Nghiên cứu tạo bước đấu đánh giá thời gian tuần hoàn máu iỉposom doxorubicin gắn Ịjolyethylen glycol B ù i Bá M ỉ n h \ N g u y ê n T h ị Lập^ ^Học Viện Quân K, ^TrườngĐợi họcDượcHàNộỉ SUMMARY The present study demonstrated that a sterically stabilized liposomes, nanoscaled PEG conjugate o f DSPE modified doxorubicin liposomes can be prepared by lipid film hydration method and pH gradient technique The results from evaluation o f particle size, morphology and physicochemical properties of desired products showed the obtained products were almost acceptably homogenous and stableJhe average size o f the majority o f liposomes is around 135 nm and 124 nmfor liposomal doxorubicin without PEG and liposomal doxorubicin conjugated PEG, respectively The liposomal efficiency o f Dox loading was rather good, reached from 82 to 90% Especially, the results showed some o f the benefits associated with the use o f PEG modified liposomes, such as increased blood levels and enhanced circulation lifetime, ĩừkhỏa: liposom doxorubicin, polyethylen glycol, thời gian tuân hoàn máu &ậ t vấn dế Một nhược điểm lớn sửdụng chế phẩm liposom nhanh chóng bị thải trừ khỏi vòng tuần hoàn sựtóm bắt tế bào thuộc hệ thực bào đơn nhân (MPS) Gán polyme thân nước, đặc biệt polỵethylen glycol (PEG) biện pháp hiệu để khắc phục nhược điểm Sự tăng thời gian tuẩn hoàn liposom gán PEG mang lại nhiểu lợi ích: giảm rò rỉ thuốc tuán hoàn, giảm tác dụng không mong muổn thuốc, làm tăng hội thoát mạch vào khoảng gian bào liposom, tăng tích lũy thuốc chống ung thư khối u tăng hiệu điểu trị [2,4], Những năm gẩn đây, nhiều nghiên cứu nước sử dụng liposom làm chất mang doxorubicin (Dox) đâ đạt nhiều kết đáng khích lệ Tuy nhiên, hẩu hết nghiên cứu dừng lại việc chế tạo liposoni từ nguyên liệu phospholipid cholesterol, chưa có nghiên cứu sử dụng dẫn chất polyme để làm tăng thời gian tuẩn hoàn liposom Dox Do đó, tiến hành nghiên cứu tạo liposom Dox gắn PEG bước đẩu đánh giá ảnh hưởng chế phẩm tới thời gian tuẩn hoàn máu Nguyên liệu, thiết bị phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu thiết bị Nguyên vật liệu Phospholipid lòng đỏ trứng hydrogen hóa [1], Cholesterol (Merck, Đức), 1,2-dioctadecanoylsn-glycero-3-hosphoethanolamineamonipolyethy lene glycol 2000 (DSPE-PEG^o^-NHj) cung cấp Laysanbio (Mỹ), doxorubicin cung cấp Merck (Đức) Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích Thiết bị Màng polycarbonat kích thước lỗ lọc 0,4 |jm 0,08 um (Sigma-Aidrich, Mỹ) Túi thẩm tích MVVCO: 12000 • 14000 Da (Spectrum Labs - Mỹ) Máy Emulsiílex - C5 (Canada) Máy đo quang phổ huỳnh quang Shimadzu RF1501 (Nhật Bản) Máy cất quay BUCHI R-210 (Thụy Sỹ) Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) JEOL 1010 (Nhật Bản) Nơi nghiên cứu - Phương pháp sửdụng thiết bị đẩy, ép qua màng tiến hành Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Phương pháp quang phổ huỳnh quang sửdụng máy Shimadzu RF1501 (Nhật Bản) tiến hành Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội - Chụp phân tích hình ảnh TEM tiến hành Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương - Các nghiên cứu khác tiến hành Bộ môn Hóa sinh, Bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội, Phưtfng pháp nghiện cứu Tạo liposom doxorubicin gắn polyethỵlen glycol Tạo tiểu phân liposom Dox gần PEG theo phương pháp Li, et al., [8] cải tiến, rnô tả tóm tắt sau: phospholipid trứng hydro hóa, cholesterol DSPE PEGj^^g-NH^ (tỷ lẹ mol 1,85:1:0,15 tương ứng) hòa tan vào 15 ml cloroform, cất quay chân không nhiệt độ 50°c Hỵdrat hóa màng mỏng thu dung dịch đệm citrat 300 mM, pH 50°c Hỗn dịch liposorn rhu đẩy qua màng polycarbonat kích thước lỗ 0,40 i-im lẩn 0,08 |.im 10 lần thiết bị Emulsiflex-C5 (Canada) Dox đưa vào liposom phương pháp chênh lệch pH, Liposom Dox (không gắn PEG) đtíợc tạo thành phương pháp tLíơng tự, với nguyên liệu ban đẩu phospholipid trứng hydro hóa cholesterol (tỷ lệ mol 2:1 tương ứng) Đánh giá Uposom tạo thành Kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân zetơ: Xác định thiết bị Zetasizer ZS90 (Anh) sau pha loãng hỗn dịch 200 lẩn dung dịch NaCI 0,9% lọc qua màng lọc 0,2 |jni Hình thái lìposom tạo thành: Chụp mẫu liposom kính hiển vi điện tửtruỵển qua (TEM) Đưa mẫu sau xử lý lên lưới có phủ màng collodion-carhon Cố định mẫu, rửa mẫu nhuộm dung dịch Iirani acetat 1% Quan sát kính hiển vi điện tử truyển qua JEOL với điện áp 80 kv Hiệu suâtlìposom hóa Dox: Định lượng Dox hệ liposom trước sau thẩm tích loại Dox tự (không liposom hóa) Hiệu suất liposom hóa xác định theo công thức: H (%) Cs/ Ct X ] 00% (C,và c lẩn lượt ià nồng độ doxorubicin toàn phần trước sau thẩm tích loại Dox tự do) Định lượng Dox toàn phân tronq hệ liposom: Lấy 125 mI dịch liposom, pha loãng với dung dịch NaCI 0,9% thành ml Thêm vào ml dung dịch ĩriton X • 100 1%, ủ hỗn hợp 60°c giờ, Định lượng Dox phương pháp quang phổ hấp thụ khả kiến \ = 480 nrn Mẫu trắng dung dịch gồm ml dung dịch NaCl 0,9% ml dung dịch Triton X - 100 1% Nghiên cứu ảnh hưởng qắn PEG tên bể liposom tới thời gian tuồn hoàn máu liposom doxmuhkin Tiến hành theo phương pháp Gabizon, et al., [2] có cải tiến thẩm định Chuột trắng dòng Swiss, BALC 57/6, giống đực, có khối lượng từ 22 - 27 g Viện Vệ sinh Dịch tễTrung ương cung cấp ctiia ngẫu nhiên thành nhótn, nhóm con: nhóm đẩu tiêm tĩnh mạch đuôi tương ứng với liểu 10 mg Dox/kg thể tích tiêm 10 ml/kg: nhóm (tiêm Dox dạnq tự đâ pha nước muối sinh lý), nhóm (tiêm liposorn Dox không gắn PEG), nhóm (tiêm liposom Dox gắn PEG) nhóm nhóm trắng (tiêm lOml/kg nước muối sinh lý) Sau tiêm, khoảng thời ginn phút (0,083 giờ), giờ, 24 giờ, máu chuột lấy từ hốc vào ống chứa heparin, ly tâm 4°c, 3000 vòng/phút 10 phút để lấy huyết tương Hút 100 |jl huyết tương, thêm 2,4 ml isopropanol acid hóa (HCI 0,075 N isopropanol 90% (tt/tt)) Sau 24 giờ, li tâm 4000 vòng/phút 20 phút, thu lấy phẩn dịch rổi định lượng Dox toàn phẩn huyết tương phươnq pháp quang phổ huỳnh quang bước sóng kích thích 471 nm, bước sóng phát xạ 554 nm.Từ mật độ huỳnh quang thu được, nồng độ tương đương Dox xác định dựa vào đường chuẩn xây dựng từ dung dịch Dox biết trước nồng độ Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu xử lý phẩn mểm Microsoft office Excel 2007 để tính giá trị trung bình độ lệch chuẩn SD Sử dụng kiểm định t-test để đánh giá khác kết Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p < 0,05 Bông ThẽMũ độ di chuyển củo cácmâu liposom Thế Zeta (mV) Ộdi chuyển ([jm.cm/v.s) Liposom -32,6 -2,553 PEG-liposom - 10,1 -0,7921 Liposom Dox -40,1 -3,140 PEG-liposom Dox - 8,88 -0,6963 Mẫu liposom Trước khỉ tải Dox Sau tải Dox Kết nghiên cứu Đành giá đặc tính tiểu phân liposom Dox tạo thành Kích thước tiểu phân trung bình phân bố kích thước tiểu phân liposom Dox (không gắn PEG) PEG-liposom Dox (gắn PEG) tạo thành trước sau tải Dox trình bày bảng Kết chụp TEM (hình 1) cho thấy liposom tạo có hình tròn, kích thước tương đối Bàng ĩ Kích thước tiểuphân chìsỗđaplìân tán (PD!) cácmâu liposom Mẫu liposom PDI KTTB theo đường kính(nm) Liposom 0,074 108,9 PEG-liposom 0,081 100,6 Liposom Dox 0,110 135,8 PEG-liposom Dox 0,179 124,9 Trước tải Dox Sdu tải Dox KĨĨB: Kích thước trung bình Kết bảng cho thấy liposom trước tải Dox khác biệt đáng kể kích thước lẫn số PDI liposom gắn không gắn PEG Đa số liposom tạo thành có kích thước khoảng 100 nm Sau trình tải Dox, kích thước trung bình mẫu liposom tăng lên đạt kích thước tiểu phân trung bình khoảng 130 nm Chỉ số đa phân tán (PDI) < 0,3 cho thấy hệ liposom tạo thành tương đối đồng Kết Zeta thu bảng liposom không gắn PEG (trước sau tải Dox) có giá trị tuyệt đối > 30 mV cho thấy khả ổn định hệ cao Thế Zeta liposom gắn PEG thấp, tương ứng với -10,1 mV (trước tải thuốc) - 8,88 mV (sau tải Dox) So với liposom không gắn PEG, liposom gắn PEG di chuyển chậm Print Nag: 24I00X • 4:41:41 |Í04/27^U TKHMođà: iBaging nm ■■ H V « Ì O e k V m r#€t UềỆĩ tlOOOx Hinh Hình ảnh chụp TEMCỈIQlìposom doxoíubicin gân PE6ở độphóng đọi 12.000 lán Tiếp theo, bảng thể hiệu suất liposom hóa Dox dạng chế phẩm gắn không gắn PEG Kết cho thấy hiệu suất liposom hóa PEG liposom Dox thu tương đối cao (82,54%), không khác nhiều so với dạng liposom Dox không gắnPEG (89,60%) Bỏng ì Hiệu suấtlìposoiĩì hóo CỦQmẫu cácmẫu liposoíĩì Hiêu suất (%) Trước loại Doxtựdo Sau loại Doxtựdo Nồng độ (mg/ ml) Nồng độ (mg/mí) Liposom Dox 1,894 1,697 89,60 PEG-liposom Dox 1,901 1,569 82,54 Mẫu liposom Ảnh hưởng gắn PEG lên bề mặt liposom tới thời gian tuần hoàn liposom máu Nồng độ tương đương Dox huyết tương chuột nhắt thời điểm phút, 24 sau tiêm tĩnh mạch đuôi chuột trình bày bảng Bảng Nông độ tương đương Doxtrong huyét tương chuộtnhát cácthời điếíii 5phứt (0,083 giờ), giờ, 24 giờsau tiêm tĩnh mạch đuôi Thời điểm (giờ) Nổng độ tương đương doxorubicin trung bình ([ig/ml huyết tương) ± SD (n = 3) Doxtựdo Liposom Dox PEG-liposom Dox 0,083 13,79 ±1,33 133,73 ± 10,98 152,49 ± 14,06 5,09 ±1,98 64,24 ± 112,06 ± 5,42 8,41 24 - 8,64 ± 51,61 ± 0,56 3,51 p p ,,< ,0 p;:;o;o5 p ^,< ,0 p;;; ... hưởng tới thời gian tuẩn hoàn liposom máu mà ảnh hưởng tới khả tích lũy liposom khối u Nghiên cứu trước cho thấy liposom gắn PEG có kích thước 100 - 200 nm có thời gian tuẩn hoàn dài nhất, liposom. .. (mg/ ml) Nồng độ (mg/mí) Liposom Dox 1,894 1,697 89,60 PEG -liposom Dox 1,901 1,569 82,54 Mẫu liposom Ảnh hưởng gắn PEG lên bề mặt liposom tới thời gian tuần hoàn liposom máu Nồng độ tương đương... liposom doxorubicin gắn PEG cao có ý nghĩa thống kê so với nhóm chuột tiêm liposom doxorubicin không gắn PEG thời điểm xa (4 giờ, 24 giờ) phẩn chứng minh khả PEG kéo dài thời gian tuắn hoàn máu