Nghiên Cứu Phá Vách Bào Tử Nấm Linh Chi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU PHÁ VÁCH BÀO TỬ NẤM LINH CHI Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện: TRẦN MINH HOÀNG MSSV: 1211100082 Lớp: 12DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2016 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu đồ án hoàn toàn trung thực, chưa sử dụng để cơng bố cơng trình khác Các thơng tin, tài liệu trích dẫn luận án ghi rõ nguồn gốc TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2016 Sinh viên thực Trần Minh Hoàng iii Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi LỜI CẢM ƠN Trong thực tế khơng có thành cơng mà khơng có giúp đỡ từ người khác Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, đánh dấu kết thúc quãng thời gian học tập Trường Đại học Công nghệ TP.HCM nhận giúp đỡ nhiều từ gia đình, thầy cơ, bạn bè suốt bốn năm qua Trước hết xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến trường Đại học Công nghệ TP.HCM tạo hội cho học tập trường Cám ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trường tận tình truyền đạt kiến thức tâm huyết trình giảng dạy suốt năm qua Xin gửi lời cám ơn đến TS Nguyễn Thị Hai cung cấp chủng nấm Trichoderma harzianum T2; cô Đỗ Thị Tuyến cung cấp chất β-glucan enzyme cellulase C20032; Ths Nguyễn Thị Ngọc Yến cung cấp bào tử nấm Linh chi Cám ơn q thầy phụ trách quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường tạo điều kiện làm việc cho tơi nhóm thực đồ án Đặc biệt xin chân thành cám ơn TS Nguyễn Hồi Hương, người tận tình hướng dẫn truyền đạt kinh nghiệm để tơi hồn thành đồ án tốt nghiệp này, khơng có giúp đỡ cô chắn đồ án tốt nghiệp tơi gặp nhiều thiếu sót Qua đây, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè có giúp đỡ, động viên suốt q trình học tập hồn thành đồ án tốt nghiệp Tôi xin chân thành cám ơn! Sinh viên thực Trần Minh Hoàng iv Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT x DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết đề tài .1 Tình hình nghiên cứu Mục đích đề tài Mục tiêu đề tài .3 Phương pháp nghiên cứu Kết đạt ban đầu Hạn chế đề tài CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .4 1.1 Giới thiệu nấm Linh chi 1.1.1 Phân loại .4 1.1.1.1 Phân loại theo khoa học 1.1.1.2 Phân loại theo hình dạng màu sắc 1.1.2 Đặc điểm sinh học nấm Linh chi 1.1.2.1 Cuống nấm 1.1.2.2 Mũ nấm 1.1.2.3 Thụ tầng .10 1.1.2.4 Bào tử nấm Linh chi 10 1.1.3 Chu kì sống nấm Linh chi 14 1.1.4 Điều kiện sinh trưởng phát triển nấm Linh chi .15 1.1.4.1 Dinh dưỡng 15 1.1.4.2 Nhiệt độ .15 1.1.4.3 Độ ẩm 15 1.1.4.5 Khơng khí 15 v Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 1.1.4.6 Ánh sáng 16 1.1.4.7 Trị số pH 16 1.1.5 Thành phần dược tính nấm Linh chi 16 1.1.5.1 Thành phần dược tính tổng quát .16 1.1.5.2 Triterpenoid .17 1.1.5.3 Hợp chất saponin 21 1.1.5.4 Những thành phần khác 22 1.1.6 Công dụng nấm Linh chi 22 1.1.6.1 Phòng ngừa ung thư 22 1.1.6.2 Tăng cường khả miễn dịch .23 1.1.6.3 Khả chống oxy hóa 24 1.1.6.4 Điều trị bệnh đái tháo đường 24 1.1.7 Nghiên cứu bào tử nấm Linh chi 24 1.2 Giới thiệu nấm Trichoderma 27 1.2.1 Phân loại .27 1.2.2 Lịch sử phát triển .27 1.2.3.1 Đặc điểm hình thái .28 1.2.3.2 Đặc điểm sinh trưởng 29 1.2.3.3 Các sản phẩm trao đổi chất Trichoderma 31 1.2.4 Các hệ enzyme nấm Trichoderma sinh tổng hợp .31 1.2.4.1 Hệ enzyme chitinase 31 1.2.4.2 Hệ enzyme β – glucanase 33 1.2.4.3 Hệ enzyme cellulase 34 1.2.4.4 Hệ enzyme protease .35 1.3 Giới thiệu enzyme phá vách tế bào 36 1.3.1 Enzyme phá vách tế bào thực vật 37 1.3.2 Enzyme Cellulase C20032 41 CHƯƠNG : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 vi Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 2.1 Vật liệu – Thiết bị - Hóa chất 44 2.1.1 Vật liệu .44 2.1.2 Nơi tiến hành .44 2.1.3 Thời gian thực 44 2.1.4 Thiết bị dụng cụ 44 2.1.4.1 Thiết bị 44 2.1.4.2 Dụng cụ 45 2.1.5 Hóa chất – Mơi trường sử dụng .45 2.1.5.1 Hóa chất 45 2.1.5.2 Môi trường sử dụng 47 2.2 Phương pháp nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 49 2.3 Phương pháp nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 thu enzyme dịch nuôi cấy 53 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma harzianum môi trường thạch PDA .54 2.3.2 Thu dịch enzyme nuôi cấy phương pháp tăng sinh môi trường lỏng 54 2.3.3 Thu dịch enzyme nuôi cấy phương pháp tăng sinh môi trường rắn .54 2.4 Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu enzyme chitinase dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 enzyme chế phẩm C20032 56 2.4.1 Dựng đường chuẩn glucosamine .56 2.4.2 Xác định hoạt độ enzyme chitinase pH nhiệt độ khác 56 2.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme celullase dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum chế phẩm enzyme C20032 57 2.5.1 Dựng đường chuẩn glucose .57 2.5.2 Phản ứng xác định hoạt tính cellulase .58 2.6 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease dịch ni cấy chế phầm C20032 phương pháp Anson cải tiến 59 2.6.1 Dựng đường chuẩn tyrosine .59 vii Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 2.6.2 Phản ứng xác định hoạt tính protease .60 2.7 Phương pháp xác định hoạt tính β-glucanase dịch ni cấy chế phầm C20032 60 2.7.1 Dựng đường chuẩn β-glucan 61 2.7.2 Phản ứng xác định hoạt tính β-glucanase 61 2.8 Phương pháp xác định protein dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum chế phầm C20032 phương pháp Bradford .62 2.8.1 Dựng đường chuẩn Albumin 62 2.8.2 Xác định hàm lượng protein mẫu 62 2.9 Khảo sát phá vách bào tử nấm Linh chi dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum enzyme chế phẩm C20032 64 2.9.1 Phương pháp xác định tỉ lệ enzyme phối hợp dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum chế phẩm C20032 64 2.9.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử buồng đếm hồng cầu 65 2.9.3 Phương pháp xác định độ ẩm bào tử nấm Linh chi 67 2.9.4 Phương pháp thay đổi nồng độ chế phẩm C20032 kết hợp với dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum .68 CHƯƠNG : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 70 3.1 Kết định tính enzyme chitinase, β-glucanase, protease chế phẩm C20032 10% dịch nuôi cấy .70 3.1.1 Kết định tính enzyme chế phẩm C20032 10% 70 3.1.2 Kết định tính enzyme dịch ni cấy nấm Trichoderma harzianum môi trường nuôi cấy lỏng 71 3.1.3 Kết định tính enzyme dịch ni cấy nấm Trichoderma harzianum môi trường nuôi cấy rắn .72 3.2 Kết định lượng hoạt tính enzyme dịch ni cấy nấm Trichoderma harzianum nuôi cấy môi trường lỏng nuôi cấy môi trường rắn chế phẩm C20032 10% 73 3.3 Kết khảo sát hoạt tính enzyme chitinase dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum chế phẩm C20032 75 3.3.1 Kết khảo sát hoạt tính enzyme chitinase dịch nuôi cấy nấm viii Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Trichoderma harzianum điều kiện nhiệt độ pH khác 75 3.3.2 Kết khảo sát hoạt tính enzyme chitinase có mặt chế phẩm C20032 10% .76 3.4 Kết khảo sát tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp dịch nuôi cấy chế phẩm C20032 10% 77 3.5 Kết tỉ lệ bào tử nấm linh chi bị phá vỡ thay đổi nồng độ chế phẩm C20032 kết hợp dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum .81 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 85 4.1 Kết luận 85 4.2 Kiến nghị .87 TÀI LIỆU THAM KHẢO 87 PHỤ LỤC ix Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT PDA: Potato Dextrose Agar EC: Enzyme cellulase C20032 DNC: Dịch nuôi cấy G lucidum: Ganoderma lucidum T.harzianum: Trichoderma harzianum T hamatum: Trichoderma hamatum T polysporum: Trichoderma polysporum T viride: Trichoderma viride T reesei: Trichoderma reeisei B.cinerea: Botrytis cinerea T hamatum: Trichoderma hamatum T virens: Trichoderma virens BSA: Bovine serum albumin DD: Dung dịch TCA: Trichloacetic acid FC: Folin – Ciocalteu CMC: Sodium carboxymethyl cellulose DNS: acid – – hydroxyl – 3,5 – dinitrobenzoic MT: Mơi trường ĐC: Đối chứng TB: Trung bình NT: nghiệm thức x Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi DANH MỤC BẢNG STT Bảng Nội dung Trang 1.1 Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn mẫu vật khác 11 1.2 So sánh khả ức chế ung thư vú phận trạng thái khác nấm Linh chi (2,5mg/ml) 25 1.3 Một số loại enzyme thủy phân T harzianum 36 1.4 Một số enzyme thương mại thành phần enzyme chế phẩm 40 1.5 Thông tin chế phẩm enzyme cellulase C20032 Novozyme 41 2.1 Bảng dựng đường chuẩn glucosamine 56 2.2 Lập đường chuẩn glucose 58 2.3 Các bước xác định hoạt tính enzyme cellulase (CMCase) 58 2.4 Bảng bổ sung hóa chất dựng đường chuẩn tyrosine 59 10 2.5 Các bước xác định hoạt tính enzyme protease 60 11 2.6 Lập đường chuẩn β-glucan để xác định hoạt tính enzyme β-glucanase 61 12 2.7 Các bước xác định hoạt tính enzyme β-glucanase 61 13 2.8 Dựng đường chuẩn albumin (protein theo Bradford) 62 14 2.9 Bảng bố trí thay đổi tỉ lệ enzyme DNC chế phẩm C20032 10% 65 15 2.10 Bảng bố trí thay đổi nồng độ enzyme C20032 68 16 3.1 Vòng phân giải enzyme có chế phẩm C20032 10% 70 17 3.2 Vòng phân giải enzyme có DNC T harzianum MT nuôi cấy lỏng 72 iv Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi KẾT QUẢ XỬ LÝ ANOVA XỬ LÝ ANOVA ĐẾM HỒNG CẦU TẾ BÀO NGÀY NGÀY VÀ NGÀY 10 VỚI SỰ THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ ENZYME CHẾ PHẨM (10%, 5%, 1%, 0.5%, 0.1%) GIẢI THÍCH NT1: 3.93 U/g DNC + 6.40 U/g EC 10% NT2: 3.93 U/g DNC + 3.20 U/g EC 5% NT3: 3.93 U/g DNC + 0.64 U/g EC 1% NT4: 3.93 U/g DNC + 0.32 U/g EC 0.5% NT5: 3.93 U/g DNC + 0.064 U/g EC 0.1% KẾT QUẢ XỬ LÝ NGÀY The SAS System 19:15 Thursday, June 20, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Ngay4 Values NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 The SAS System 19:15 Thursday, June 20, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 639.1753733 159.7938433 295.07 F F Model 778.5574400 194.6393600 321.16 F F Model 956.2338667 239.0584667 175.57 F Ngay10 956.2338667 239.0584667 175.57 F F NGAY2 58.97836000 14.74459000 27.93 F Model 229.1097733 57.2774433 153.00 F Ngay3 229.1097733 57.2774433 153.00 F Model 470.0384933 117.5096233 135.53 F Ngay4 470.0384933 117.5096233 135.53