Nhằm phục vụ phát triển bộ KIT ELISA phát hiện nhanh độc tố vi tảo domoic acid trong sản phẩm hải sản tại Việt Nam, kháng thể kháng độc tố này đã được thử nghiệm thu nhận bằng liệu pháp miễn dịch đối với thỏ trắng New Zealand, thông qua sử dụng 250 µg và 500 µg phức hợp kháng nguyên domoic acid - dissuccinyl substrate - bovine serum albumin.
Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Biển; Tập 16, Số 2; 2016: 176-182 DOI: 10.15625/1859-3097/16/2/8419 http://www.vjs.ac.vn/index.php/jmst THĂM DÒ KHẢ NĂNG SẢN SINH KHÁNG THỂ KHÁNG ĐỘC TỐ VI TẢO DOMOIC ACID CỦA THỎ TRẮNG NEW ZEALAND Đào Việt Hà Viện Hải dương học-Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam E-mail: daovietha69@gmail.com Ngày nhận bài: 6-1-2016 TÓM TẮT: Nhằm phục vụ phát triển KIT ELISA phát nhanh độc tố vi tảo domoic acid sản phẩm hải sản Việt Nam, kháng thể kháng độc tố thử nghiệm thu nhận liệu pháp miễn dịch thỏ trắng New Zealand, thông qua sử dụng 250 µg 500 µg phức hợp kháng nguyên domoic acid - dissuccinyl substrate - bovine serum albumin Thỏ đáp ứng miễn dịch sau tháng thí nghiệm liều kháng nguyên 500 µg số cá thể thỏ có hiệu ứng miễn dịch cao (OD > 3,0) Hiệu ứng miễn dịch có xu hướng tăng nhanh đạt giá trị cực đại sau tháng thứ 6, sau giảm nhanh tháng Dãy phát domoic acid kháng thể rộng với biến thiên tuyến tính khoảng nồng độ pha lỗng từ 1/800 đến 1/51.200 Với tín hiệu thấp, phân biệt phản ứng dương âm rõ ràng, độ pha loãng 1/12.800 chọn đơn vị hiệu giá kháng thể Tuy hiệu giá kháng thể nghiên cứu thấp so với số nghiên cứu khác không phát phản ứng ức chế từ kainic acid, aspartic acid, glutamic acid, gamma-aminobutyric acid, globulin, proline, hydroxyproline (có cấu trúc hóa học tương tự domoic acid) kháng thể Kết cho thấy kháng thể thu nhận liệu pháp có tính đặc hiệu với domoic acid, sử dụng làm vật liệu cho kít domoic acid -ELISA Việt Nam Từ khóa: Domoic acid, ELISA, hiệu giá kháng thể, kháng thể kháng domoic acid MỞ ĐẦU Độc tố vi tảo gây trí nhớ tạm thời (Amnesic shellfish poisoning toxin - ASP toxin) có chất hóa học domoic acid (DA) (khối lượng phân tử: 311 daltons, công thức phân tử: C15H21NO6); axit amin có ba nhóm cacboxyl tồn dạng tinh thể, tan nước, có tính axit Theo Debonnel nnk., [1], động vật có vú, DA hoạt động chất cạnh tranh glutamate, hủy hoại tế bào thần kinh cách kết hợp với điểm tiếp nhận glutamate, dẫn đến tình trạng kích hoạt mức tế bào Sau hấp thụ qua thành ruột dẫn đến hệ thần kinh trung tâm, DA tác động trực tiếp đến hệ thần kinh trung tâm động vật bậc cao người Vì DA có khả 176 ức chế q trình giải phóng hoạt chất ức chế gamma-aminobutyric acid (GABA) vùng yên ngựa thần kinh não thông qua hoạt động kích hoạt enzyme protein kinase (PK) dạng C Tiếp theo đó, nồng độ cao ion Ca làm cho tế bào thần kinh trở nên sưng phồng chết vùng não có q trình trao đổi chất glutamaine-rich [2] Các điểm tiếp nhận tập trung nhiều khu vực CA1 CA3 vùng đồi hải mã, nơi có chức ghi nhớ học - vậy, triệu chứng trí nhớ thời gian ngắn không hồi phục biểu đặc trưng ngộ độc ASP người [3] Takata nnk., [4] phát DA loài nhuyễn thể Spondylus vùng biển châu Á bao gồm Nhật Bản, Thái Lan, Philippines Việt Nam Tiếp theo, Đào Thăm dò khả sản sinh kháng thể kháng … Việt Hà nnk., [5] công bố kết ghi nhận hàm lượng DA cao (150 µg/g mơ mềm) lồi hai mảnh vỏ Hàu Hương Spondylus versicolor đầm Nha Phu, Khánh Hòa, Việt Nam Hiện nay, giới hạn an toàn độc tố DA sản phẩm hải sản quốc gia chấp nhận 20 g/g mô mềm Những phát gần cho thấy nguy ngộ độc DA khu vực châu Á bao gồm Việt Nam mức độ cần cảnh báo Gần đây, hướng nghiên cứu miễn dịch học độc tố DA quan tâm trọng nhiều, nhằm phục vụ phát triển phương pháp thử nghiệm nhanh độc tố bao gồm phương pháp gắn kết enzyme (ELISA) Một khó khăn lớn phát triển phương pháp ELISA độc tố DA cần có nguồn kháng thể đặc hiệu kháng DA liệu pháp gây miễn dịch số đối tượng động vật (cừu, dê, thỏ, chuột ) Tuy nhiên, thể sinh vật sản sinh kháng thể kháng lại độc tố có chất protein Trong đó, DA có khối lượng phân tử thấp, khơng thuộc nhóm protein nên thể sinh vật khơng có phản ứng miễn dịch bị tiêm trực tiếp độc tố Muốn gây hiệu ứng miễn dịch động vật thử nghiệm DA, cần phải tạo phức hợp kháng nguyên cách thực phản ứng gắn kết độc tố với loại protein thích hợp, cho phức chất tạo ra, cấu trúc tính chất độc tố khơng bị thay đổi, lại mang đặc tính phân tử protein Khi phức chất độc tố-protein đưa vào thể sinh vật với liều lượng an toàn, đủ đáp ứng miễn dịch thời gian định, sinh vật sản sinh kháng thể kháng độc tố dạng cấu trúc phân tử protein Do đó, nghiên cứu miễn dịch học năm gần chủ yếu tập trung vào chế, điều kiện sản sinh kháng thể kháng độc tố DA đối tượng động vật thử nghiệm khác [6-9] Trên sở chọn lọc phương pháp công bố giới sản xuất kháng thể đa dòng kháng độc tố DA, báo trình bày kết thử nghiệm gây miễn dịch thỏ trắng New Zealand điều kiện tối ưu thời gian, cách thức đưa kháng nguyên vào thể sinh vật với nồng độ khác chất (phức hợp kháng nguyên) theo dõi có mặt kháng thể kháng độc tố DA huyết thỏ thử nghiệm Kết nghiên cứu nhằm thu nhận kháng thể kháng DA cho mục tiêu chế tạo KIT ELISA với giá thành thấp, thay KIT mua từ nước ngoài, phục vụ nhu cầu thị trường Việt Nam an toàn thực phẩm biển cách chủ động PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Gây miễn dịch thỏ trắng New Zealand Tiếp cận kế thừa kết nghiên cứu có, nghiên cứu tiến hành liệu pháp miễn dịch thỏ trắng New Zealand kháng nguyên phức hợp độc tố DA điều kiện tối ưu kỹ thuật tiêm, tần suất thời gian thí nghiệm Thí nghiệm thực 12 tháng (8/2014 - 7/2015) Thỏ trắng dòng New Zealand khỏe mạnh, giới tính cái, khối lượng thể 0,8 kg lựa chọn, sử dụng cá thể cho lô đối chứng cá thể cho lô thí nghiệm Trong thời gian thí nghiệm, thỏ ni theo quy trình ni động vật thí nghiệm Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế [10] Trước gây đáp ứng miễn dịch, huyết thỏ kiểm tra để đảm bảo khơng có kháng thể kháng độc tố DA trước Liệu pháp gây miễn dịch cho thỏ gồm 24 mũi tiêm da bên đùi trái, tần suất tuần Thí nghiệm bao gồm nghiệm thức lô đối chứng sử dụng dịch tiêm đệm PBS tá chất, lơ thí nghiệm sử dụng phức hợp kháng nguyên domoic acid - dissuccinyl substrate bovine serum albumin (DA-DSS-BSS) điều chế theo Đào Việt Hà Phạm Xuân Kỳ [11] với liều tiêm 250 (nghiệm thức 1) 500 µg/mL (nghiệm thức 2), cụ thể sau: Miễn dịch kích thích: Tiêm vào da vị trí đùi trái thỏ hỗn hợp mL đệm PBS (pH 7,4) tá chất Fraund hoàn chỉnh FCA (Freund’s complete adjuvant) (WAKO, 014-09541, Nhật Bản) (tỉ lệ 1:1 thể tích) có chứa 250 (thí nghiệm 1) 500 µg phức hợp kháng nguyên BSA-DSS-DA (thí nghiệm 2) Thực liệu pháp tiêm tuần/mũi tháng Miễn dịch nhắc lại: Từ tháng thứ trở đi, tiêm da vị trí đùi trái thỏ hỗn hợp mL đệm PBS (pH 7,4) tá chất Fraund khơng hồn chỉnh FIA (Freund’s incomplete adjuvant) (WAKO, 011-09551, Nhật Bản) (tỉ lệ 177 Đào Việt Hà 1:1 thể tích) có chứa 250 (thí nghiệm 1) 500 µg phức hợp kháng nguyên 500 µg (thí nghiệm 2) với tuần suất tuần/lần hãng WAKO, Nhật Bản) với nồng độ chất 0,5; 1; 2; 5; 10; 20; 100; 200 500 nM theo chế phản ứng ELISA [12] Đối với thỏ lô đối chứng, tất lần tiêm sử dụng mL dung dịch hỗn hợp đệm PBS tá chất hồn chỉnh (FIC) (tỉ lệ 1:1 thể tích) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thu nhận huyết thỏ thử nghiệm Từ tháng thứ thí nghiệm gây miễn dịch (1/2015), tiến hành trích ly mL máu từ động mạch vành tai (artery vent) thỏ với tần suất hàng tháng Ly tâm máu 3.000 vòng/phút phút máy ly tâm Universal 320 (Hettich, Đức) để thu nhận huyết (dịch trong) bảo quản điều kiện nhiệt độ -200C sử dụng Kiểm tra đáp ứng miễn dịch Đáp ứng miễn dịch xác định hoạt tính kháng thể huyết thỏ thử nghiệm, sử dụng phương pháp ELISA gián tiếp gồm bước cố định kháng nguyên DA biết trước nồng độ, phản ứng với kháng thể kháng DA huyết thỏ (pha loãng 1.000 lần) phát phản ứng màu với chất TMB (tetramethylbenzidine) thông qua kháng thể thứ cấp Polyclonal Swine anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (DAKO, P0399, Đan Mạch), đo mật độ quang (Optical density OD) máy quang phổ kế (Microplate Reader, MTP-810Lab, Japan) bước sóng 490 nm theo Takata [12] Xác định hiệu giá kháng thể Huyết thỏ sau tháng thứ có hoạt tính kháng thể cao sử dụng cho xác định hiệu giá kháng thể với dung dịch DA chuẩn (TOCRIS, UK) µg/mL (trong đệm PBS, pH 7,4) nồng độ huyết pha loãng 50, 100, 200, 400, 800, 1.600, 3.200, 6.400, 12.800, 25.600, 51.200 102.400 lần dung dịch đệm PBS pH 7,4 Kiểm tra tính đặc hiệu kháng thể huyết Phản ứng ELISA thực với DA, kainic acid, aspartic acid, glutamic acid, gamma-aminobutyric acid, globulin, proline, hydroxy proline (các hóa chất có xuất xứ từ 178 Tất mẫu huyết thỏ lô đối chứng lơ thí nghiệm vào thời điểm trước tiêm kháng nguyên cho kết âm tính phép thử ELISA Như vậy, khẳng định điều kiện không gây miễn dịch với phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA, sinh vật không sản sinh kháng thể tương ứng Sau tháng thí nghiệm, số thỏ nghiệm thức bị chết chưa rõ nguyên nhân Ở nghiệm thức 1, mẫu huyết thỏ từ tháng thứ tháng thứ 12 cho kết âm tính với kháng nguyên DA phép thử ELISA (số liệu không này) Như vậy, liều phức hợp kháng ngun 250 µg, thỏ hồn tồn khơng có biểu đáp ứng miễn dịch Ở nghiệm thức 2, sau tháng chưa phát hiệu giá kháng thể huyết thỏ thí nghiệm Tuy nhiên, sau tháng thí nghiệm, huyết thỏ cho kết dương tính phép thử ELISA (OD490 >1,0), chứng tỏ xuất đáp ứng miễn dịch thỏ thí nghiệm liều phức hợp kháng ngun 500 µg (hình 1) Tuy nhiên, có khác biệt thống kê (P3.0) Antibody activity in the rabbit serum was increasing and reached maximum after months of experiment, then decreased rapidly in the following months Domoic acid antibody titer was wide in range with good correlation in 1/800 to 1/51,200 dilution In 1/12,800 dilution, a background signal was very low, with clear distinction between negative and positive results, so this concentration was chosen as an antibody titer unit This unit is rather lower than that in some other studies, however, antibody obtained in this study showed no cross action with any of kainic acid, aspartic acid, glutamic acid, gamma-aminobutyric acid, globulin, proline, hydroxyproline, which have similar chemical structure to domoic acid The results showed that antibody obtained in the study is specific to domoic acid, and can be used as material for domoic acid-ELISA kit in Vietnam Keywords: Antibody against domoic acid, antibody titer, domoic acid, ELISA 182 ... VAST 04.04/1415 “Nghiên cứu sản sinh kháng thể kháng độc tố vi tảo gây trí nhớ tạm thời cho Thăm dò khả sản sinh kháng thể kháng … người (domoic acid) đối tượng thỏ trắng nhằm phục vụ phát triển... Hệ số pha lỗng Hình Hiệu giá kháng thể huyết thỏ trắng New Zealand thu nhận liệu pháp miễn dịch Hình Hoạt tính kháng thể kháng độc tố domoic acid huyết thỏ trắng New Zealand từ sau tháng thứ đến... tính kháng thể kháng domoic acid huyết thỏ thí nghiệm, có số thỏ thử nghiệm có hoạt tính kháng thể cao, với đơn vị hiệu giá kháng thể đạt 12.800 Tuy hiệu giá kháng thể không cao, kháng thể thu