CHUYÊN đề hệ THỐNG lý THUYẾT và bài tập về CÔNG NGHỆ ADN

- Nhân dòng gen nhằm hai mục đích: để tạo ra nhiều bản sao của một gen đặc thù và để tạo ra một sản phẩm protein Câu 2: Một trong những công cụ không thể thiếu của công nghệ gen là enzim

HỆ THỐNG LÝ THUYẾT VÀ BÀI TẬP VỀ CÔNG NGHỆ ADN

PHẦN I – MỞ ĐẦU

I LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Dựa trên hai nền tảng cơ bản là hóa sinh học và di truyền học, cùng với sự phát triểnnhanh chóng của công nghệ hiện đại, sinh học phân tử ra đời tác động toàn diện đến nhiềungành khoa học và đời sống con người Trong nghiên cứu sinh học phân tử, thực nghiệmthao tác với ADN mà cơ bản là công nghệ ADN tái tổ hợp giữa vai trò then chốt Trong các

kì thi học sinh giỏi Quốc gia và các câu hỏi thi Olympic học các nước, Olympic Sinh họcquốc tế thì những nội dung kiến thức của liên quan đến công nghệ ADN tái tổ hợp đóng vaitrò quan trọng và là một trong các kiến thức quan trọng trong các đề thi

Với mục đích chuẩn bị nội dung dạy ôn tập phần ứng dụng di truyền học cho ĐộiTuyển thi HSG Sinh học Quốc gia cũng như để trau dồi kiến thức cho bản thân cũng như đểthảo luận kiến thức về ứng dụng di truyền học với các đồng nghiệp tôi thực hiện viết chuyên

đề “Hệ thống hóa kiến thức và tập bài tập vông nghệ ADN”

Như mục đích đã nói ban đầu, là chuẩn bị nội dung cho dạy ôn Đội tuyển Sinh họcthi HSG Quốc gia, nên tôi không chỉ giới thiệu kiến thức lý thuyết mà tôi hệ thống các kiếnthức lý thuyết liên quan đến công nghệ ADN dưới dạng các câu hỏi và mỗi câu hỏi đều cóhướng dẫn trả lời cụ thể Đồng thời tôi cũng sưu tầm bài tập vầ công nghệ ADN Tôi hiệu

hy vọng chuyên đề này là tài hữu ích cho tôi, cho các bạn đồng nghiệp và cho các em họcsinh yêu thích môn Sinh học

II MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI

- Hệ thống hóa kiến thức về công nghệ ADN tái tổ hợp dưới dạng các câu hỏi và có hướngdẫn trả lời

- Xây dựng hệ thống các bài tập liên quan đến công nghệ ADN tái tổ hợp và các kĩ thuật ditruyền hiện đại để vừa củng cố kiến thức lí thuyết vừa rèn luyện kĩ năng trả lời câu hỏi bàitập học sinh

- Quá trình tạo ra nhiều bản sao của một gen gọi là nhân dòng gen

- Để nhân dòng gen trong phòng thí nghiệm cần những thao tác sau đây:

+ Phân lập plasmit từ vi khuẩn.

+ Cài vào đó gen cần nhân dòng Plasmit lúc này chứa phân từ ADN tái tổ hợp

+ Plasmit chứa phân từ ADN tái tổ hợp được đưa trở lại tế bào vi khuẩn tạo nên một vikhuẩn tái tổ hợp

+ Tế bào vi khuẩn tái tổ hợp được cho sinh sản qua nhiều lần phân bào Nhờ thu được mộtlượng lớn ADN tái tổ hợp

- Nhân dòng gen nhằm hai mục đích: để tạo ra nhiều bản sao của một gen đặc thù và để tạo

ra một sản phẩm protein

Câu 2: Một trong những công cụ không thể thiếu của công nghệ gen là enzim giới hạn Thế nào là enzim giới hạn? Enzim giới hạn cần có những đặc tính nào? Nêu các ứng dụng của enzim giới hạn?

- Enzim giới hạn là các enzim có thể nhận ra một trình tự ADN ngắn nhất định, được gọi là

vị trí giới hạn, và cắt cả hai mạch tại một điểm chính xác tại vị trí giới hạn

- Các enzim giới hạn cần có hai đặc tính:

+ Nhận biết một trình tự đặc hiệu trên ADN gọi là vị trí giới hạn

+ Cắt trong phân tử ADN tại vị trí đặc hiệu

- Các ứng dụng của enzim giới hạn:

+ Là công cụ không thể thiếu của công nghệ gen để tạo AND tái tổ hợp

+ Sử dụng trong phân tích ADN: Hầu hết các ADN trong tự nhiên có kích thước rất lớn,chứa hàng trăm hoặc hang ngàn gen Vì vậy để phân lập và phân tích từng gen, người taphải cắt các phân tử ADN kích thước lớn thành các đoạn nhỏ Công việc này thực được hiệnnhờ enzim giới hạn

+ Sử dụng nzim giới hạn kết hợp với diện di giúp so sánh hai phân tử ADN từ đó xác định

vị trí xảy ra đột biến

Câu 3: Các enzim giới hạn gồm những loại nào? Các enzim giới hạn được phân lập trong các tế bào vi khuẩn Nêu ý nghĩa của sự tồn tại của các enzim này và tại sao các ADN của các tế bào vi khuẩn đó không bị cắt bởi các enzim cắt giới hạn đó.

- Dựa vào trình tự nhận biết, vị trí cắt, và cofactor được yêu cầu, người ta chia enzim giớihạn thành bốn loại như bảng sau đây:

Loại Enzyme Đặc tính

- Vị trí cắt thì có một khoảng cách khác nhau từ vị trí nhận biết

Kiểu II - Trình tự nhận biết đặc hiệu- Vị trí cắt trong hoặc gần với trình tự nhận biết

- Tạo đầu 5′ phosphate và đầu 3′ hydroxyl ở vị trí cắt

Kiểu III - Trình tự nhận biết hai phần theo hướng ngược chiều- Vị trí cắt có một khoảng cách đặc hiệu với một trình tự nhận biết

- Yêu cầu ATP

- Vị trí cắt cách khoảng 30 bp tính từ vị trí nhận biết

Trong bốn loại trên, loại dung phổ biến nhất là loại II vì trình tự cắt ADN tại vị trí đặc hiệungay tại vị trí giới hạn, còn các loại khác cắt ADN cách vị trí giới hạn một số nucleotit xác định.Các vị trí cắt của enzim nhóm II này thường gồm 4-8 bp, thường có tính đối xứng và điểmcắt trong trình tự giới hạn.

Ví dụ:

EcoRI: có trình tự cắt giới hạn là 5’-GAATTC-3’

HindIII có trình tự cắt giới hạn là 5’-AAGCTT-3’

Sau3AI có trình tự cắt giới hạn là 5’-GATC-3’

NotI có trình tự cắt giới hạn là 5’-GCGGCCGC-3’

- Các enzim giới hạn không chỉ khác nhau về trình tự giới hạn mà còn khác nhau về cách cắtphân tử ADN

+ Cắt đầu tù (cắt đầu bằng): ví dụ enzim Sau3AI.

+ Cắt đầu dính: ví dụ các enzim: EcoRI, HindIII, NotI

Các enzim cắt đầu dính được ưu tiên sử dụng trong tạo ADN tái tổ hợp hơn vì khi trộn cácđoạn ADN, các đoạn đầu dính bắt cặp với nhau theo nguyên lí của Chargaff

- Các enzim giới hạn được phân lập trong các tế bào vi khuẩn Sở dĩ các tế bào vi khuẩn cócác enzim giới hạn là để chống lại sự lây nhiễm các phage hoặc các ADN ngoại lai Trong tếbào vi khuẩn, trên ADN của nó có các trình tự giới hạn nhưng các adenine và cytosine tạicác trình tự nhận biết được metyl hóa nên tránh khỏi sự nhận biết của các enzim giới hạn

Câu 4: Để nhân dòng gen, người ta có thể sử dụng các loại vector nào, ưu điểm của của các vector nhân dòng đó là gì?

- Sử dụng plasmit làm vector nhân dòng: các plasmit của vi khuẩn thường được sử dụng làmvector nhân dòng vì các nguyên nhân sau đây:

+ Chúng dẽ dàng phân lập từ tế bào vi khuẩn, dê thao tác để tạo ADN tái tổ hợp bằng việccài vào đó một đoạn ADN ngoại lai và được đưa trở lại tế bào vi khuẩn

+ Chúng có thể nhân lên độc lập với sự nhân lên của ADN tế bào chủ do các plasmit có cáctrình tự khởi đầu tái bản độc lập với trình tự khởi đầu tái bản của ADN vùng nhân

+ Các plasmit vi khuẩn mang ADN tái tổ hợp có thể nhân lên nhanh chóng nhờ tốc độ sinhsản cao của tế bào chủ

+ Mỗi dòng plamit có thể có nhiều trình tự nhận biết của enzim giới hạn nên có thể gắn vào

đó nhiều gen khác nhau

- Sử dụng thực khuẩn thể làm vector chuyển gen: Các đoạn ADN ngoại lai có thể nối vào hệgen của phage sau khi nó được cắt tỉa bớt những gen không quan trọng đối với phage, giốngnhư ghép vào plasmit nhờ một enzim giới hạn và một ADN ligase Quá trình lây nhiễm bìnhthường cho phép sản sinh ra các hạt virut mới, mỗi loại mang một đoạn ADN ngoại lai.Một ưu điểm khác nữa của việc sử dụng phage là có thể mang các đoạn cài có kích thước lớnhơn (25kb) trong khi một plasmit vi khuẩn chỉ có thể mang đoạn cài kích thước nhỏ hơn 12kb

- Sử dụng nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (BAC) làm vector chuyển gen: Là cácplasmit được cắt tỉa bớt sao cho chỉ còn những gen thiết yếu làm giảm kích thước của vectornhờ đó có thể cài vào đó đoạn ADN kích thước lớn hơn (200-300kb) Trong thư viện gen,việc sử dụng các nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn giúp giảm thiểu tối đa các dòng tế bàocần có trong thư viện hên gen

- Sử dụng nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men (YAC) làm công cụ nhân dòng gen YAC kếthợp các trình tự thiết yếu của một NST sinh vật nhân thực tách ra từ nấm men (một trình tựkhởi đầu tái bản, một tâm động và hai đầu mút) cùng với đoạn cài là đoạn ADN ngoại lai.Các YAC hoạt động như một NST trong nguyên phân và có thể mang một đoạn ADN dàihơn rất nhiều so với plasmit đồng thời có trình tự điều hòa hoạt động cho các gen của sinhvật nhân thực và có thể có những biến đổi phù hợp sau dịch mã như gắn thêm các nhóm lipithoặc cacbohydrat, điều này không thể xảy ra ở các tế bào vi khuẩn.

Câu 5: Sử dụng vector đê nhân dòng gen trong tế bào, tuy nhiên hiện nay người ta còn

sử dụng nhân dòng gen trong ống nghiệm: Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) Nêu ưu điểm và nhược điểm của PCR và giải thích tại sao PRC có nhiều ứng dụng rộng rãi nhưng không thể thay thế được nhân dòng gen bằng vector?

- Nhân dòng ADN trong tế bào vẫn là phương pháp tốt nhất để chuẩn bị một số lượng lớncủa một gen hay một trình tự ADN nhất định nào đó Tuy nhiên trong một số trường hợpnghười ta phải sửu dụng phản ứng chuỗi trùng hợp vì các lí do sau đây:

+ Khi nguồi ADN không đủ hoặc bị pha tạp, người ta bắt buộc pahir sử dụng phản ứng PCR

để nhân dòng các gen là kĩ thuật nhanh và có tính đặc hiệu cao hơn trước khi các đoạn ADNđược cài vào vector

+ Phản ứng PCR cho phép tạo ra số lượng lớn bản sao trong một khoảng thời gian ngắn mộtcách dễ dàng

+ Với tính đặc hiệu và tốc độ nhanh, chỉ cần một lượng rất nhỏ có trong vật liệu khởi đầu là

có thể nhân dòng ngay cả khi ADN đã bị phân hủy một phần, miễn chỉ cần có một vài phân

tử còn chứa trình tự đích nguyên vẹn

- Mặc dù có ưu thế về tốc độ và tính đặc hiệu, song PCR vẫn không thể thay thế được việcnhân dòng gen nhờ các tế bào mỗi khi một gen nào đó cần với số lượng lớn, nguyên nhân là:+ Trong phản ứng PCR, do không có các en zim sửa sai nên lỗi sao chép đôi khi hay xảy ra,chính vì vậy, khi PCR dùng để cung cấp những đoạn ADN cho nhân dòng gen thì các dòngthu được sẽ được giải trình tự để chọn dòng tế bào mang đoạn cài không chứa lỗi

+ Khi mục tiêu không đơn thuần là nhân dòng gen mà là sản phẩm protein thì bắt buộc phảinhân dòng gen trong tế bào nhờ các vector

II Các ứng dụng của công nghệ gen- công nghệ ADN trong nghiên cứu

1 Công nghệ ADN cho phép nghiên cứu trình tự, sự biểu hiện và chức năng của gen Câu 1: Các kỹ thuật để xác định trình tự của gen? Hãy giải thích cơ sở và ứng dụng của các kỹ thuật này?

a Điện di gel và thẩm tách Southern

- Cơ sở: Do các phân tử axit nucleic mang điện âm trên các gốc phosphate p chúng nênchúng luôn di chuyển về cực âm của điện trường Khi chúng di chuyển, các sợi polimer củagel ngăn cản mạng hơn đối với các sợi ADN dài hơn Do đó điện di trên gel giúp phân táchcác phân tử ADN mạch thẳng thành các băng điện di, trong đó mỗi băng sẽ bao gồm cácphân tử có chiều dài giống nhau

- Ứng dụng:

+ Dùng để phân tích các đoạn giới hạn, chúng có thể nhanh chóng cung cấp thong tin vềtrình tự ADN: Trong kiểu phân tích này, người ta cắt cac phân tử ADN bằng enzim giớihạn, sau đó các đoạn ADN được phân tách trên gel điện di, nó tạo nên một kiểu bang đặctrưng cho phân tử ADN gốc ban đầu được cắt bởi loại enzim giới hạn nhất định

+ Dùng để chuẩn bị mẫu tinh sạch chứa các đoạn ADN riêng biệt nếu như bang ADN quan tâm

có thể phân tách rõ ràng khỏi các băng còn lại do có thể thu hồi ADN nguyên vẹn từ gel điện di.+ Dùng để so sánh hai phân tử ADN khác nhau chẳng hạn như hai alen của một gen Mộtenzim giới hạn nhận ra một trình tự nucleotit đặc thù, thậm chí chỉ cần thay đổi mộtnucleotit trong vị trí giới hạn cũng đủ cho nó không bị cắt bởi một enzim giới hạn, ví dụ:bệnh hồng cầu hình liểm do một đột biến đơn nucleotit nằm trong trinh tự giới hạn của gen

β-globin Khi dung Kết quả là gen bình thường enzim giới hạn là DdeI bị cắt thành một

đoạn lớn, một đoạn 175bp và một đoạn 201bp, còn alen đột biến chỉ bị cắt thành hai đoạn376bp và đoạn lớn (hình minh họa dưới đây)

+ Nếu vật liệu ban đầu không phải là các alen được tinh sạch ví dụ muốn xác định mộtngười liệu một người có phải có kiểu gen dị hợp tử về bệnh hồng cầu hình liểm hay không,người ta sử dụng phương pháp lai Southern trong đó kết hợp giữa điện di và axit nucleic,

cho phép chúng ta xác định các bang điện di mang gen β-globin.

Nguyên lí của phương pháp này giống lai nucleic để sàng lọc tìm ra các chủng vi khuẩn.Trong phương pháp này, mẫu dò là thường là một đoạn phân tử ADN mạch đơn đánh dấuphóng xạ có trình tự bổ sung với các gen được quan tâm

b Giải trình tự AND bằng phương pháp kết thúc chuỗi dideoxy

- Cơ sở: Phương pháp này tổng hợp trên một tập hợp các mạch ADN có trình tự bổ sung vớicác đoạn AND gốc Mỗi mạch được bắt đầu từ một số mồi giống nhau và kết thúc bởi một dideoxynucleotit (ddNTP), một nucleotit được biến đổi Sự lắp ráp của ddNTP làm dừng quá trình kéo dài mạch ADN vì nó thiếu 3’OH là vị trí đề nucleotit phía sau gắn vào Trong tập hợp các mạch AND được tổng hợp, mỗi một vị trí nucleotit đọc theo trình tự gốc được thể hiện qua các mạch được kết thúc tại vị trí đó nhờ một ddNTP Nhờ môĩ loại ddNTP được gắn vào một gốc huỳnh quang khác nhau, nên dễ dàng xác định được nucleotit kết thúc ở mỗi mạch được tổng hợp mới, từ đó suy ra toàn bộ trình tự của mạch gốc

- Ứng dụng: Giải trình tự gen cho phép các nhà nghiên cứu so sánh trực tiếp gen đó với các gen khác đã biết về chức năng từ đó có thể tìm hiểu chức năng của một gen nào đó

2 Công nghệ ADN phân tích sự biểu hiện gen

Câu 2: Giả sử đã nhân dòng được một gen nào đó, muốn tìm hiểu gen đó thay đổi như thế nào trong quá trình phát triển phôi của động vật, người ta có thể sử dụng phương

pháp thẩm tách Northern hoặc phản ứng chuổi trùng hợp phiên mã ngược (RT-PRC) hoăc sử dụng phương pháp lai in situ Hãy phân biệt các phương pháp này?

- Phương pháp thẩm tách Northern dựa trên tiến hành điện di các mẫu mARN tổng số tách

chiết từ phôi động vật ở các giai đoạn khác nhau trong quá trình phát triển rồi chuyển đếnmàng nitrocellulose và cho các phân từ trên màng lai với một mẫu dò đánh dấu nhận biếtđặc hiệu mARN của gen đó, sau đó chụp ảnh huỳnh quang Nếu bang mARN được tìm thấy

ở một giai đoanh phát triển nhất định, thì có thể giả thiết rằng protein của gen biểu hiệnchức năng trong các sự kiện diễn ra trong giai đoạn đó

- Phương pháp phản ứng chuỗi trùng hợp phiên mã ngược (RT-PRC): Việc phân tích biểu

hiện của gen đã nhân dòng bằng phương pháp RT-PCR cũng bắt đầu từ tách chiết mARNtổng số sau đó sử dụng enzim phiên mã ngược để tổng hợp cADN, phân tử này dung làmkhuôn cho phản ứng PCR bằng việc dùng cặp mồi đăc hiệu với gen đã được nhân dòng Khisản phẩm của PCR được chạy trên gel điện di, các bản sao của vùng được khuếch đại đượcquan sát thấy như các bang, nhưng chúng chỉ có mặt ở các mẫu mà ban đầu có sắn mARNcủa gen nhân dòng

- Phương pháp lai in situ để xác định loiaj mô hay tế bào nào biểu hiện những gen nhất địnhtrên một cơ thể nguyên vẹn có các phân tử mARN đặc thù, bằng việc tiến hành lai các mẫu

dò đánh dấu tại chỗ Các mẫu dò khác nhau có thể được đánh dấu bằng các thuốc nhuộmkhác nhau, nhờ đó có thể xác định về khả năng biểu hiện của gen nhân dòng

3 Ứng dụng công nghệ AND trong xác định chức năng của gen

Câu 3: Hãy trình bày cách để nghiên cứu xác định chức năng của gen?

Để xác định chức năng của một gen đã xác định được, các nhà khoa học làm bất hoạt gen đó

và theo dõi hậu quả trong tế bào và cơ thể Các nhà khoa học có thể làm bất hoạt gen theohai cách sau:

- Cách 1: Sử dụng phương pháp tạo đột biến invitro trên gen nhân dòng, sau đó đưa gen độtbiến trở lại tế bào theo cách làm bất hoạt bản sao bình thường của gen đó trong tế bào Nếuđột biến được đưa vào làm thay đổi hoặc làm hỏng chức năng sản phẩm của gen, thì kiểuhình của tế bào đột biến có thể phản ánh chức năng của protein bình thường đã bị mất

- Cách 2: Làm bất hoạt sư biểu hiện gen bằng sử dụng ARN can thiệp (ARNi): Sử dụng sợikép ARN tổng hợp hóa học có trình tự bắt cặp với một gen nhất định để kích hoạt sự pháhủy mARN của gen hoặc để ức chế dịch mã

III Ứng dụng thực tiễn của công nghệ ADN

Hãy trình bày các ứng dụng của công nghệ ADN trong y học, trong làm sạch môi trường và trong nông nghiệp?

1 Trong y học

- Công nghệ ADN trong chẩn đoán bệnh

+ Công nghệ ADN dùng trong chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm, đặc biệt là dung kỹ thuậtPCR và các mẫu dò axit nucleic để theo dõi các tác nhân gây bệnh

Ví dụ: Dựa trên sự hiểu rõ trình tự hệ gen của HIV, sử dụng kỹ thuật RT-PCR dung để nhânbản và phát hiện ARN của HIV trong các mẫu máu hoặc mô sinh phẩm

+ Chẩn đoán các rối loạn di truyền bằng cách sử dụng phương pháp PCR với các cặp mồi cógen đích liên quan tới các rối loạn di truyền Sau đó giải trình tự của các gen để phát hiện cóhay không các đột biến gây bệnh Bằng phương pháp này có thể chẩn đoán được rối loạn ditruyền trước khi sinh

- Công nghệ ADN trong liệu pháp gen: Đưa một gen bình thường vào tế bào xô ma của môsai hỏng Thông thường, các tế bào tủy xương thường là các tế bào tiếp nhận liệu pháp gen

vì các tế bào tủy xương là các tế bào có khả năng phân chia

- Công nghệ ADN trong sản xuất dược phẩm: sản xuất các phân tử nhỏ làm thuốc, sản xuấtcác protein đơn bào

2 Trong làm sạch mô trường

Các nhà khoa học chuyển gen có thể chuyển hóa các hợp chất quan trọng từ một vi khuẩnsinh sản chậm sang vi khuẩn sinh sản nhanh Các vi khuẩn chuyển gen này được sử dụng để

xủ lí các vấn đề về môi trường, ví dụ nhiều vi khuẩn có thể chiết xuất được các kim loạinặng dùng trong công nghiệp khai hoáng đồng thời giúp làm sạch các chất độc hại còn lạisau hoạt động khai khoáng Hiện nay, các nhà khoa học đang cố gắng cải biến di truyền củacác vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất hydrocacbon chứa clo và các hợp chấtgây hại khác

3 Trong nông nghiệp

- Trong ngành chăn nuôi: công nghệ ADN cho phép tạo ra các động vật chuyển gen giúptăng nhanh hiệu quả của công tác chọn, tạo và nhân giống vật nuôi Ví dụ: các nhag khoahọc có thể xác định và nhân dòng một gen giúp tăng cường phát triển của cơ ở một gia súcnào đó, rồi chuyển sang một gia súc khác

- Trong tạo giống ở thực vật:Vector sử dụng phổ biến nhất để chuyển gen vào tế bào thực

vật là Ti plasmit có nguồn gốc từ các sinh vật đất Agrobacterium tumefaciens Plasmit này

có khả năng kết hợp một phân đoạn của ADN của nó, được gọi là T-ADN, vào ADN nhiễmsắc thể của tế bào cây chủ

Kỹ thuật di truyền nhanh chóng thay thế các kĩ thuật chọn, tạo giống truyền thống, đặc biệtđối với các tính trạng có giá trị cao như kháng sâu bệnh hay kháng thuốc diệt cỏ hoặc nhữnggiống cây trồng có khả năng chống chịu cao

Kỹ thuật di truyền cón có tiềm năng lớn giúp cải thiện giá trị dinh dưỡng của các loài câytrồng, ví dụ các nhà khoa học đã thành công trong tạo ra giống lúa “vàng” có khả năng tổnghợp β-caroten, tiền chất của vitamin A giúp phòng chống thiếu hụt vitamin A gây nên bệnhkhô mắt và gây giảm thị lực của rất nhiều người trên thế giới đặc biệt ở khu vực châu Phi vàĐông Nam Á

B HỆ THỐNG CÁC BÀI TẬP VỀ CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP

1 Bài tập liên quan đến enzim giới hạn

1.1 Xác định số điểm cắt của enzim giới hạn

- Phân tử ADN mạch vòng có n điểm giới hạn sẽ tạo ra n đoạn khi xử lý bằng enzym giới hạn.

- ADN mạch thẳng có n điểm giới hạn sẽ tạo ra n+1 đoạn.

Ví dụ 1: Khi cắt plasmid pBR322 bằng HaeI, có 11 đoạn ADN được tạo ra Khi cắt nó bằng BamHI, chỉ có một đoạn được tạo ra Có bao nhiêu đIểm giới hạn cho mỗi loại

enzym?

Trả lời:

ADN của plasmid có mạch vòng Vậy có 11 điểm giới hạn cho HaeI và 1 cho BamHI.

Ví dụ 2: Một phân tử ADN mạch thẳng được cắt bằng EcoRI và tạo ra các đoạn 3 kb,

4,2 kb và 5 kb Hãy xác định bản đồ giới hạn của nó.

Trả lời:

Có ba đoạn, vậy phải có 2 điểm giới hạn Các điểm đó có thể phân bố như sau:

1.2 Đột biến ở điểm giới hạn có thể làm mất một hoặc một số đoạn và làm xuất hiện một đoạn mới, dài hơn.

Ví dụ 1: Khi xử lý một gen (đoạn ADN) bằng BgIII, nó tạo ra các đoạn 1,7 kb, 2,1 kb và 3,2 kb.

- Khi xử lý đoạn ADN tách ra từ một đột biến không tổng hợp được enzym của gen

này bằng BgIII, người ta chỉ thấy hai đoạn 3,2 và 3,8 kb Điều gì đã xảy ra?

- Khi xử lý ADN được tách ra từ một đột biến khác bằng BgIII, người ta thấy xuất

hiện các đoạn 1,3 kb, 1,7 kb, 1,9 kb và 2,1 kb Hãy giải thích kết quả thu được.

Trả lời:

- Đột biến đã làm thay đổi một hoặc một số bazơ tại điểm nhận biết của BgIII, và, như vậy,

enzym chỉ cắt phân tử một lần Đoạn mới là tổng của hai đoạn 1,7 và 2,1 kb, cho thấy haiđoạn này nằm kề nhau trên phân tử ADN bình thường

- Chúng ta thấy các đoạn 1,7 và 2,1 kb cùng có cả ở ADN bình thường và ADN đột biến.Điểm giới hạn sinh ra hai đoạn này phải còn nguyên vẹn trên ADN đột biến Hai đoạn cònlại, 1,3 và 1,9 kb có tổng là 3,2 kb, đúng bằng đoạn bị mất Vậy, một điểm giới hạn mới đãđược tạo ra ở ADN gốc

1.3 Nếu một đoạn do enzym giới hạn tạo ra cùng xuất hiện khi xử lý bằng một enzym

và bằng hỗn hợp hai enzym thì đoạn đó không có điểm giới hạn cho enzym thứ hai.

Ví dụ1: Một phân tử ADN mạch thẳng được xử lý bằng các enzym dưới đây và kết quả như sau:

EcoRI: 1,7; 2,1; 3,2 kb.

HaeI: 1,0; 1,4; 4,6 kb.

Hỗn hợp: 0,7; 1,0; 1,4; 1,8; 2,1 kb.

- Những đoạn giới hạn nào của EcoRI không chứa các điểm giới hạn của HaeI và ngược lại?

- Hãy xây dựng bản đò giới hạn của phân tử ADN trên?

Trả lời:

- Đoạn 2,1 của EcoRI cũng xuất hiện trong “hỗn hợp”, vậy nó không có điểm giới hạn của HaeI Các đoạn khác của EcoRI mất đi khi xử lý bằng cả hai enzym, nên chúng phải chứa các điểm giới hạn của HaeI Tương tự, các đoạn 1,0 và 1,4 của HaeI đều không chứa các

điểm giới hạn của EcoRI

- Vì 1,0 + 0,7 = 1,7, và, 1,4 + 1,8 = 3,2, nên đoạn 1,7 của EcoRI phải có điểm giới hạn cho HaeI từ một đầu:

E 1,0 H 0,7 E

- Tương tự, đoạn 3,2 cũng phải có điểm giới hạn cho doạn HaeI dài 1,8 từ một đầu:

E 1,8 H 1,4 E

- Khi xắp xếp trật tự có thể có cho các đoạn EcoRI:

- Khi thêm các điểm giới hạn đã biết của HaeI vào đúng vị trí Một trong những trật tự có

thể là:

-Chúng ta nhận được đoạn 3,1 kb khi xử lý ADN chỉ bằng HaeI Nếu trật tự là 2,1; 0,7; 1,0; 1,4 và 1,8, thì khi xử lý bằng HaeI phải tạo ra đoạn 2,8 kb Vậy, đoạn 1,7 kb không nằm ở

giữa Nếu đoạn 3,2 kb nằm ở giữa, chúng ta phải gặp, hoặc đoạn 3,5 kb, hoặc đoạn 3,9 kb

khi xử lý bằng HaeI Điều đó không xảy ra, vậy trật tự phải là:

-Nếu điểm giới hạn của HaeI là 0,7 kb từ một đầu, thì ta phải gặp đoạn 0,7 kb khi xử lý ADN bằng HaeI Biện luận tương tự cho đoạn 1,8 kb.

2 Bài tập liên quan đến ADN tái tổ hợp

Ví dụ 1: Một plasmid chứa các gen kháng ampicillin và tetracycline Plasmid đó chứa một

điểm giới hạn nằm trong gen tetracycline Plasmid đó được xử lý với enzym giới hạn trộn

với ADN ngoại lai, rồi đem ủ với E coli Bằng cách nào bạn có thể tách được các tế bào có

plasmid lai?

Trả lời:

Cấy các tế bào trên môi trường có chứa ampicillin và chọn các tế bào sinh trưởng được Các

tế bào có plasmid sẽ có gen ampicillin trọn vẹn Cấy sao chép các tế bào này vào môi trườngchứa tetracycline Những tế bào không sinh trưởng được là những tế bào mang các gen cóđoạn xen Trở lại với các tế bào gốc trên môi trường chứa ampicillin để lấy ra những tế bàokhông sinh trưởng được trên môi trường chứa tetracycline

Ví dụ 2: Xử lý ADN hệ gen người với EcoRI rồi phân tách các đoạn tạo ra bằng điện

di Các băng ADN được chuyển sang màng lọc rồi ủ với cADN mã hoá insulin đánh dấu phóng xạ Kết quả như sau: (* = các băng có đánh dấu phóng xạ).

3 Bài tập liên quan đến giải trình tự gen

Ví dụ 1: Một phân tử ADN được giải trình tự bằng phương pháp Maxam-Gilbert Hãy xác

định trình tự ADN từ bản gen thu được sau:

Trả lời: Khi đọc trình tự của gen bắt đầu đọc tại đầu 5’ ở dưới cùng Vậy trình tự sẽ là

5’CCAGTTCA 3’ Đó là trình tự của sợi mới được tổng hợp Vậy trình tự sợi khuôn là 3’GGTCAAGT 5’.

phóng xạ tự ghi, người ta thu được kết quả như sau:

Hãy vẽ bản đồ giới hạn của đoạn 8,5kb?

Trả lời:

- Khi đánh dấu đầu đầu 5’ với 32P và sử dụng phóng xạ tự ghi thì chỉ những đoạn ADN cóđầu 5’32P mới hiện lên trên ảnh và những đoạn ngắn nhất sẽ chạy xa nhất.

- Đánh số thứ tự các đoạn từ trên xuống dưới ta được hình ảnh như sau:

- Theo ảnh phóng xạ tự ghi ta thấy vạch trên cùng ở cả hai bên là điểm cắt của EcoRI

+ Khi cắt bằng HaeIII tạo ra 7 đoạn vậy HaeIII có 7 điểm cắt, còn cắt bằng HindII tạo ra 5 đoạn vậy HindII có 5 điểm cắt.

+ Ở cả hai ảnh đều có các vạch trùng nhau (vạch 1 và 4) chứng tỏ HeaIII và HindII có vị trícắt sát nhau do đó độ dài các đoạn ADN xấp xỉ nhau Vì thế tại những điểm đó có khó cóthể xác định enzim nào cắt trước, enzim nào cắt sau

- Đoạn ngắn nhất là đoạn 10 do đó đoạn này được cắt bởi HaeIII và vị trí cắt gần trình tựđánh dấu nhất

- Vậy Trình tự vị trí cắt của enzim đọc từ đầu đánh dấu là: 32P5’ HaeIII → HindII → HaeIII→ HindII → HindII → HaeIII → Hin dII → Hae III →HaeIII → Hin dII→ Hae III → EcoRI

Lưu ý: Phần gạch chân có thể đảo vị trí của hai enzim.

Bài 2; Một phân tử ADN, sau khi được tinh sạch cần lập bản đồ vị trí cắt giới hạn Sau

khi cắt bằng enzim EcoRI thu được 4 đoạn đánh số thứ tự 1,2,3,4 Sau đó cắt mỗi đoạn này bằng HindII, ta thấy doạn 3 tạo ra hai đoạn con là 31 và 3 2 Đoạn 2 tạo ra 3 đoạn con (2 1 ,2 2 và 2 3) Nếu làm ngược lại, sau khi cắt phân tử ban đầu với HindII, nhận được 4 mảnh A,B,C và D Sau đó xử lí các mảnh này với EcoRI, mảnh D tạo ra các

đoạn 1 và 3 1 , mảnh A tạo ra 3 2 và 2 1 , mảnh B tạo ra 2 3 và 4 Mảnh C giống đoạn 2 2 Hãy vẽ bản đồ giới hạn của phân tử ADN này.

Trả lời:

- Sau khi cắt bằng enzim EcoRI thu được 4 đoạn đánh số thứ tự 1,2,3,4 Minh họa như sau

(1) EcoRI (2) EcoRI (3) EcoRI (4)

- Khi tiếp tục xử lí bằng HindII thu được kết quả minh họa như sau:

(1)EcoRI (21 ) HindII (22 )HindII (23) EcoRI (31) HindII (32) EcoRI (4)

-Khi làm ngược lại, sau khi cắt phân tử ban đầu với HindII, nhận được 4 mảnh A,B,C và D Sau đó xử lí các mảnh này với EcoRI, mảnh D tạo ra các đoạn 1 và 31, nghĩa là đoạn (1) và(3) ban đầu nằm gần nhau hơn Và đoạn D nằm đầu tiên.

- Mảnh A tạo ra 32 và 21, suy ra đoạn 2 nằm sau đoạn 3, đoạn A tiếp giáp đoạn D

- Mảnh B tạo ra 23 và 4, là mảnh sau cùng

Mảnh C giống đoạn 22 Nằm giữa A và B

Vậy bản đồ giới hạn của ADN như sau:

Bài 3: Một nhiễm sắc thể dạng thẳng của phage được đánh dấu với với 32 P và cắt với các enzim giới hạn.

- Cắt bằng EcoRI tạo ra các đoạn có kích thước 2,9; 4,5; 6,2; 7,4 và 8,0 kb Bản phóng

xạ tự ghi cho thấy dấu phóng xạ xuất hiện tại băng 6,2 và 8,0 kb.

- Cắt bằng BamHI tạo ra các đoạn có kích thước 6,0; 10,1 và 12,9 kb Bản phóng xạ tự

ghi cho thấy dấu phóng xạ xuất hiện tại băng 6,0 và 10,1 kb.

- Cắt đồng thời bằng EcoRI BamHI tạo ra các đoạn có kích thước 1,0; 2,0; 2,9; 3,5;

6,0; 6,2 và 7,4 kb.

a Vẽ bản đồ giới hạn của phân tử AND trên

b Mẫu dò phóng xạ được tạo thành từ gen X của phage được tạo dòng đưa vào bản Southern blot từ sản phẩm cắt với các enzim đơn phân tử ADN phage Bản phóng xạ

tự ghi cho thấy mẫu dò phóng xạ lai với các băng có kích thước 4,5; 10,1 và 12,9 kb Xác định vị trí của gen X trên bản đồ cắt giới hạn.

Trả lời:

a

- Cắt bằng EcoRI tạo ra các đoạn có kích thước 2,9; 4,5; 6,2; 7,4 và 8,0 kb Bản phóng xạ tự

ghi cho thấy dấu phóng xạ xuất hiện tại băng 6,2 và 8,0 kb Vậy đoạn 6,2 và 8,0 là các đoạn

có 32P và nằm ở hai đầu phân tử

- Cắt bằng BamHI tạo ra các đoạn có kích thước 6,0; 10,1 và 12,9 kb Bản phóng xạ tự ghi

cho thấy dấu phóng xạ xuất hiện tại băng 6,0 và 10,1 kb Vậy đoạn 6,0 và 10,1 là các đoạn

có 32P và nằm ở hai đầu phân tử

- Mặt khác ta thấy đoạn 8,0=6,0 + 2,0

- Cắt đồng thời bằng EcoRI BamHI tạo ra các đoạn có kích thước 1,0; 2,0; 2,9; 3,5; 6,0; 6,2

và 7,4 kb

Ta có: 4,5= 1,0+3,5; vậy trong đoạn 4,5 tạo ra của EcoRI có 1 điểm cắt của BamHI

12,9= 2,0+7,4+3,5 vậy trong đoạn 12,9 tạo ra của BamHI có 1 điểm cắt của EcoRI