Tạo kháng thể IgG thỏ kháng IgG người

Bài viết này trình bày kết quả tạo và tinh chế IgG thỏ kháng kháng nguyên IgG người bằng các phương pháp như gây đáp ứng miễn dịch cho động vật bằng cách tiêm trong da, tinh sạch kháng thể IgG bằng phương pháp tủa với ammonium sulphate 45% và phương pháp sắc kí ái lực qua cột protein G.

Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 44 Tạo kháng thể IgG thỏ kháng IgG người Thái Thị Tuyết Trinh, Trần Thị Cẩm Tú, Lê Thị Phương Thảo, Nguyễn Hữu Hùng* Khoa Công nghệ Sinh học Môi trường, Đại học Nguyễn Tất Thành * nhhung@ntt.edu.vn Tóm tắt Bài báo trình bày kết tạo tinh chế IgG thỏ kháng kháng nguyên IgG người phương pháp gây đáp ứng miễn dịch cho động vật cách tiêm da, tinh kháng thể IgG phương pháp tủa với ammonium sulphate 45% phương pháp sắc kí lực qua cột protein G Ngồi ra, báo đề cập đến phương pháp kiểm tra hiệu trình gây đáp ứng miễn dịch phương pháp khuếch tán kép thạch (Ouchterlony) Western blot Mục đích việc nghiên cứu tạo tinh kháng thể IgG thỏ kháng kháng nguyên IgG người đạt độ tinh cao, làm tiền đề cho việc phát triển qui trình sản xuất kháng thể tinh nước ứng dụng kit chẩn đoán nhằm phục vụ cho nghiên cứu khoa học xét nghiệm phát bệnh Kết nghiên cứu thu nhận khoảng 80mg kháng thể IgG thỏ kháng IgG người tinh sạch, với độ cao (ước tính > 95% phân tích SDS-PAGE) ® 2018 Journal of Science and Technology - NTTU Giới thiệu Kháng thể động vật đặc hiệu với kháng thể người nguyên liệu dùng kĩ thuật Western Blot kĩ thuật xét nghiệm khác nhằm hỗ trợ chẩn đoán bệnh nghiên cứu Khơng phòng thí nghiệm nghiên cứu miễn dịch, kí sinh trùng,… mà phòng xét nghiệm bệnh viện có nhu cầu sử dụng kháng thể động vật đặc hiệu với kháng thể người Tuy nhiên, kháng thể động vật thường sử dụng mua từ nước ngồi nên có giá thành cao, khó chủ động nguồn cung cấp, gây ảnh hưởng nhiều đến chi phí xét nghiệm gây nhiều hạn chế q trình nghiên cứu Từ đó, việc nghiên cứu phương pháp tạo kháng thể động vật đặc hiệu với kháng thể người Việt Nam vô cấp thiết Việc tạo tinh kháng thể động vật đặc hiệu với kháng thể người Việt Nam khơng mang lại lợi ích kinh tế nói chung mà giúp phát chữa trị bệnh sớm Với lí trên, chúng tơi tiến hành tạo kháng thể IgG thỏ kháng IgG người nhằm tạo nguồn nguyên liệu kháng thể tinh kháng IgG người, từ tạo tiền đề để tiếp tục phát triển sản phẩm ứng dụng chẩn đoán huyết học Đại học Nguyễn Tất Thành Nhận 20.09.2018 Được duyệt 01.12.2018 Cơng bố 25.12.2018 Từ khóa IgG thỏ kháng IgG người, protein G, tinh chế kháng thể, sắc kí lực Vật liệu phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu thực Phòng thí nghiệm Ung thư Tế bào gốc – Bộ môn Công nghệ Sinh học Y dược Khoa Nông nghiệp Công nghệ cao Công nghệ Sinh học Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Huyết người, điều kiện thu nhận: có màu vàng trong, không đục, không tủa xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV… Thỏ đực, khoảng tháng tuổi, trọng lượng 2.2kg mua từ viện Pasteur, Tp Hồ Chí Minh ni nhà động vật Khoa Nông nghiệp Công nghệ cao Công nghệ Sinh học, Đại học Nguyễn Tất Thành 2.1 Tủa huyết với ammonium sulphate 45% Kháng thể IgG huyết người IgG thỏ huyết lần tiêm cuối thu nhận phương pháp tủa với ammonium sulfate 45% bão hoà (AS 45%) [1] Cặn tủa chứa IgG rửa bảo quản AS 45% 40C sử dụng 2.2 Sắc kí lực qua cột protein G Để tinh chế IgG, cặn tủa chứa IgG hồ tan thẩm tích đệm 20mM sodium phosphate [2] nạp qua cột protein G có lực mạnh với phần Fc IgG [3] Mẫu nạp vào cột với tốc độ 1ml/phút (nạp 30mg protein/ml thể tích cột) Sử dụng dung dịch đệm gắn 20mM sodium Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số phosphate; đệm rửa giải 0.1M Glycine-HCl; đệm trung hòa 1M Tris-HCl Các phân đoạn bám cột khơmg bám cột sau sắc kí dồn mẫu đậm đặc phương pháp li tâm sử dụng AMICON filter unit 10 kDa cut-off Mẫu trữ -200C sử dụng 2.3 Gây đáp ứng miễn dịch thỏ IgG người dùng để gây đáp ứng miễn dịch thỏ tinh chế từ huyết người với độ tinh > 95% Phác đồ tiêm gây đáp ứng miễn dịch thỏ mơ tả tóm tắt Bảng Mỗi lần tiêm 1ml hỗn hợp huyền phù chứa IgG, chia thành 40 mũi tiêm da, chia hai bên sống lưng (25μl/mũi) Riêng lần tiêm gây mẫn cảm dành lại khoảng 200μl hỗn hợp huyền phù để tiêm bắp, vị trí phía đùi chân sau Các mũi tiêm cách 30 ngày Máu thỏ sau thu nhận để qua đêm 40C, sau li tâm 3000 x g 15 phút, thu huyết (HT) Bảo quản huyết -200C, có bổ sung 0.05% sodium azide Kháng thể IgG thỏ kháng IgG người kiểm tra kĩ thuật lai phân tử western blot Bảng Phác đồ tiêm thỏ gây đáp ứng miễn dịch Mũi tiêm Liều (µg) Tá chất Thể tích máu (ml) Mẫn cảm 100 FCA 5* Tăng cường lần 100 FIA 5** Tăng cường lần 50 FIA 5** Tăng cường lần 25 FIA 7,5** Tăng cường lần 20 FIA 50** * trước tiêm ** sau tiêm 12 – 14 ngày 2.4 Khuếch tán kép thạch (Ouchterlony) Khuếch tán kép thạch phương pháp hiệu thường áp dụng để kiểm tra hiệu gây đáp ứng miễn dịch độ nhạy phương pháp thấp [2] Trong nghiên cứu này, kĩ thuật khuếch tán kép dùng để kiểm tra đáp ứng mẫn cảm động vật thí nghiệm (thỏ) với kháng nguyên IgG người Nếu động vật thí nghiệm khơng mẫn cảm đáp ứng yếu loại bỏ Kĩ thuật khuếch tán kép có độ nhạy thấp (từ vài chục μg/ml đến vài mg/ml) nên cho phép phân biệt đáp ứng mạnh hay yếu vật Đối với kiểm tra đáp ứng mẫn cảm, cho 10μl huyết trước mẫn cảm xen kẽ với huyết sau tiêm nhắc lần vào giếng xung quanh, giếng cho 20μl IgG người với nồng độ 0.35mg/ml Đối với thử hiệu giá kháng thể, tiến hành pha loãng huyết thỏ theo tỉ lệ 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 Cho 10μl huyết pha loãng vào giếng xung quanh 10μl IgG người vào giếng với nồng độ 0.35mg/ml Sau cho huyết kháng thể vào giếng, đặt miếng gel vào hộp ẩm để tủ mát khoảng 12 – 48 quan sát tượng kết tủa thạch Để gel tiến hành nhuộm gel dung dịch Coomassie Brilliant Blue giải nhuộm dung dịch giải nhuộm (Ethanol 7%, Acetic acid 7%, dH2O) đến 45 miếng gel Hình ảnh kết tủa gel ghi nhận máy quét hình ảnh HP4050 2.5 Điện di biến tính (SDS-PAGE) SDS-PAGE dùng để phân tích huyết thỏ IgG thỏ Gel poly-acrylamide 12.5% sử dụng Protein sau điện di phát phương pháp nhuộm với Coomassie blue Hình ảnh điện di ghi nhận máy quét hình ảnh HP4050 2.6 Kĩ thuật Western Blot Gel chứa protein sau điện di chuyển lên màng lai nitrocellulose có kích thước lỗ 0.45µm hệ thống chuyển màng bán khô (Hoefer) Màng khoá 1% casein đệm TBST (20mM Tris, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5) rửa sau lần đệm TBST 10 phút Màng ủ với huyết thỏ (pha loãng 1000 lần đệm TBST) sau gây đáp ứng miễn dịch với IgG người rửa lại với đệm TBST Màng sau ủ với kháng thể IgG thứ cấp dê (goat anti-rabbit IgG) cộng hợp HRP (Santa Cruz Biotechnology) sau rửa với đệm TBST [4] Để phát phức hợp lai kháng nguyên - kháng thể, màng ủ với dung dịch hoá quang luminol quét thiết bị CDigit Blot Scanner Hình ảnh kết western blot xử lí phần mềm ImageStudioLite Kết thảo luận 3.1 Kết tinh chế IgG người 3.1.1 Tủa với ammonium sulphate 45% Huyết người sau thu nhận tủa dung dịch muối ammonium sulphate bão hòa 45% nhằm tách kháng thể tổng số khỏi hỗn hợp protein huyết Kết tủa kiểm tra điện di SDS – PAGE gel poly-acrylamide 12.5% (Hình 1) mẫu cặn tủa cho thấy xuất chuỗi nặng (50kDa) chuỗi nhẹ (25kDa) phân tử kháng thể Khi so sánh giếng điện di mẫu cặn tủa với mẫu dịch sau tủa huyết ban đầu, dễ nhận thấy albumin (khoảng 66kDa) protein chiếm tỉ lệ lớn huyết người loại khỏi phân đoạn cặn tủa chứa IgG Tuy nhiên, phân đoạn cặn tủa chứa số protein tạp ngồi IgG, cần tiến hành tinh chế thêm để thu IgG người có độ tinh cao Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 46 Hình Kết điện di biến tính SDS – PAGE 12.5% kiểm tra huyết (HT) người tủa ammonium sulphate 45% Protein gel phát nhuộm Coomassie Blue 3.1.2 Sắc kí lực qua cột protein G Sau q trình sắc kí lực qua cột protein G, thu hai phân đoạn Quan sát sắc kí đồ (Hình 2A), phân đoạn chứa protein không bám cột, phân đoạn chiếm tỉ lệ lớn nhiều so với phân đoạn 1, kì vọng chứa protein mục tiêu (IgG) IgG phân đoạn sau sắc kí kiểm tra độ SDS-PAGE Hình 2B thể kết điện di SDS – PAGE gel poly-acrylamide 12.5% IgG điều kiện tự nhiên khơng biến tính (khơng xử lí với βMercaptoethanol, -Mer) biến tính IgG βMercaptoethanol (+Mer) mẫu trước sau sắc kí Kết điện di xử lí mẫu với chất gây biến tính protein β-Mercaptoethanol cho thấy rõ xuất chuỗi nặng chuỗi nhẹ phân tử IgG thể qua hai vạch có kích thước 50kDa 25kDa gel So với mẫu trước sắc kí phân đoạn sau sắc kí đạt độ tinh cao hẳn loại bỏ hầu hết protein tạp Hình Kết sắc kí lực qua cột protein G tinh chế IgG người A – Sắc kí đồ thể phân tách protein sau qua cột B – Điện di SDS-PAGE mẫu trước sau sắc kí xử lí (+Mer) khơng xử lí (-Mer) với Mercaptoethanol Protein gel phát nhuộm Coomassie Blue 3.2 Kết gây đáp ứng miễn dịch thỏ với IgG người 3.2.1 Thỏ trước tiêm mẫn cảm khơng có đáp ứng với kháng nguyên IgG người Phương pháp Western Blot lai IgG người với huyết thỏ trước tiêm áp dụng để kiểm tra có mặt kháng thể thỏ kháng kháng nguyên mẫu huyết trước gây mẫn cảm nhằm xác định hiệu suất khả Đại học Nguyễn Tất Thành tạo kháng thể thỏ gây đáp ứng miễn dịch Quan sát kết lai mẫu huyết thỏ trước gây mẫn cảm với kháng nguyên IgG người (Hình 3), màng lai không xuất vạch IgG người, chứng tỏ huyết thỏ khơng có kháng thể kháng IgG người sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 47 tủa nồng độ huyết 1/16 đến lần TC4 xuất thêm vạch kết tủa nồng độ 1/32 Điều cho thấy kháng thể huyết thỏ sau lần tiêm tăng cường tăng dần lượng lẫn độ đặc hiệu KN IgG người Kết với lí thuyết đáp ứng miễn dịch giúp xác định thời điểm thu nhận kháng thể có chất lượng Hình Kết kiểm tra đáp ứng thỏ với kháng nguyên trước gây mẫn cảm Protein gel phát nhuộm Coomassie Blue 3.2.2 Kết đánh giá chất lượng kháng thể thỏ Hiệu gây đáp ứng miễn dịch thỏ với IgG người đánh giá phương pháp khuếch tán kép thạch (Ouchterlony) Mục đích thử nghiệm kiểm tra đáp ứng mẫn cảm để loại bỏ vật không mẫn cảm đáp ứng yếu với kháng nguyên (KN) gây đáp ứng miễn dịch Kết Hình thể kết tủa phản ứng kháng nguyên – kháng thể Các giếng 1, 3, khơng xuất đường tủa, hay nói cách khác khơng có kháng thể (KT) phản ứng với IgG người khuếch tán từ giếng Ngược lại giếng 2, 4, chứa huyết thỏ sau TC1 có xuất đường tủa với giếng 0, chứng tỏ huyết (HT) thỏ sau tiếp xúc với kháng nguyên xuất KT đặc hiệu tiếp tục thực kĩ thuật trưởng thành lực Hình Kết thử kháng huyết sau lần tiêm tăng cường Giếng 0: kháng nguyên (IgG người) Các giếng 1, 3, 5: huyết thỏ trước mẫn cảm Các giếng 2, 4, 6: huyết thỏ sau tiêm tăng cường lần Hình trình bày đánh giá nồng độ KT đặc hiệu HT thỏ sau lần tiêm tăng cường Ở lần tiêm tăng cường xuất vạch kết tủa KN KT nồng độ từ đến 1/8 Ở lần TC TC3 xuất thêm vạch kết Hình Kết hiệu giá kháng thể thể qua lần tiêm tăng cường: Các giếng từ đến tương ứng với độ pha loãng huyết 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 3.3 Kết tinh chế IgG thỏ kháng IgG người 3.3.1 Tủa huyết với ammonium sulphate 45% Theo kết hiệu giá kháng thể, sử dụng huyết sau lần tiêm TC4 để tinh chế IgG thỏ kháng IgG người Kết điện di biến tính SDS – PAGE gel poly-acrylamide 12.5% (Hình 6B) cho thấy sau trình tủa loại hầu hết protein không mong muốn, thu kháng thể IgG phân đoạn cặn tủa Quan sát giếng cặn tủa AS 45%, dễ dàng nhận diện phân tử IgG với chuỗi nặng 50kDa chuỗi nhẹ 25kDa gel điện di Ngoài ra, quan sát giếng dịch sau tủa thấy có mặt chuỗi nặng chuỗi nhẹ phân tử IgG, với lượng nhỏ Điều chứng tỏ trình tủa HT thỏ muối AS 45% chưa thu toàn KT HT Phân đoạn cặn tủa chứa IgG đồng thời lẫn số protein khác, cần tiếp tục bước tinh chế để thu IgG thỏ tinh 3.3.2 Sắc kí lực qua cột protein G Sắc kí đồ (Hình 6A) cho thấy sau sắc kí thu hai phân đoạn: Phân đoạn có chứa protein không bám cột; phân đoạn chứa protein bám cột, kì vọng chứa IgG tinh Peak 2.1 peak 2.2 sau sắc kí kiểm tra phương pháp điện di biến tính SDS – PAGE gel polyacrylamide 12.5% (Hình 6B), kết điện di cho thấy phương pháp sắc kí qua cột protein G loại protein tạp Quan sát giếng Peak 2.1 không thấy chuỗi nặng chuỗi nhẹ IgG, chứng tỏ q trình sắc kí diễn tốt IgG khơng bị thất Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 48 Hình Kết sắc kí lực qua cột protein G tinh chế IgG người A – Sắc kí đồ thể phân tách protein sau qua cột B – Điện di SDS-PAGE mẫu trước sau sắc kí xử lí với Mercaptoethanol Protein gel phát nhuộm Coomassie Blue 3.3.3 Kiểm tra hoạt tính bắt kháng nguyên IgG thỏ sau tinh chế Khả bắt kháng nguyên IgG thỏ sau tinh chế kiểm tra phương pháp lai Western blot với huyết người Kết lai cho thấy, IgG thỏ sau tinh chế giữ hoạt tính bắt kháng nguyên IgG người, thể vạch chuỗi nặng chuỗi nhẹ IgG người màng lai (Hình 7) Tuy nhiên, sau bước tinh chế, IgG thỏ thu chưa phải kháng thể kháng đặc hiệu IgG người, cần tiếp tục tinh chế để thu IgG đặc hiệu với IgG người Hình Kết kiểm tra hoạt tính IgG thỏ sau tinh chế Lai western blot IgG thỏ sau tinh chế với huyết (HT) người Đại học Nguyễn Tất Thành Như vậy, sau sắc kí qua cột protein G, thu IgG thỏ với độ tinh cao, ước tính khoảng > 95% theo kết điện di (quan sát trực quan) Từ 1ml huyết thỏ ban đầu, sau bước tinh chế gồm tủa muối AS 45% sắc kí lực qua cột protein G, thu 10.97mg IgG tinh Tổng thể tích huyết thỏ thu sau tháng gây đáp ứng miễn dịch 70ml, tức có khoảng 80mg IgG thỏ tinh thu nhận sau kết thúc đề tài Kết luận Với mục tiêu sản xuất kháng thể IgG thỏ kháng kháng nguyên IgG người với độ tinh cao nhằm thay cho nguồn nhập ngoại giảm thiểu tối đa chi phí phát sinh mua từ nước ngồi, chúng tơi thu kết sau: (1) Tinh kháng thể IgG người thành công với độ tinh khoảng 95%, lượng kháng thể IgG thu 5.33mg/ml huyết người (2) Tạo thành công kháng thể IgG thỏ kháng kháng nguyên IgG người (3) Thu nhận 70ml huyết thỏ chứa KT kháng IgG người (4) Tinh thành công kháng thể IgG thỏ kháng kháng nguyên IgG người với độ tinh cao, lượng kháng thể IgG thu 10.97mg/ml huyết thỏ Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 49 Tài liệu tham khảo Purification of Antibodies IgG with Ammonium Sulphate Retrieved 10 August 2017, from vlab.amrita.edu Paul Haney, et al Molecular weight cut-off (MWCO) specifications and rates of buffer exchange with Slide-A-Lyzer Dialysis Devices and Snakeskin Dialysis Tubing Protocol of Antibody Purification Vol GE Healthcare Life Sciences Mahmood Tahrin and Ping-Chang Yang (2012) Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting North American Journal of Medical Sciences, 4(9), 429-434 Ouchterlony Double diffusion – Pattern Retrieved 10August 2017, from vlab.amrita.ed Production of rabbit IgG antibodies against human IgG Thai Thị Tuyet Trinh, Tran Thi Cam Tu, Le Thi Phuong Thao, Nguyen Huu Hung* Faculty of Biotechnology and , Nguyen Tat Thanh University *nhhung@ntt.edu.vn Abstract This paper presented the results on producing rabbit IgG antibodies anti human IgG antigens by intradermal injected immunization and purifying IgG by ammonium sulphate precipitation and protein G affinity chromatography Furthermore, this paper also presented Ouchterlony Double Immunodiffusion Assay and Western Blotting on detecting and quantification of antibodies In this study, we successfully produced anti-human IgG antibodies in the rabbits After purification by protein G affinity chromatography, the antibodies were shown recognise human IgG in the human serum and can be further considered as important reagent for development of serodiagnosis applications Keywords Affinity chromatography, purify IgG, protein G, rabbit IgG anti human IgG Đại học Nguyễn Tất Thành ... lượng kháng thể IgG thu 5.33mg/ml huyết người (2) Tạo thành công kháng thể IgG thỏ kháng kháng nguyên IgG người (3) Thu nhận 70ml huyết thỏ chứa KT kháng IgG người (4) Tinh thành công kháng thể IgG. .. dịch thỏ với IgG người 3.2.1 Thỏ trước tiêm mẫn cảm đáp ứng với kháng nguyên IgG người Phương pháp Western Blot lai IgG người với huyết thỏ trước tiêm áp dụng để kiểm tra có mặt kháng thể thỏ kháng. .. nguyên IgG người, thể vạch chuỗi nặng chuỗi nhẹ IgG người màng lai (Hình 7) Tuy nhiên, sau bước tinh chế, IgG thỏ thu chưa phải kháng thể kháng đặc hiệu IgG người, cần tiếp tục tinh chế để thu IgG