi nhiệt độ

giảm lại, primer sẽ gắn vào template DNA theo qui luật bắt cặp (base-pairing) Kornberg đãchứng minh rằng primer là cần thiết để DNA polymerase bắt đầu quá trình replication

 Phản ứng tạo DNA strand mới sẽ diễn ra tới khi didNTP Adenine gắn vào thì chuỗikhông thể dài thêm được nữa Quá trình tổng hợp sẽ bị ngắt (terminated) và ta có một chuỗiDNA bổ sung (complement DNA strand) với kích thước bị giới hạn, nên ta gọi là DNAfragments Như vậy, tùy thuộc vào thời điểm didNTP Adenine gắn vào, DNA fragments thuđược sẽ có chiều dài dài ngắn khác nhau Trong lọ 1, ở hình vẽ dưới, didATP (màu tím), ởcác lần TN khác nhau, ta thu được các DNA fragments với các chiều dài khác nhau

Lưu ý: DNA polymerase không phân biệt giữa dNTPs và didNTPs Bên cạnh các

nucleotides bình thường là thành phần của DNA fragment, sẽ có các nucleotide được đánh nhãn phóng xạ

electrophoresis sẽ giúp 4 strands di chuyển từ cực (-) sang cực (+)