Bệnh do nhiễm sán lá gan lớn (Fasciolasis) đang trở thành vấn đề sức khỏe toàn cầu. Trong đó, Việt Nam là một trong những quốc gia có sự lưu h nh bệnh cao nhất. Ở Việt Nam, bệnh gây ra do loài sán Fasciola gigantica. Phương pháp chẩn đoán được sử dụng phổ biến hiện nay là xét nghiệm huyết thanh học phát hiện kháng thể IgG đặc hiệu với sán. Bởi vì IgG tồn tại trong máu trong thời gian d i nên phương pháp n y ít có giá trị trong việc xác định thời điểm bệnh và sau điều trị. Nhằm khắc phục nhược điểm nêu trên của xét nghiệm huyết thanh học, đề tài hướng đến phương pháp phát hiện kháng nguyên protein bài xuất/tiết (protein E/S) của sán trong máu và trong phân bằng cách dùng kháng thể. Mục tiêu đề tài là sử dụng E/S antigen của sán lá gan lớn F. gigantica tạo kháng thể IgG thỏ đặc hiệu cho protein E/S n y. Gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ để tạo được IgG. Sau đó, IgG được tinh chế bằng phương pháp tủa muối Ammonium sulfate 45% và sắc kí ái lực qua cột protein G. Kết quả đã thu được IgG thỏ tinh sạch đặc hiệu cho protein E/S của sán lá gan lớn F. gigantica. Sản phẩm IgG thu được là tiền đề để hướng tới việc chế tạo bộ kit chẩn đoán phát hiện nhiễm bệnh do sán lá gan lớn F. gigantica trên người v động vật thông qua phát hiện kháng nguyên trong máu và trong phân.
Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 34 Tạo kháng thể IgG thỏ kháng protein b i xuất/tiết sán gan lớn Fasciola gigantica ặng Ngọc Kim Thuỳ1, Lê Thị Phương Thảo2, Thái Thị Tuyết Trinh2, Nguyễn Thị Phương2, Nguyễn Hữu Hùng2 Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học, Trường ại học Khoa học Tự nhiên, ại học Quốc gia TP HCM Khoa ông nghệ Sinh học v Môi trường, ại học Nguyễn Tất Th nh nhhung@ntt.edu.vn Tóm tắt Bệnh nhiễm sán gan lớn (Fasciolasis) trở thành vấn đề sức khỏe tồn cầu Trong đó, Việt Nam quốc gia có lưu h nh bệnh cao Ở Việt Nam, bệnh gây loài sán Fasciola gigantica Phương pháp chẩn đoán sử dụng phổ biến xét nghiệm huyết học phát kháng thể IgG đặc hiệu với sán Bởi IgG tồn máu thời gian d i nên phương pháp n y có giá trị việc xác định thời điểm bệnh sau điều trị Nhằm khắc phục nhược điểm nêu xét nghiệm huyết học, đề tài hướng đến phương pháp phát kháng nguyên protein xuất/tiết (protein E/S) sán máu phân cách dùng kháng thể Mục tiêu đề tài sử dụng E/S antigen sán gan lớn F gigantica tạo kháng thể IgG thỏ đặc hiệu cho protein E/S n y Gây đáp ứng miễn dịch thỏ để tạo IgG Sau đó, IgG tinh chế phương pháp tủa muối Ammonium sulfate 45% sắc kí lực qua cột protein G Kết thu IgG thỏ tinh đặc hiệu cho protein E/S sán gan lớn F gigantica Sản phẩm IgG thu tiền đề để hướng tới việc chế tạo kit chẩn đoán phát nhiễm bệnh sán gan lớn F gigantica người v động vật thông qua phát kháng nguyên máu phân Nhận 12.01.2019 ược duyệt 06.06.2019 Cơng bố 20.09.2019 Từ khóa IgG thỏ, protein G, Fasciola gigantica, E/S Ag, chẩn đốn ® 2019 Journal of Science and Technology - NTTU Giới thiệu 91 triệu người tồn giới có nguy nhiễm sán gan lớn (Fascioliasis) v có khoảng 17 triệu người nhiễm bệnh[1] Ở Việt Nam, theo số liệu thống kê Viện Sốt rét – Kí sinh trùng – ôn trùng Qui Nhơn, số người bệnh nhiễm sán gan lớn tăng đột biến năm gần Trong vòng năm (từ 2006 đến 2010), xét nghiệm huyết miễn dịch, có 15 nghìn ca nhiễm sán gan lớn nước m khu vực miền Trung Tây Nguyên chiếm 93% Năm 2011, số ca nhiễm sán gan lớn gần 10 nghìn ca (~30 ca/ngày) tính riêng khu vực miền Trung Tây Nguyên Con số xấp xỉ 70% số năm trước cộng lại (từ 2006 đến 2010) iều cho thấy nhiễm sán gan lớn bệnh cần quan tâm Sán gan lớn cư trú gan v túi mật Từ đó, protein xuất/tiết (E/S-Ag) sán đưa v o máu và/hoặc đường tiêu hóa theo phân (trong trường Đại học Nguyễn Tất Thành hợp E/S-Ag gọi l coproantigen) Do đó, ngo i chẩn đốn huyết tìm kháng thể chẩn đốn tìm E/S-Ag sán mang lại giá trị chẩn đoán sớm chẩn đoán điều trị quan trọng người v động vật[2-4] Thời gian sớm sau bị nhiễm sán, kháng thể mức thấp khó phát Tuy nhiên, sán tiết/bài xuất kháng nguyên vào hệ tuần ho n v đường tiêu hóa giai đoạn sớm kéo dài suốt thời gian kí sinh sán[5] Ở người, giai đoạn nhiễm cấp tính (60 ng y đầu sau nhiễm), E/S-Ag tìm thấy hệ tuần hoàn phân Sau thời gian này, trứng sán bắt đầu tìm thấy với tăng dần E/S-Ag phân E/S-Ag máu không tìm thấy giai đoạn mạn tính chúng bị trung hòa kháng thể bệnh nhân tự hình thành máu Sau dùng thuốc diệt sán (ví dụ: triclabendazole), sán chết ngừng tiết/bài xuất kháng nguyên[4] Hai tuần sau điều trị thuốc, E/S-Ag khơng tìm thấy Ngược lại với chẩn đốn huyết tìm kháng thể, hiệu giá kháng thể giảm lâu kéo d i năm sau điều trị thuốc Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số diệt sán iều n y gây khó khăn việc đánh giá hiệu điều trị tốn cho bệnh nhân hưa có nghiên cứu n o nước tạo kháng thể IgG động vật để ứng dụng tạo kít phát E/S-Ag sán gan máu phân bệnh nhân ề tài bước đầu tạo kháng thể đa dòng thỏ, thử nghiệm kháng thể có để hướng tới tạo kít chẩn đốn Vật liệu v phương pháp nghiên cứu 2.1 ộng vật thí nghiệm Thỏ có trọng lượng ≥ kg/con mua từ trại thỏ Củ hi v nuôi nh động vật Khoa ông nghệ Sinh học v Môi trường, Trường ại học Nguyễn Tất Th nh 2.2 Thu nhận sán gan lớn Sán thu nhận từ lò giết mổ trâu bò huyện ức Hòa, tỉnh Long An Sán nằm ống mật gan bị xơ hóa Rạch ống mật để bắt sán Sán rửa nhanh lần dung dịch P S pH 7.4 để loại bỏ dịch mật máu Sau sán thu nhận ni giữ mơi trường RPMI 1640 Sán đưa phòng thí nghiệm v ni tiếp 370C Q trình nuôi cấy kết thúc thời gian 10 kể từ lúc bắt đầu thu sán lò giết mổ Dịch E/S thu nhận cách li tâm với gia tốc 1000g 10 phút Dịch E/S sau tủa muối ammonium sulfate 90% v lưu giữ 40 sử dụng 2.3 Gây đáp ứng miễn dịch thỏ E/S Ag sán dùng gây đáp ứng miễn dịch thỏ theo phác đồ Bảng Mỗi lần tiêm 1ml hỗn hợp huyền phù chứa IgG, chia th nh 40 mũi tiêm da, chia hai bên sống lưng (25μl/mũi) Riêng lần tiêm gây mẫn cảm d nh lại khoảng 200μl hỗn hợp huyền phù để tiêm bắp, vị trí phía đùi chân sau ác mũi tiêm cách 30 ngày Bảng Phác đồ tiêm thỏ với E/S Ag sán Mũi tiêm Mẫn cảm Tăng cường lần Tăng cường lần Tăng cường lần Tăng cường lần * trước tiêm Liều E/S Tá chất Thể tích Ag (µg) máu (ml) 100 FCA 5* 100 FIA 5** 50 FIA 5** 25 FIA 7,5** 20 FIA 50** ** sau tiêm 12 – 14 ngày Máu thỏ sau thu nhận để qua đêm 40 , sau li tâm với gia tốc 3000g 15 phút, thu huyết (HT) Bảo quản huyết -200 , có bổ sung 0.05% sodium azide Kháng thể IgG kháng IgG người kiểm tra kĩ thuật lai phân tử western blot 2.4 Khuếch tán kép thạch (Ouchterlony) Tạo khuôn gel agarose 1.5% PBS chứa 0,05% sodium azide, sau đục lỗ khn để tạo giếng theo hình lục giác giếng trọng tâm Giếng 35 cho E/S Ag với nồng độ 0,35mg/ml ể kiểm tra đáp ứng miễn dịch, cho vào giếng xung quanh huyết thỏ trước gây mẫn cảm huyết sau lần tiêm tăng cường ể kiểm tra hiệu giá kháng thể, cho vào giếng xung quanh huyết pha loãng bậc theo tỉ lệ tăng dần từ 1:2 đến 1:64 ể miếng gel tủ mát 24-48 quan sát tượng kết tủa thạch giếng trung tâm giếng xung quanh 2.5 Xác định hiệu giá kháng thể Sử dụng kĩ thuật ELISA gián tiếp để xác định nồng độ IgG (kháng protein E/S) thích hợp huyết (thỏ chuột) Ủ giếng protein E/S với nồng độ 5µg/ml Na2CO3 pH 9,5 Sau rửa, khóa giếng dung dịch PBS-T chứa 0,25% SA Sau ủ huyết (thỏ chuột) pha loãng theo tỉ lệ tăng dần 1:102, 1:103, … , 1:109 Kháng thể thứ cấp có gắn HRP pha loãng 5000 lần ủ vào giếng sau rửa Cuối phát màu dung dịch TMB dừng phản ứng dung dịch H2SO4, đo độ hấp thu bước sóng 450/620nm 2.6 ịnh lượng protein Lượng IgG thỏ sau tinh chế xác định phương pháp quang phổ đo độ hấp phụ quang IgG bước sóng 280nm Nồng độ protein tính dựa hệ số tắt mole εIgG = 1.35 sau: IgG (mg/ml) = A280*D/Lε, A280 l giá trị OD IgG bước sóng 280nm, D l hệ số pha loãng mẫu, L l chiều d i đường ánh sáng truyền qua mẫu, ε l hệ số tắt mole protein E/S Ag định lượng phương pháp radford 2.7 Tinh chế IgG thỏ Kháng thể IgG (thỏ chuột) huyết lần tiêm cuối thu nhận phương pháp tủa với ammonium sulfate 45% bão hoà (AS 45%) Kiểm tra kết tủa SDS-PAGE Trước tinh chế, cặn tủa chứa IgG loại muối thẩm tích với đệm 20mM sodium phosphate v xác định nồng độ phương pháp quang phổ Tinh chế IgG sắc kí lực qua cột protein G (có lực mạnh với phần Fc IgG) Mẫu nạp vào cột với tốc độ 1ml/phút Sử dụng dung dịch đệm gắn 20mM sodium phosphate, đệm rửa giải 0.1M Glycine-H l, đệm trung hòa 1M Tris-H l ác phân đoạn bám cột không bám cột sau sắc kí dồn mẫu v đặc phương pháp li tâm sử dụng amicon filter unit 10kDa cut-off Kiểm tra kết tinh chế IgG thỏ chuột kháng protein E/S SDS-PAGE 2.8 iện di biến tính (SDS-PAGE) SDS-PAGE dùng để phân tích protein Gel polyacrylamide 12.5% sử dụng Protein sau điện di phát phương pháp nhuộm với oomassie blue Hình ảnh điện di ghi nhận máy quét hình ảnh HP4050 Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 36 Kết v thảo luận 3.1 Gây đáp ứng miễn dịch thỏ Trước gây đáp ứng miễn dịch, thành phần protein E/S Ag sán phân tích điện di SDS-PAGE (Hình 1) Kết cho thấy E/S Ag chứa số thành phần protein, protein có kích thước khoảng 27kDa chiếm phần lớn thạch Ouchterlony (Hình 2) Kết Hình 2A cho thấy sau gây mẫn cảm, kháng thể đặc hiệu E/S Ag hình thành Ở lần tiêm tăng cường (Hình 2B), có tăng dần hiệu giá kháng thể, cụ thể độ pha loãng huyết 1:8 (giếng 3) xuất vạch tủa từ lần tiêm tăng cường lần 3.2 Tinh chế IgG thỏ kháng protein E/S F gigantica Việc tinh chế thực qua bước gồm tủa IgG với dung dịch AS 45% bão hòa v sắc kí lực với protein G Sau tủa IgG, kết SDS-PAGE quan sát gel cho thấy gia tăng tỉ lệ IgG (quan sát chuỗi nặng (~50kDa) chuỗi nhẹ (~25kDa) IgG) hỗn hợp sau tủa so với huyết ban đầu IgG sau tủa với AS 45% đem tinh chế sắc kí lực qua cột protein G Phân tích kết SDS-PAGE cho thấy IgG có độ tinh ước tính khoảng ~95% Khối lượng IgG thu thỏ 26mg/ml huyết Hình Phân tích E/S Ag sán F gigantica SDS-PAGE Phương pháp nhuộm bạc sử dụng Hình 3: Phân tích IgG thỏ sau đáp ứng miễn dịch SDS-PAGE dùng gel poly-acrylamide 12.5% A: Tủa IgG AS 45% bão hoà B: IgG sau sắc kí lực với Protein G Kết luận Hình Phát kháng thể đặc hiệu E/S Ag phản ứng Ouchterlony A: Huyết thỏ trước mẫn cảm (giếng 1, 3, 5) sau mẫn cảm (giếng 2, 4, 6) B: Huyết thỏ sau lần tiêm tăng cường pha loãng bậc từ 1:2 đến 1:64 tương ứng giếng đến Thỏ sau gây đáp ứng miễn dịch theo phác đồ mô tả phần Vật liệu v phương pháp nghiên cứu, kháng thể IgG đặc hiệu kiểm tra phương pháp khuếch tán Đại học Nguyễn Tất Thành Nghiên cứu tạo thành công IgG thỏ đặc hiệu với kháng nguyên E/S F gigantica thu nhận lượng IgG với độ tinh cao (~95%) ước tính SDSPAGE, giữ hoạt tính sau tinh chế ây l kết bước đầu quan trọng có IgG thỏ có hoạt tính Việc biến đổi kháng thể để sử dụng phản ứng ELISA phát E/S Ag cần tiếp tục nghiên cứu Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 37 T i liệu tham khảo Tolan, R.W., Fascioliasis Due to Fasciola hepatica and Fasciola gigantica Infection: An Update on This „Neglected‟ Neglected Tropical Disease LABMEDICINE, 2011 42(2): p 107-116 Ubeira, F.M., et al., MM3-ELISA detection of Fasciola hepatica coproantigens in preserved human stool samples Am J Trop Med Hyg, 2009 81(1): p 156-62 3Rabia, I., H Sabry, and F Nagy, Comparison between Different Immunological Techniques for Detection of Circulating Fasciola Antigen in sheep New York Science Journal, 2010 3: p 34-39 Flanagan, A.M., et al., Standardisation of a coproantigen reduction test (CRT) protocol for the diagnosis of resistance to triclabendazole in Fasciola hepatica Vet Parasitol, 2011 176(1): p 34-42 Espino, A.M., et al., Dynamics of antigenemia and coproantigens during a human Fasciola hepatica outbreak J Clin Microbiol, 1998 36(9): p 2723-6 Production of rabbit IgG antibodies against excretory/sesecretory antigenantigen from Fasciola gigantica Dang Ngoc Kim Thuy1, Le Thi Phuong Thao 2, Thai Thi tuyet Trinh2, Nguyen Thi Phuong2, Nguyen Huu Hung2,* Facultyculty of Biology and Biotechnology, Univeriversity of science, Vietnam National University HCM City Faculty of Biotechnology and Environment, Nguyen Tat Thanh University * nhhung@ntt.edu.vn Abstract Fasciolasis is becoming a global health problem In particular, Vietnam is one of the countries with the highest circulation In Vietnam, the disease is caused by the parasite Fasciola gigantica The most commonly used diagnostic method is serological testing for the detection of fluke-specific IgG antibodies Because IgG exists in the blood for a long time, this method has little value in determining the time of disease development and after treatment In order to overcome the above-mentioned weakness of serological testing, we aim to detect the excretory/secretory antigen (E/S Ag) in blood and feces by using antibodies The objective of this study is to use the F gigantica E/S Ag to produce rabbit IgG IgG was purified using 45% Ammonium sulfate precipitation and G-protein affinity chromatography The IgG obtained is a prerequisite for the development of a diagnostic kit for the detection of F gigantica infection on human and animal through the detection of antigens in blood and feces Keywords Rabbit IgG, protein G, Fasciola gigantica, E/S Ag, diagnosis Đại học Nguyễn Tất Thành ... bước đầu tạo kháng thể đa dòng thỏ, thử nghiệm kháng thể có để hướng tới tạo kít chẩn đốn Vật liệu v phương pháp nghiên cứu 2.1 ộng vật thí nghiệm Thỏ có trọng lượng ≥ kg/con mua từ trại thỏ Củ... tăng cường lần 3.2 Tinh chế IgG thỏ kháng protein E/S F gigantica Việc tinh chế thực qua bước gồm tủa IgG với dung dịch AS 45% bão hòa v sắc kí lực với protein G Sau tủa IgG, kết SDS-PAGE quan sát... cứu tạo thành công IgG thỏ đặc hiệu với kháng nguyên E/S F gigantica thu nhận lượng IgG với độ tinh cao (~95%) ước tính SDSPAGE, giữ hoạt tính sau tinh chế ây l kết bước đầu quan trọng có IgG thỏ