Chế tạo và bước đầu đánh giá sự hình thành phức hợp oxytocin peg bằng các phương pháp hóa sinh

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NHUNG CHẾ TẠO VÀ BƢỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ SỰ HÌNH THÀNH PHỨC HỢP OXYTOCIN-PEG BẰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP HĨA SINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2018 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NHUNG Mã sinh viên: 1301305 CHẾ TẠO VÀ BƢỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ SỰ HÌNH THÀNH PHỨC HỢP OXYTOCIN-PEG BẰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP HÓA SINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn PGS TS Nguyễn Văn Rƣ HVCH Lê Quang Nghị Nơi thực Bộ mơn Hóa sinh Đại học Y Dƣợc Thái Nguyên HÀ NỘI – 2018 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực hồn thành khóa luận này, tơi nhận nhiều quan tâm, động viên giúp đỡ tận tình từ thầy cơ, gia đình bạn bè Nhờ giúp đỡ q báu mà tơi nghiên cứu hồn thành tốt khóa luận Trước hết, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo PGS.TS Nguyễn Văn Rƣ học viên cao học Lê Quang Nghị, người thầy đáng kính trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn thầy giáo mơn Hóa Sinh – trường Đại học Dược Hà Nôi với thầy giáo mơn Hóa sinhTrường Đại học Y Dược Thái Nguyên tạo điều kiện để thực đề tài Tôi trân trọng gửi lời cảm ơn tới Ban Giám Hiệu, Phòng đào tạo Đại học thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi cho suốt năm học tập nghiên cứu trường Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè bên cạnh động viên suốt trình học tập nghiên cứu để hồn thành đề tài Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thị Nhung MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Oxytocin 1.1.1 Đặc điểm cấu tạo Oxytocin 1.1.2 Tính chất hóa lý Oxytocin 1.1.3 Tác dụng dược lý Oxytocin 1.3 Phƣơng pháp tăng độ bền Oxytocin 1.3.1 Tạo chất có cấu trúc tương tự với Oxytocin 1.3.2 Kỹ thuật liên kết vào cầu nối disulfid Oxytocin 1.3.3 Tạo hệ đệm chứa ion kim loại 1.3.4 Bột khô công thức 1.3.5 Các phương pháp liên hợp với Oxytocin 1.4 Phƣơng pháp pegyl hóa 1.4.1 Polyethylen glycol 1.4.2 Đại cương phương pháp pegyl hóa protein dược dụng 1.4.3 Pegyl hóa Oxytocin 11 1.5 Sự phát triển sản phẩm thuốc protein-PEG 15 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 18 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 18 2.1.1 Nguyên vật liệu 18 2.1.2 Thiết bị dụng cụ 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Phƣơng pháp thực nghiệm 20 2.3.1 Chế tạo Oxytocin-PEG 20 2.3.2 Xác định hình thành hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG phương pháp điện di 21 2.3.3 Tách chiết xác định khối lượng phân tử hợp chất Oxytocin pegyl hóa sắc ký đồ lọc gel 23 2.3.4 Xác định hiệu suất thu hồi Oxytocin-PEG mẫu phản ứng hai pH sau sắc ký lọc gel 25 2.3.5 Xác định ảnh hưởng lượng mPEG aldehyd tham gia phản ứng đến hiệu suất thu hồi hợp chất Oxytocin-PEG có dung dịch rửa giải sau sắc ký lọc gel 27 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 3.1 Chế tạo Oxytocin-PEG 28 3.2 Xác định hình thành hợp chất liên hợp phƣơng pháp điện dị 28 3.3 Tách chiết xác định khối lƣợng phân tử hợp chất liên hợp phản ứng pegyl hóa sắc ký lọc gel 30 3.3.1 Kết pick sắc ký Oxytocin sản phẩm tạo thành q trình pegyl hóa 30 3.3.2 Xây dựng đường chuẩn khối lượng phân tử 32 3.4 Xác định hiệu suất thu hồi Oxytocin-PEG mẫu phản ứng hai pH sau sắc ký lọc gel 36 3.5 Đánh giá ảnh hƣởng lƣợng mPEG aldehyd tham gia phản ứng tới hiệu suất thu hồi Oxytocin-PEG dung dịch sau sắc ký lọc gel 37 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 41 4.1 Về phản ứng pegyl hóa Oxytocin 41 4.2 Về khối lƣợng phân tử protein sau phản ứng liên hợp 43 4.3 Về đánh giá hiệu suất thu hồi Oxytocin-PEG dung dịch sau sắc ký lọc gel 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TÊN VIẾT TẮT Ý NGHĨA Asp Asparagin Cys Cystein DCC Dicyclohexylcarbodiimid DTT Dithiothreitol EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid Gln Glutamin Gly Glycin Ile Isoleucin Leu Leucin mPEG aldehyd Methoxyl polyethylenglycol propionaldehyd NaCNBH3 Natri cyanoborohydrid NHS N- hydroxy succinid PEG polyethylen glycol PHEA α,β-poly (N-2-hydroyethyl)-DL-aspartamid pI Điểm đẳng điện Pro Prolin SDS – PAGE Natri dodecyl sulfat TC DĐVN IV Tiêu chuẩn dược điển Việt Nam IV TEMED Tetramethylethylenediamin Tris Tris(hydroxymehtyl)methylamin Tyr Tyrosin DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Các sản phẩm pegyl hóa sử dụng thị trường 15 Bảng Các hóa chất dùng nghiên cứu 18 Bảng 2 Các thiết bị dùng nghiên cứu 19 Bảng Tổng hợp kết rửa giải protein phương pháp lọc gel 33 Bảng Lượng sản phẩm liên hợp thu dung dịch sau lọc gel 36 Bảng 3 Ảnh hưởng lượng mPEG aldehyd tham gia phản ứng tới hiệu suất thu hồi Oxytocin-PEG hình thành phân đoạn sau lọc gel 40 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 1 Công trúc không gian Oxytocin Hình Sự hình thành disulfid từ Oxytocin Hình Cấu trúc Desamino-Oxytocin Carbetocin Hình Các chất tương tự Oxytocin liên kết vào cầu nối disulfid Oxytocin Hình Công thức cấu tạo polyethylen glycol Hình Phương pháp pegyl hóa 10 Hình Cấu trúc mPEG số dẫn xuất mPEG có nhóm chức 10 Hình Quá trình khử amin qua trung gian tạo bazơ Schiff 11 Hình Phản ứng NHS ester peptid 12 Hình 10 Liên hợp với nhóm Cacboxylic 12 Hình 11 Gắn hợp chất dibromo dithiomaleimid tạo cầu nối cacbon sulfid 13 Hình 12 Liên hợp vào cầu nối ba nguyên tử cacbon 14 Hình 13 Phản ứng Thiol-en 15 Hình 14 Pegyl hóa vào nhóm hydroxyl phân tử Oxytocin 15 Hình Cơ chế phản ứng liên hợp 20 Hình Sơ đồ phản ứng pegyl hóa Oxytocin 28 Hình Kết điện di pH 4,5 28 Hình 3 Kết điện di pH 7,5 29 Hình Đồ thị tương quan mật độ quang phân đoạn rửa giải dung dịch Oxytocin 30 Hình Đồ thị tương quan mật độ quang phân đoạn rửa giải dung dịch sau phản ứng liên hợp Oxytocin mPEG aldehyd pH 4,5 31 Hình 3.6 Đồ thị tương quan mật độ quang phân đoạn rửa giải dung dịch sau phản ứng liên hợp Oxytocin mPEG aldehyd với pH 7,5 32 Hinh 3.7 Đồ thị tương quan mật độ quang phân đoạn rửa giải dung dịch Insulin………………………………………………………………………… 32 Hinh 3.8 Đồ thị tương quan mật độ quang phân đoạn rửa giải dung dịch Casein………………………………………………………………………… 33 Hình3.9 Đồ thị tương quan mật độ quang phân đoạn rửa giải dung dịch Chymotrysin……………………………………………………………………33 Hình 10 Đồ thị hồi quy tuyến tính logMW Ve 35 Hình 11 Đồ thị tương quan mật độ quang phân đoạn 37 rửa giải mẫu M1 37 Hình 12 Đồ thị tương quan mật độ quang phân đoạn rửa giải 38 mẫu M2 38 Hình 13 Đồ thị tương quan mật độ quang phân đoạn rửa giải 38 mẫu M3 38 Hình 14 Đồ thị tương quan mật độ quang phân đoạn rửa giải 39 mẫu M4 39 Hình Cơ chế phản ứng khử imin trung gian 41 ĐẶT VẤN ĐỀ Oxytocin hormon nonapeptid vòng tiết từ thùy sau tuyến yên Oxytocin tổng hợp để sử dụng làm thuốc Trên lâm sàng, Oxytocin thuốc lựa chọn để định khởi phát chuyển ngăn ngừa xuất huyết tử cung Ngoài ra, Oxytocin dùng để kích thích tiết sữa mẹ cho bú, điều trị bệnh tự kỷ trẻ, điều trị rối loạn chức sinh dục [22] Trong thể, Oxytocin bị phá hủy enzym peptidase nên thời gian bán thải ngắn Khi sử dụng đường uống, Oxytocin dễ bị phá hủy enzym tiêu hóa Do đó, Oxytocin chủ yếu bào chế dạng thuốc tiêm dạng xịt mũi Một vấn đề lớn sử dụng chế phẩm dạng lỏng chứa Oxytocin ổn định bảo quản Đặc biệt nước có khí hậu nhiệt đới, thường có nhiệt độ ban ngày vượt 40°C, Oxytocin dễ hoạt tính sinh học [54] Để khắc phục nhược điểm trên, nhà khoa học tìm giải pháp cho vấn đề bảo vệ cấu trúc Oxytocin Một số kỹ thuật pegyl hóa: gắn polyethylen glycol (PEG) vào phân tử protein Pegyl hóa mang lại nhiều ưu điểm cho Oxytocin như: làm tăng độ ổn định, tăng cường tác dụng điều trị, tăng thời gian bán thải, giảm tính sinh miễn dịch thuốc protein thể Hiện nay, kỹ thuật pegyl hóa thật chứng minh tính ưu việt nó, thể số lượng chế phẩm protein dược dụng gắn PEG không ngừng gia tăng thị trường dược phẩm [11] Nhằm mục đích ứng dựng để bào chế dạng dùng đường uống, tăng cường độ bền phân tử, đồng thời triển khai kỹ thuật pegyl hóa vào việc cải biến số protein dược dụng Việt Nam, tiến hành đề tài “Chế tạo bước đầu đánh giá hiệu hình thành phức hợp Oxytocin-PEG để làm thuốc phương pháp hóa sinh” với mục tiêu sau: Chế tạo Oxytocin với polyehthylen glycol tạo phức hợp OxytocinPEG Bước đầu xác định hiệu hình thành phức hợp Oxytocin-PEG phương pháp hóa sinh CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 Về phản ứng pegyl hóa Oxytocin Chúng tơi thực phản ứng pegyl hóa Oxytocin dựa nguyên tắc phản ứng khử amin khử Phản ứng trải qua hai giai đoạn Đầu tiên ngưng tụ aldehyd với N-tận aicd amin protein hình thành sản phẩm imin Đây phản ứng cộng hợp nhân (An) vào nhóm carbonyl aldehyd đồng thời tách loại phân tử nước theo chế tách loại E1 [1] Phản ứng sử dụng xúc tác acid, base không dùng xúc tác Sau đó, phần nhóm imin proton hóa chuyển thành acid liên hợp-muối iminium.Tác nhân khử hóa NaCNBH3 có tác dụng làm giảm imin trung gian tạo thành hợp chất liên hợp amin bậc hai ổn định Khơng cần phải lập imin trung gian (có xu hướng khơng ổn định), khử thực chỗ (xảy bình phản ứng) sau cho đủ thời gian để tạo thành imin [16] Cơ chế phản ứng sau : Hình Cơ chế phản ứng khử imin trung gian Ngoài phương pháp amin khử để tạo amin bậc 2, có phương pháp alkyl hóa trực tiếp Tuy nhiên, q trình alkyl hóa trực tiếp xảy nhiều lần amin tạo amin bậc không mong muốn (di-alkyl) Điều gây khó khăn việc phân tách Còn phương pháp khử amin, imin hình thành lần amin cho [16] Các acid amin Cys1, Gln4, Asn5 Gly9 Oxytocin có chứa N bậc dễ tham gia phản ứng hóa học, dễ bị thối hóa Do đó, chúng tơi tiến hành gắn PEG vào NH2 acid amin để bảo vệ cấu trúc Oxytocin Nghiên cứu Jennifer Collins sử dụng phân tử mPEG aldehyd liên hợp với Oxytocin Đã xác định vị trí gắn mPEG aldehyd vào nhóm -NH2 acid amin Cystein vị trí số [23] Đây vị trí dễ phản ứng nhóm amin vị trí 41 có độ âm điện lớn không bị ảnh hưởng cấu trúc không gian so với acid amin khác nên ưu tiên cơng vào cacbon tích điện dương nhóm carbonyl Do đó, chúng tơi cho phản ứng xảy nhóm amin Cystein vị trí số Trong nghiên cứu công bố, polyethylen glycol lựa chọn cho phản ứng pegyl hóa protein dẫn chất PEG hoạt hóa đầu đầu lại trơ, khơng hoạt động bị gắn với alkyl tạo thành nhóm alcoxy (hay gặp methoxy) Trong nghiên cứu này, để thực phản ứng amin khử, sử dụng mPEG aldehyd mPEG propionaldehyd, mPEG butyraldehyd,…Khi tham gia phản ứng tạo thành hợp chất liên hợp chúng thể ưu nhược điểm khác Trong đó, methoxy polyethylenglycol aldehyd đánh giá chất có khả phản ứng dễ dàng vào nhóm amin phân tử protein [49], [50] Về điều kiện pH tốt cho phản ứng acid nhẹ pH 4-5 [16] Ở pH 45, oxy carbonyl proton hóa làm tăng điện tích dương carbon thuận lợi cho công tác nhân nhân, tăng tốc độ phản ứng Ở điều kiện pH trung tính phản ứng diễn với chế chung Do đó, nghiên cứu tiến hành khảo sát phản ứng hai điều kiện pH 4,5 pH 7,5 Dưới tác dụng tác nhân khử NaCNBH3 NaBH4, imin chuyển thành amin bậc ổn đinh Tuy nhiên, NaBH3CN lựa chọn tốt NaBH4 Do NaBH4 tác nhân khử mạnh dẫn đến có khả khử aldehyd trước phản ứng ngưng tụ xảy Trong NaCNBH3 tác nhân khử yếu, nucleophil đủ mạnh để khử imin, nhiều aldehyd chuyển đổi thành amin Chúng sử dụng tác nhân khử NaCNBH3 Tỷ lệ chất xúc tác khử hóa NaCNBH3 thêm vào phản ứng thường gấp từ vài lần đến vài chục lần so với nguyên liệu liên hợp [17] Chúng thực phản ứng liên hợp Oxytocin với methoxyl polyethylen glycol propion aldehyd để pegyl hóa Oxytocin Lựa chọn tỷ lệ hai nguyên liệu ban đầu tham gia phản ứng 1:1, xúc tác phản ứng NaCNBH3 gấp lần chất tham gia phản ứng số mol Phản ứng thực 42 hai điều kiện pH 4,5 7,5, nhiệt độ thấp (40C), thời gian 24 Đánh giá kết liên hợp phản ứng phương pháp điện di Cả hai mẫu điện di phản ứng pH 4,5 7,5 cho thấy suất vết Trong đó, vết thứ trùng vị trí với Oxytocin, vết lại chất Chất có chất protein bắt màu thuốc nhuộm Comassie blue có khối lượng phân tử lớn Oxytocin ban đầu Điều chứng minh mẫu phản ứng có xuất protein hình thành sau phản ứng liên hợp Sơ xác định khối lượng hợp chất liên hợp tạo thành khoảng kDa Việc xuất vết cho thấy phản ứng xảy khơng hồn tồn, ngun nhân điều kiện phản ứng chưa tối ưu hóa 4.2 Về khối lƣợng phân tử protein sau phản ứng liên hợp Phương pháp sắc ký lọc gel thường dùng để tinh chế phân tử mẫu nhỏ xác định trọng lượng phân tử protein [7], [8] Nguyên lý sắc ký lọc gel phân tách chất theo khối lượng phân tử chúng Trong sắc ký gel, pha tĩnh mạng polymer có lỗ rỗng lỗ rỗng phủ đầy dung môi dùng làm pha động Các phân tử có kích thước lớn lỗ rỗng, khơng thể vào bên lỗ rỗng Các phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ vào lỗ rỗng Như vậy, thành phần khác hỗn hợp mẫu ngang qua cột sắc ký gel khỏi cột theo trình tự trọng lượng phân tử lớn khỏi cột trước, phân tử nhỏ khỏi cột sau [8] Do phân tử Oxytocin-PEG hình thành rửa giải trước phân tử Oxytocin , có pick sắc ký nằm trước vị trí pick Oxytocin Các phản ứng liên hợp mẫu thay đổi theo pH pH 4,5và 7,5 mẫu thay đổi theo nguyên liệu mPEG aldehyd tham gia phản ứng lấy để tiến hành sắc ký lọc gel Kết thu cho thấy, hỗn hợp sản phẩm tất mẫu có pick: pick thứ phân đoạn – 14 ml ứng với đỉnh thể tích 12 ml nằm trước pick Oxytocin phân đoạn 15 – 22 ml ứng với đỉnh thể tích 18 ml Do đó, pick thứ phải pick chất có khối lượng phân tử lớn Oxytocin Xét thành phần chất phản ứng hỗn hợp ban 43 đầu, nhận thấy chất có đặc tính Oxytocin tăng khối lượng phân tử cách gắn thêm phân tử khác Chúng cho Oxytocin-PEG Kết xây dựng đường chuẩn khối lượng phân tử theo thể tích rửa giải phương pháp lọc gel thu đường thẳng có phương trình: y = 0,131x + 2,361 Trong y logMW x thể tích rửa giải protein qua sắc ký lọc gel Xác định thể tích rửa giải thể tích rửa giải hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG Ve1 = 12 ml có khối lượng phân tử kDa Do phản ứng liên hợp phân tử mPEG aldehyd gắn kết với phân tử Oxytocin Kết phù hợp với kết mẫu điện di protein 4.3 Về đánh giá hiệu suất thu hồi Oxytocin-PEG dung dịch sau sắc ký lọc gel  Ảnh hưởng pH phản ứng liên hợp Hiệu suất thu hồi hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG xác định có dung dịch sau sắc ký lọc gel mẫu phản ứng pH 4,5 (63,08 ± 0,002%) lớn so với mẫu phản ứng pH 7,5 (36,10 ± 0.002%) Do đó, lượng hợp chất liên hợp pH 4,5 lớn tiến hành điều kiện lọc gel mẫu thử Điều giải thích theo chế phản ứng, pH 4,5 làm tăng tốc độ tạo thành sản phẩm trung gian imin (do tăng cung cấp proton), tăng hiệu suất phản ứng tạo hợp chất liên hợp so với mẫu pH 7,5 Chúng lựa chọn mẫu phản ứng pH 4,5 để tiếp tục khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu tham gia vào phản ứng  Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu tham gia vào phản ứng liên hợp Thay đổi lượng mPEG aldehyd tham gia vào phản ứng liên hợp với Oxytocin khoảng thêm bớt 10%, 20% so với lượng ban đầu Qui trình có độ lặp lại cao RSD < 2% Kết cho thấy tất mẫu có hình thành chất Oxytocin-PEG với thể tích rửa giải Ve 12 ml khối lượng phân tử Oxytocin-PEG khoảng kD Lượng hợp chất có chứa phân đoạn rửa giải từ ml đến 14 ml sau sắc ký lọc gel Gộp phân đoạn rửa giải để tiến hành đo quang bước sóng 280nm 44 Với p > 0,05, mẫu M1 đến M4 so với mẫu M0 cho thấy lượng hiệu suất thu hồi hợp chất liên hợp có mẫu dung dịch sau lọc gel thay đổi lượng mPEG aldehyd khoảng 20% so với mẫu M0 Do khoảng khảo sát thay đổi nguyên liệu ban đầu hẹp, đồng thời trình tách chiết làm lượng hợp chất liên hợp nên chưa đủ điều kiện để phản ứng cho thấy khác biệt mẫu phản ứng Do đó, cần phải khảo sát khoảng điều kiện lớn định lượng hợp chất liên hợp mẫu phản ứng mà chưa qua tách chiết 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã thực gắn kết phân tử methoxy polyethylenglycol propion aldehyd vào phân tử Oxytocin Bước đầu đánh giá hình thành hợp chất Oxytocin –PEG phương pháp hóa sinh - Đã tách chiết xác định hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG có khối lượng phân tử kDa, chứng minh phân tử hợp chất có phân tử mPEG aldehyd gắn với phân tử Oxytocin qua phương pháp điện di sắc ký lọc gel - Xác định điều kiện phản ứng phù hợp nghiên cứu xác định pH 4,5 với tỷ lệ 40 mg mPEG aldehyd mg Oxytocin với xúc tác NaCNBH3 (250mg) Trong điều kiện này, hiệu suất thu hồi hợp chất liên hợp OxytocinPEG dung dịch sau sắc ký lọc gel 63,08 ± 0,002% - hi thay đổi lượng mPEG aldehyd nguyên liệu tham gia phản ứng khoảng ± 20% tất mẫu phản ứng cho thấy có xuất chất Oxytocin-PEG có khối lượng phân tử khoảng kD Nhưng hiệu suất thu hồi Oxytocin-PEG sau sắc ký lọc gel mẫu không thay đổi so với mẫu ban đầu Kiến nghị Để tiếp tục phát triển kết nghiên cứu khóa luận, chúng tơi xin đưa đề xuất sau: - Khảo sát điều kiện khác để tổng hợp Oxytoicn - PEG đạt hiệu cao - Cải tiến phương pháp, xây dựng tiêu chuẩn đánh giá nhằm xác định đặc điểm độ tinh khiết của hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y Tế (2007), Hóa học hữu tập I, Nhà xuất Y học, pp 350-351 Bộ môn Dược lý (2010), Dược lý học lâm sàng, Trường Đại học Y Hà Nội, NXB Y học, pp 623-624 Bộ Y Tế (2011), "Dung dịch đệm Phosphat pH 4.5 pH 7.5", Dược điển Việt Nam IV, pp PL 2.3 Bộ Y Tế (2011), "Dung dịch đệm Tris pH 7,5", Dược điển Việt Nam IV, pp PL 2.3 Hồ Trung Thông, Lê Văn An (2006), Giáo trình hóa sinh động vật, NXB Nơng Nghiệp, pp 1-23 Lê Nguyễn Phúc Sơn (2007), Thiết lập qui trình điện di protein SDSPAGE ứng dụng đánh giá phản ứng lúa với thuốc sinh học kích kháng, Trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh, pp 9-19 Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương Pháp Cô Lập Hợp Chất Hữu Cơ, NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh, pp 323-329 Nguyễn Quốc hương Anh (2014), Sắc ký lọc gel ứng dụng, Trường Đại học Bách khoa Hồ Chí Minh, pp 1-50 Nguyễn Văn Rư (2017), "Tạo chế phẩm insulin Pegyl hóa đánh giá số đặc tính chế phẩm để dùng y dược", Tạp chí dược học pp 55-59 10.Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (1999), Hóa sinh học, NXB Giáo Dục, pp 3-39, 103-144 Tiếng anh 11.Alconcel Steevens NS, Baas Arnold S, et al (2011), "FDA-approved poly (ethylene glycol)–protein conjugate drugs", Polymer Chemistry, 2(7), pp 1442-1448 12.Avanti Christina, Amorij Jean-Pierre, et al (2011), "A new strategy to stabilize oxytocin in aqueous solutions: I The effects of divalent metal ions and citrate buffer", The AAPS journal, 13(2), pp 284-290 13.Avanti Christina, Hinrichs Wouter LJ, et al (2013), "The formation of oxytocin dimers is suppressed by the zinc-aspartate-oxytocin complex", Journal of pharmaceutical sciences, 102(6), pp 1734-1741 14.Avanti Christina, Oktaviani Nur Alia, et al (2013), "Aspartate buffer and divalent metal ions affect oxytocin in aqueous solution and protect it from degradation", International journal of pharmaceutics, 444(1-2), pp 139145 15.Bertolla Carine, Rolin Stéphanie, et al (2008), "Synthesis and pharmacological evaluation of a new targeted drug carrier system: βcyclodextrin coupled to oxytocin", Bioorganic & medicinal chemistry letters, 18(6), pp 1855-1858 16.Borch RF (1972), "Reductive amination with sodium cyanoborohydride: N, N-Dimethylcyclohexylamine", Organic Syntheses, 52, pp 124-127 17.Borch Richard F, Bernstein Mark D, et al (1971), "Cyanohydridoborate anion as a selective reducing agent", Journal of the American Chemical Society, 93(12), pp 2897-2904 18.Bossmar Thomas, Åkerlund Mats, et al (1994), "Receptors for and myometrial responses to oxytocin and vasopressin in preterm and term human pregnancy: effects of the oxytocin antagonist atosiban", American Journal of Obstetrics & Gynecology, 171(6), pp 1634-1642 19.Bruckdorfer Thomas (2007), "Pegylation the magic wand", pp 34-40 20.Cavallaro Gennara, Maniscalco Laura, et al (2007), "Synthesis, characterization and in vitro cytotoxicity studies of a macromolecular conjugate of paclitaxel bearing oxytocin as targeting moiety", European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics, 66(2), pp 182-192 21.Chan WY, Vigneaud Vincent Du (1962), "Comparison of the pharmacologic properties of oxytocin and its highly potent analogue, desamino-oxytocin", Endocrinology, 71(6), pp 977-982 22.Churchill Jeffrey R, Hutchinson Francis G, Continuous release formulations 1985, Google Patents 23.Collins Jennifer (2016), Polymer synthesis and conjugation strategies for enhancing the stability of oxytocin, University of Warwick 24.Gard John W, Alexander James M, et al (2002), "Oxytocin preparation stability in several common obstetric intravenous solutions", American Journal of Obstetrics & Gynecology, 186(3), pp 496-498 25.Grover Gregory N, Alconcel Steevens NS, et al (2009), "Trapping of thiol-terminated acrylate polymers with divinyl sulfone to generate welldefined semitelechelic Michael acceptor polymers", Macromolecules, 42(20), pp 7657-7663 26.Hartwig Walenty (1989), Endokrynologia praktyczna, Pa@ Wnstw zakl wyd-w lek Warszawa 27.Hope Derek B, Murti VVS, et al (1962), "A highly potent analogue of oxytocin, desamino-oxytocin", J biol Chem, 237, pp 1563 28.Jacob Suma, Brune Camille W, et al (2007), "Association of the oxytocin receptor gene (OXTR) in Caucasian children and adolescents with autism", Neuroscience letters, 417(1), pp 6-9 29.Jankowski Marek, Danalache Bogdan, et al (2004), "Oxytocin in cardiac ontogeny", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(35), pp 13074-13079 30.Johnson Keith A (1997), "Preparation of peptide and protein powders for inhalation", Advanced drug delivery reviews, 26(1), pp 3-15 31.Jones Mathew W, Strickland Rachel A, et al (2012), "Polymeric dibromomaleimides as extremely efficient disulfide bridging bioconjugation and pegylation agents", Journal of the American Chemical Society, 134(3), pp 1847-1852 32.Lou Rongliang, VanAlstine Melissa, et al (2003), "Preparation of Nhydroxysuccinimido esters via palladium-catalyzed carbonylation of aryl triflates and halides", Tetrahedron letters, 44(12), pp 2477-2480 33.Lowe Andrew B (2010), "Thiol-ene “click” reactions and recent applications in polymer and materials synthesis", Polymer Chemistry, 1(1), pp 17-36 34.Manning Mark Cornell, Chou Danny K, et al (2010), "Stability of protein pharmaceuticals: an update", Pharmaceutical research, 27(4), pp 544-575 35.Masri M Sid, Friedman Mendel (1988), "Protein reactions with methyl and ethyl vinyl sulfones", Journal of protein chemistry, 7(1), pp 49-54 36.Milla Paola, Dosio Franco, et al (2012), "PEGylation of proteins and liposomes: a powerful and flexible strategy to improve the drug delivery", Current drug metabolism, 13(1), pp 105-119 37.Morpurgo Margherita, Veronese Francesco M, et al (1996), "Preparation and characterization of poly (ethylene glycol) vinyl sulfone", Bioconjugate chemistry, 7(3), pp 363-368 38.Muttenthaler Markus, Andersson Asa, et al (2010), "Modulating oxytocin activity and plasma stability by disulfide bond engineering", Journal of medicinal chemistry, 53(24), pp 8585-8596 39.Paquin Joanne, Danalache Bogdan A, et al (2002), "Oxytocin induces differentiation of P19 embryonic stem cells to cardiomyocytes", Proceedings of the National Academy of Sciences, 99(14), pp 9550-9555 40.Prankerd Richard J, Nguyen Tri Hung, et al (2013), "Pulmonary delivery of an ultra-fine oxytocin dry powder formulation: potential for treatment of postpartum haemorrhage in developing countries", PloS one, 8(12), pp 582-965 41.Rath Werner (2009), "Prevention of postpartum haemorrhage with the oxytocin analogue carbetocin", European Journal of Obstetrics and Gynecology and Reproductive Biology, 147(1), pp 15-20 42.Renfrew MJ, Lang S, et al (2000), "Oxytocin for promoting successful lactation", The Cochrane database of systematic reviews, (2), pp CD000156-CD000156 43.Schumacher Felix F, Nobles Muriel, et al (2011), "In situ maleimide bridging of disulfides and a new approach to protein PEGylation", Bioconjugate chemistry, 22(2), pp 132-136 44.Smith Clark W, Ferger Martha F (1976), "Synthesis and some pharmacological properties of five analogs of oxytocin having Lhomocysteine in position 6", Journal of medicinal chemistry, 19(2), pp 250-254 45.Smith Mark EB, Schumacher Felix F, et al (2010), "Protein modification, bioconjugation, and disulfide bridging using bromomaleimides", Journal of the American Chemical Society, 132(6), pp 1960-1965 46.Takayanagi Yuki, Yoshida Masahide, et al (2005), "Pervasive social deficits, but normal parturition, in oxytocin receptor-deficient mice", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(44), pp 16096-16101 47.Thornton JM (1981), "Disulphide bridges in globular proteins", Journal of molecular biology, 151(2), pp 261-287 48.Tournier EJM, Wallach J, et al (1998), "Sulfosuccinimidyl 4-(Nmaleimidomethyl)-1-cyclohexane carboxylate as a bifunctional immobilization agent Optimization of the coupling conditions", Analytica chimica acta, 361(1-2), pp 33-44 49.Veronese Francesco M (2001), "Peptide and protein PEGylation: a review of problems and solutions", Biomaterials, 22(5), pp 405-417 50.Veronese Francesco M, Harris J Milton (2002), "Introduction and overview of peptide and protein pegylation", Advanced drug delivery reviews, 54(4), pp 453-456 51.Veronese Francesco M, Pasut Gianfranco (2005), "PEGylation, successful approach to drug delivery", Drug discovery today, 10(21), pp 1451-1458 52.Wermter Anne‐ athrin, amp‐Becker Inge, et al (2010), "Evidence for the involvement of genetic variation in the oxytocin receptor gene (OXTR) in the etiology of autistic disorders on high‐functioning level", American Journal of Medical Genetics Part B: Neuropsychiatric Genetics, 153(2), pp 629-639 53.Wilson Paul, Anastasaki Athina, et al (2015), "Organic arsenicals as efficient and highly specific linkers for protein/peptide–polymer conjugation", Journal of the American Chemical Society, 137(12), pp 4215-4222 54.Hogan Margaret C, Foreman Kyle J, et al (2010), "Maternal mortality for 181 countries, 1980–2008: a systematic analysis of progress towards Millennium Development Goal 5", The lancet, 375(9726), pp 1609-1623 PHỤ LỤC Bảng mật độ quang phân đoạn rửa giải dung dịch Phụ lục I Oxytocin mẫu phản ứng hai pH khác sau sắc ký lọc gel Bảng mật độ quang phân đoạn rửa giải mẫu Phụ lục II M1, M2, M3, M4 Bảng mật độ quang nồng độ lượng sản phẩm Phụ lục III Oxytocin-PEG liên hợp sau sắc ký lọc gel  Bảng mật độ quảng phân đoạn rửa giải dung dịch Oxytocin Phân đoạn D 0,046 0,046 0,048 0,046 0,048 Phân đoạn 10 D 0,048 0,046 0,046 0,046 0,046 Phân đoạn 11 12 13 14 15 D 0,046 0,045 0,046 0,045 0,059 Phân đoạn 16 17 18 19 20 D 0,099 0,198 0,341 0,187 0,089 Phân đoạn 21 22 23 24 25 D 0,067 0,051 0,051 0,048 0,048  Mẫu phản ứng pH 4,5 Phân đoạn D 0,048 0,048 0,050 0,048 0,050 Phân đoạn 10 D 0,050 0,049 0,050 0,069 0,099 Phân đoạn 11 12 13 14 15 D 0,198 0,305 0,178 0,058 0,051 Phân đoạn 16 17 18 19 20 D 0,068 0,099 0,209 0,109 0,078 Phân đoạn 21 22 23 24 25 D 0,069 0,052 0,050 0,048 0,048  Mẫu phản ứng pH 7,5 Phân đoạn D 0,048 0,049 0,050 0,048 0,048 Phân đoạn 10 D 0,048 0,050 0,049 0,058 0,079 Phân đoạn 11 12 13 14 15 D 0,218 0,109 0,109 0,057 0,052 Phân đoạn 16 17 18 19 20 D 0,099 0,154 0,354 0,179 0,098 Phân đoạn 21 22 23 24 25 D 0,075 0,052 0,050 0,048 0,048 Phụ lục I Bảng mật độ quang phân đoạn rửa giải dung dịch Oxytocin mẫu phản ứng pH 4,5 pH 7,5 sau sắc ký lọc PĐ 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 0,047 0,049 0,048 0,048 0,048 0,048 0,049 0,048 0,058 0,079 0,198 0,338 0,169 0,058 0,053 0,076 0,117 0,219 0,129 0,086 0,069 0,051 0,049 M1 0,048 0,046 0,048 0,050 0,049 0,048 0,050 0,048 0,057 0,079 0,198 0,337 0,168 0,059 0,053 0,077 0,119 0,218 0,128 0,085 0,069 0,051 0,048 0,050 0,049 0,048 0,050 0,048 0,050 0,049 0,050 0,058 0,079 0,198 0,336 0,168 0,057 0,052 0,076 0,119 0,219 0,129 0,086 0,069 0,051 0,049 0,048 0,046 0,048 0,049 0,048 0,048 0,050 0,049 0,059 0,089 0,187 0,336 0,119 0,057 0,051 0,078 0,158 0,232 0,118 0,079 0,059 0,050 0,049 M2 0,046 0,048 0,050 0,048 0,049 0,046 0,047 0,078 0,059 0,089 0,187 0,336 0,118 0,059 0,050 0,078 0,157 0,232 0,119 0,076 0,059 0,051 0,050 0,047 0,049 0,048 0,048 0,048 0,048 0,048 0,072 0,059 0,089 0,187 0,336 0,119 0,058 0,052 0,077 0,157 0,231 0,119 0,076 0,059 0,050 0,049 0,050 0,049 0,048 0,048 0,048 0,048 0,050 0,049 0,058 0,097 0,186 0,343 0,109 0,057 0,052 0,076 0,119 0,222 0,137 0,088 0,058 0,052 0,050 M3 0,050 0,049 0,048 0,048 0,046 0,046 0,048 0,049 0,058 0,097 0,186 0,345 0,108 0,057 0,050 0,075 0,118 0,221 0,139 0,089 0,066 0,051 0,049 0,046 0,048 0,050 0,050 0,048 0,048 0,048 0,048 0,058 0,097 0,186 0,345 0,109 0,058 0,049 0,076 0,119 0,221 0,139 0,089 0,066 0,051 0,048 0,046 0,048 0,050 0,048 0,048 0,049 0,048 0,048 0,078 0,108 0,198 0,361 0,178 0,057 0,053 0,075 0,108 M4 0,047 0,049 0,048 0,050 0,048 0,048 0,048 0,048 0,079 0,108 0,198 0,360 0,179 0,059 0,050 0,076 0,107 0,048 0,048 0,048 0,048 0,049 0,048 0,048 0,049 0,078 0,108 0,198 0,360 0,178 0,058 0,051 0,075 0,108 0,215 0,129 0,086 0,066 0,050 0,049 0,214 0,127 0,089 0,077 0,050 0,048 0,214 0,129 0,089 0,077 0,051 0,049 24 25 26 27 28 29 30 0,048 0,048 0,049 0,048 0,049 0,049 0,048 0,050 0,048 0,049 0,048 0,048 0,049 0,048 0,049 0,048 0,049 0,048 0,049 0,049 0,048 Phụ lục II 0,049 0,048 0,049 0,048 0,048 0,049 0,049 0,048 0,048 0,049 0,048 0,048 0,049 0,048 0,048 0,048 0,049 0,048 0,049 0,050 0,049 0,050 0,048 0,049 0,048 0,048 0,049 0,048 0,049 0,048 0,049 0,048 0,048 0,049 0,048 0,048 0,049 0,049 0,049 0,049 0,050 0,049 0,048 0,048 0,049 0,048 0,048 0,049 0,048 0,048 0,048 0,049 0,048 0,048 0,049 0,049 0,048 0,048 0,049 0,048 0,048 0,049 0,048 Bảng mật độ quang phân đoạn rửa giải mẫu phản ứng M1, M2, M3, M4 M1 M2 M3 M4 Mẫu 3 3 C chuẩn (mg/ml) 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 D chuẩn 0,302 0,308 0,332 0,32 0,314 0,332 0,362 0,302 0,29 0,316 0,32 0,34 D thử 0,561 0,563 0,601 0,563 0,554 0,602 0,673 0,566 0,531 0,599 0,619 0,637 C thử 0,037 0,037 0,036 0,035 0,035 0,036 0,037 0,038 0,037 0,038 0,039 0,037 Phụ lục III Bảng mật độ quang nồng độ sản phẩm liên hợp sau sắc ký lọc gel ... ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NHUNG Mã sinh viên: 1301305 CHẾ TẠO VÀ BƢỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ SỰ HÌNH THÀNH PHỨC HỢP OXYTOCIN-PEG BẰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP HÓA SINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng... hiệu hình thành phức hợp Oxytocin-PEG để làm thuốc phương pháp hóa sinh với mục tiêu sau: Chế tạo Oxytocin với polyehthylen glycol tạo phức hợp OxytocinPEG Bước đầu xác định hiệu hình thành phức. .. Oxytocin Đây phương pháp thay cho phương pháp tạo phức với hợp chất cầu nối dibromo/ dithiomaleimid Các phức hợp Arsen chứng minh đảo ngược diện dithiol khác để tạo chelat chéo, giảm oxi hóa cấu trúc,