Nghiên cứu quá trình lên men ethanol sinh học từ nguồn sinh khối rong nước lợ chaetomorpha sp sau trích ly prrotein nguyễn thị liên, hoàng kim anh, tạp chí khoa học đại học thủ dầu một, số 2(37) 2018, tr 3 13

Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 2(37)-2018 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN ETHANOL SINH HỌC TỪ NGUỒN SINH KHỐI RONG NƯỚC LỢ CHAETOMORPHA SP SAU TRÍCH LY PRROTEIN Nguyễn Thị Liên(1), Hồng Kim Anh(2) (1) Trường Đại học Thủ Dầu Một, (2) Viện Sinh học Nhiệt đới TP Hồ Chí Minh Ngày nhận 17/4/2018; Ngày gửi phản biện 20/4/2018; Chấp nhận đăng 20/5/2018 Email: lien_cnsh@yahoo.com Tóm tắt Nghiên cứu đưa điều kiện tối ưu cho q trình chuyển hóa rong Chaetomorpha sp sau trích ly protein (bã rong) thành ethanol Bã rong sau tiền xử lý với H 2SO4 sử dụng cho trình thủy phân lên men đồng thời để tạo ethanol Sau trình thủy phân lên men đồng thời (SSF) kết thu thơng số tối ưu cho q trình thủy phân lên men đồng thời thu sau: nồng độ chất 9% w/v, nồng độ enzyme cellulase 28 FPU/g chất, nồng độ enzyme β-glucosidase 4.5 CBU/g chất, nhiệt độ lên men 370C, thời gian 27.6 giờ, mật độ nấm men 0.2 pH Kết thu nồng độ ethanol 2.23% v/v, tương ứng hiệu suất lên men theo lý thuyết 84.61% (tính theo lượng glucose có nguyên liệu) Từ khóa: Chaetomorpha sp., enzyme cellulase, tiền xử lý, đường hóa enzyme Abstract ETHANOL FERMENTATION OF BRACKISH WATER ALGAE RESIDUE CHAETOMORPHA SP AFTER PROTEIN EXTRACTION Residue - the rest of material after protein extraction from Chaetomorpha sp biomass – contained high level of cellulose In this study, the residue was pretreated with dilute sulfuric acid solution at high temperature and then transformed into bioethanol by Simultaneously Saccharification and Fermentation (SSF) The obtained optimal conditions of SSF process: substrate concentrations 9% w/v, cellulase concentration 28 FPU/g substrate (Filter paper unit), β-glucosidase concentration 4.5 CBU/g substrate (Cellobiase unit), temperature 370C, reaction time 27.6 hours, yeast density 0.2 and pH After SSF process, under these conditions, ethanol titer obtained in the medium reached 2.23% v/v and the ethanol production yield was 84.61% compared with theoretical yield Nguyễn Thị Liên Nghiên cứu trình lên men ethanol sinh học Đặt vấn đề Tình hình gia tăng dân số hậu trở thành mối quan tâm to lớn cộng đồng quốc tế Dân số tăng kéo theo nhiều vấn đề đặt tình trạng thiếu lương thực thực phẩm, cạn kiệt nguồn tài nguyên thiên nhiên đặc biệt làm ô nhiễm mơi trường Vì có nhiều nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học - nguồn lượng góp phần bảo vệ mơi trường Tuy nhiên việc sản xuất nhiên liệu sinh học lại ảnh hưởng đến nguồn lương thực người việc sản xuất nhiên liệu sinh học chủ yếu sử dụng nguồn carbohydrate ngũ cốc Vì việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu không cạnh tranh với lương thực cần thiết, rong biển xem nguồn nguyên liệu từ thực vật thủy sinh giới ý đến nguồn nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học hệ thứ sau tinh bột cellulose Rong biển nguồn nguyên liệu tự nhiên dồi dào, không cạnh tranh với lương thực, khơng chiếm diện tích đất canh tác ý đến giải pháp phù hợp bối cảnh thiếu hụt nguồn nguyên liệu cho việc sản xuất ethanol Hiện số loài rong biển (như Chaetomorpha sp.) mọc tự nhiên khắp ao hồ nuôi tôm quảng canh nước lợ vùng đồng sông Cửu Long Sau thu hoạch tôm, lượng lớn sinh khối rong bà nông dân vớt khỏi ao để thành đống thối rữa bờ, vừa lãng phí vừa gây nhiễm mơi trường Việc nghiên cứu thu nhận sản phẩm có giá trị từ loài rong tận dụng nguyên liệu sẵn có để tạo sản phẩm có giá trị gia tăng đồng thời giải vấn đề ô nhiễm môi trường địa phương Với mạnh tăng sinh khối nhanh khoảng 5%/ngày khả tận dụng diện tích mặt nước để ni kết hợp với tôm, rong biển xem lựa chọn chiến lược cho việc sản xuất nhiên liệu sinh học, đồng thời ứng phó với bối cảnh biến đổi khí hậu – nước biển dâng Rong biển chứa lignin, qui trình sản xuất nhiên liệu từ rong biển đơn giản thuận lợi so với từ thực vật cạn Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Vật liệu: Rong mền Chaetomorpha sp thu nhận sau 15 – 20 ngày phát triển tùy thuộc vào điều kiện thời tiết, ao nuôi tôm quảng canh xã Long Điền, huyện Đông Hải, tỉnh Bạc Liêu Rong sau xay nhỏ trích ly protein Phần bã rong sau trích ly sử dụng để tiến hành thí nghiệm Vi sinh vật: Nấm men sử dụng giống men Saccharomyces cerevisiae khô Lallemand thương mại hãng Brenntag Co (Đan Mạch) Enzyme: Chế phẩm cellulase Cellic Ctech2 (Novozymes, Đan Mạch) với nhiệt độ pH tối ưu 500C có hoạt tính 150 FPU/ml chế phẩm β-glucosidase Novozyme 188 (Sigma Aldrich, Mỹ) có nhiệt độ pH tối ưu 500C với hoạt tính tổng 300 CBU/ml 2.2 Phương pháp: Xác định nồng độ ethanol phương pháp HPLC (Dien, 2010) Xác định hàm lượng ẩm phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi theo TCVN 1867:2001 Các thí nghiệm lặp lại lần để đảm bảo độ tin cậy Sử dụng phần mềm Statgraphics plus 3.0 để phân tích thống kê số liệu thí nghiệm đánh giá khác biệt mẫu Các thí nghiệm tối ưu hóa tiến hành theo quy hoạch thực nghiệm bậc Kết tính tốn, xử lý thống kê phần mềm Modde 5.0 Đề tài thực Viện Sinh học Nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 2(37)-2018 2.3 Quy trình nghiên cứu: Rong mền Chaetomorpha sp sau trích ly protein, phần bã rong sử dụng để tiến hành thí nghiệm Bã rong sấy khơ tuyệt đối Khi tiến hành thí nghiệm, nguyên liệu cân vào chai thủy tinh (chai có nắp, chịu nhiệt độ cao) với khối lượng 4g (đã sấy khơ tuyệt đối), q trình tiền xử lý thực điều kiện: nồng độ acid 1.72% v/v, nhiệt độ tiền xử lý 120 0C, thời gian 28.7 phút tỷ lệ bã rong dung dịch H2SO4 12.5% w/v Dịch sau tiền xử lý để nguội trung hòa pH 5, sau bổ sung dinh dưỡng, đệm, enzyme, nấm men lên men SSF điều kiện pH, nhiệt độ, thời gian thích hợp để thu nồng độ cồn cao Các thông số trình thủy phân lên men đồng thời bao gồm: nồng độ chất, nồng độ enzyme, mật độ nấm men, pH, nhiệt độ, thời gian lên men khảo sát, đánh giá để thu nồng độ ethanol cao Bã rong Tiền xử lý Hình Sơ đồ nghiên cứu Dinh dưỡng, đệm H2SO4 Trung hòa pH Ca(OH)2 Đường hóa lên men đồng thời Enzyme, nấm men Ly tâm Dịch sau lên men Kết thảo luận 3.1 Xác định nồng độ chất phù hợp Bảng Ảnh hưởng nồng độ chất tới trình lên men SSF Stt Nồng độ chất (% w/v) 10 Nồng độ ethanol (% v/v) (1,33±0,02)a (1,48±0,025)b (1,58±0,02)c (1,66±0,036)d (1,88±0,032)e (1,96±0,051)f (1,86±0,051)e Hiệu suất lên men (% tính theo khối lượng glucose) 114,69 102,10 91,29 81,60 81,06 74,37 64,16 Nguyễn Thị Liên Nghiên cứu trình lên men ethanol sinh học * Trong cùng cột, giá trị đánh dấu bởi chữ giống sự khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α = 0,05) Kết cho thấy nồng độ chất tăng cao, lượng cellulose tăng Như vậy, lượng cellulose bị cơng enzyme tăng lên kết lượng glucose, cellobiose dung dịch tăng theo Chính nồng độ chất tăng lượng glucose tăng lên, glucose nấm men sử dụng để chuyển hóa thành ethanol, kết nồng độ cồn tăng lên Tuy nhiên nồng độ chất tiếp tục tăng (trên 9% w/v) nồng độ cồn bắt đầu giảm Nguyên nhân nồng độ chất rắn tăng cao, khả tác động enzyme giảm ảnh hưởng tới lượng glucose tạo thành Mặt khác, nồng độ chất rắn cao, dung dịch đậm đặc, trình khuếch tán enzyme toàn khối nguyên liệu khó khăn dẫn đến phản ứng thủy phân diễn khó khăn, nồng độ glucose thu đuợc giảm Hiệu suất lên men nồng độ ethanol có xu hướng ngược Ở nồng độ chất thấp hiệu suất lên men cao nồng độ ethanol thu lại thấp Để chọn nồng độ chất tốt cần phải xem xét hai vấn đề Thứ nhất, hiệu suất liên quan đến việc sử dụng nguyên liệu hiệu Thứ hai, nồng độ ethanol thu cao trình chưng cất thu ethanol tiết kiệm mặt chi phí Chính vậy, việc tăng nồng độ ethanol sau trình lên men tới ngưỡng nồng độ cao giúp q trình chưng cất ethanol trở nên kinh tế đóng vai trò quan trọng giá thành bioethanol Vì lý chọn nồng độ chất 9% cho trình lên men SSF Kết đề tài phù hợp với nghiên cứu Jang ctv (2012) Theo Jang ctv (2012) nồng độ chất cao dẫn đến độ nhớt cao gây khó khăn cho q trình xử lý mẫu Đối với trình lên men SSF nồng độ chất giới hạn khoảng 10% 3.2 Xác định nồng độ enzyme phù hợp cho trình thủy phân và lên men đồng thời Bảng Ảnh hưởng tương hỗ enzyme cellulase β-glucosidase đến kết trình lên men SSF Nồng độ enzyme cellulase (FPU/g chất) 20 20 20 25 25 25 28 28 Nồng độ enzyme βglucosidase (CBU/g chất) 4,5 4,5 28 4,5 Stt (1,39±0,015)a (1,42±0,02)a (1,41±0,021)a (1,7±0,015)b (1,94±0,055)c (1,95±0,023)c (1,73±0,025)b (1,95±0,026)c Hiệu suất lên men (% tính theo khối lượng glucose) 52,74 53,88 53,50 64,50 73,61 73,99 65,64 73,99 (2,03±0,02)d 77,03 Nồng độ ethanol (% v/v) * Trong cùng cột, giá trị đánh dấu bởi chữ giống sự khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α = 0,05) Kết cho thấy tương tác nồng độ enzyme cellulase enzyme βglucosidase cho nồng độ ethanol khác Nồng độ ethanol đạt cao 2,03% v/v nồng độ enzyme cellulase β-glucosidase lần lượt 28 FPU/g 4,5 CBU/g Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 2(37)-2018 Bảng cho thấy nồng độ enzyme β-glucosidase tăng, nồng độ enzyme cellulase khơng đổi nồng độ ethanol thu tăng khơng đáng kể Điều giải thích với lượng chất không đổi, lượng enzyme cellulase không đổi (lượng cellobiose khơng đổi) chỉ cần lượng enzyme β-glucosidase xác định chuyển hóa cellobiose hiệu Vì việc dùng lượng enzyme β-glucosidase nhiều không kinh tế Với lượng chất không đổi nồng độ enzyme cellulase β-glucosidase tăng tới giới hạn định lượng cellobiose tạo thành tăng dẫn đến lượng glucose tạo thành nhiều Glucose lại nấm men sử dụng để chuyển hóa thành cồn, kết nồng độ cồn tăng Vì từ kết nghiên cứu ảnh hưởng tương hỗ enzyme cellulase β-glucosidase định chọn nồng độ enzyme cellulase β-glucosidase lần lượt 28 FPU/g chất 4,5 CBU/g chất Hình Ảnh hưởng tương hỗ enzyme cellulase βglucosidase đến kết trình lên men SSF 3.3 Xác định nhiệt độ lên men phù hợp Tiến hành trình thủy phân lên men đồng thời nhiệt độ thay đổi lần lượt là: 30; 32,5; 35; 37,5; 400C Kết trình bày bảng Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ tới kết trình lên men SSF Stt Nồng độ ethanol Hiệu suất lên men (% v/v) (% tính theo khối lượng glucose) 30 (1,46±0,0325)a 55,40 32,5 (1,54±0,0289)b 58,43 c 35 (1,94±0,029) 73,61 37,5 (2,08±0,021)d 78,92 e 40 (1,81±0,027) 68,68 * Trong cùng cột, giá trị đánh dấu bởi chữ giống sự khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α = 0,05) Nhiệt độ (0C) Nguyễn Thị Liên Nghiên cứu trình lên men ethanol sinh học Khi nhiệt độ tăng từ 300C đến 37,50C nồng độ ethanol hiệu suất lên men tăng dần đạt cao 37,5 0C Tuy nhiên nhiệt độ tiếp tục tăng lên 40 0C nồng độ ethanol hiệu suất lên men bắt đầu giảm (nồng độ ethanol giảm còn 1,81% hiệu suất giảm còn 68,68%) Trong thí nghiệm chúng tơi ý đến khía cạnh: nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính nấm men.Vì phải chọn nhiệt độ tốt cho enzyme nấm men hoạt động Nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme: Mỡi loại enzyme có nhiệt độ tối ưu khác Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhiệt độ 40 – 50 0C (Rai ctv, 2012) Riêng hệ enzyme cellulase, nhiệt độ tối ưu 50 0C Bản chất enzyme protein nên đưa nhiệt độ cao nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme bị giảm, enzyme khơng có khả phục hồi hoạt tính Nhiệt độ tăng làm tăng hoạt tính enzyme, từ tốc độ phản ứng enzyme tăng theo sản phẩm tạo thành nhiều Tuy nhiên, sau nhiệt độ bất hoạt enzyme, hoạt tính enzyme giảm dần Nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính nấm men: Mỡi vi sinh vật có khoảng nhiệt độ tối ưu cho phát triển chúng Đối với nấm men Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm khoảng 28 - 320C (Llauradó ctv, 2005) Vì để sử dụng trình thủy phân lên men đồng thời chọn chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae hãng Brenntag company Đan Mạch có khả hoạt động điều kiện nhiệt độ cao Nồng độ ethanol tăng nhiệt độ tăng từ 30 0C đến 37,50C, nhiệt độ tăng lên 400C nồng độ ethanol giảm nhanh Ở nhiệt độ cao, hoạt tính nấm men giảm nhanh chủ yếu dễ bị nhiễm vi sinh vật vi khuẩn lactic nấm men hoang dại Mặt khác, lên men nhiệt độ cao tạo nhiều sản phẩm phụ ester, aldehyd tổn thất ethanol theo CO tăng Vì nồng ethanol thu thấp Vì lý chọn nhiệt độ tối ưu cho trình 37,5 0C, nhiệt độ kết hợp nhiệt độ tốt cho trình thủy phân (45-50 0C) nhiệt độ tốt cho hoạt động nấm men 300C 3.4 Xác định pH lên men phù hợp cho trình lên men SSF Tiến hành thí nghiệm lên men giá trị pH khác lần lượt là: 4; 4,5; 5; 5,5; Kết trình bày bảng Bảng Ảnh hưởng pH tới trình lên men SSF Stt Nồng độ ethanol Hiệu suất lên men (% v/v) (% tính theo khối lượng glucose) (1,85±0,021)a 70,20 4,5 (1,98±0,076)b 75,13 c (2,09±0,023) 79,30 d 5,5 (1,39±0,016) 52,74 (1,25±0,07)e 47,43 *Trong cùng cột, giá trị đánh dấu bởi chữ giống sự khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α = 0,05) pH Nồng độ ethanol tăng từ 1,85 đến 2,09 % pH tăng từ đến 5, nhiên pH tiếp tục tăng nồng độ ethanol giảm nhanh Mỡi enzyme loại giống nấm men hoạt động tốt Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 2(37)-2018 khoảng giá trị pH định Đối với enzyme cellulase, khoảng pH thích hợp 45 Trong điều kiện lên men ethanol, pH tối ưu để tạo ethanol 4,5 – 5,0 pH thấp (pH 0,8 Q2 > 0,5 Như vậy, kết thí nghiệm thu hồn tồn phù hợp với tiêu chí mà tác giả đưa tiến hành quy hoạch thực nghiệm sử dụng phần mềm Modde 5.0 Từ kết bảng 7, phương trình hồi quy mơ tả nồng độ cồn thu sau trình lên men SSF sau: Y= 2,27 – 0,0506826X1 – 0,040111 X2 – 0,044 X1X2 – 0,219039 X12 – 0,174025X22 Trong đó:Y, X1, X2 lần lượt nồng độ cồn thu sau trình lên men SSF (% v/v), nhiệt độ lên men (0C), thời gian lên men (giờ) Phương trình hồi quy biểu diễn trục tọa độ không gian chiều hình Hình 3.4 Bề mặt đáp ứng biểu thị ảnh hưởng thời gian tiền xử lý nồng độ acid đến nồng độ cồn thu sau trình lên men SSF Kết tối ưu đạt theo phương trình hồi qui sau: (1) Thời gian lên men: 27,6 giờ; (2) Nhiệt độ lên men: 370C; (3) Nồng độ cồn dự đoán theo phương trình hồi qui 2,2747 % ( tương ứng với hiệu suất 86,31%) Tiến hành kiểm tra thực nghiệm với thơng số tối ưu từ phương trình hồi quy thu Kết đạt sau: nồng độ cồn thu 2,23% hiệu suất 84,61% tương ứng với thời gian lên men 27,6 nhiệt độ lên men 37 0C 12 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 2(37)-2018 Hình Sắc ký đồ thu sau kiểm tra thực nghiệm với thơng số tối ưu q trình lên men SSF ở nhiệt độ 370C thời gian 27,6 Sự khác biệt nồng độ cồn giá trị dự đốn theo phương trình hồi qui giá trị thực nghiệm 2% Như giá trị thực nghiệm thu gần với giá trị tính tốn từ phương trình hồi qui Kết thu quy hoạch thực nghiệm cho thấy thay đổi thời gian nhiệt độ trình lên men SSF giới hạn khảo sát làm thay đổi có ý nghĩa nồng độ cồn thu sau trình lên men SSF Thời gian lên men 27,6 nhiệt độ lên men 370C xem thông số tối ưu để thu nồng độ cồn hiệu suất lên men cao Kết thí nghiệm cho thấy nồng độ ethanol thu sau lên men khoảng 17,59g/l (2,23% v/v), tương ứng 193,54g ethanol/1kg bã rong khơ sau trích ly protein cao nhiều so với sản xuất ethanol từ sinh khối rong Kết cao so với nhiều công bố lên men ethanol từ sinh khối rong tảo lớn thường có hàm lượng ethanol tạo sau lên men thấp 10g/l (Jessica, 2009; Lee ctv, 2009) Hàm lượng ethanol thu bã rong tương đương với hàm lượng ethanol thu từ số nguồn sinh khối giàu cellulose khác lõi ngô, rơm rạ, vụn gỗ Theo (Zhu, 2010; Saha ctv 2005) hàm lượng ethanol thu từ nguồn sinh khối giàu cellulose khác lõi ngô, rơm rạ, vụn gỗ 17-20g/l, hiệu suất chuyển hóa 225-250g ethanol/1kg ngun liệu khơ [1] [2] [3] [4] TÀI LIỆU THAM KHẢO Charles E W (1996) Handbook on Bioethanol: Product and Utilization, Taylor & Francis, pp 119-285 Dien B.S (2010) Mass Balances and Analytical Methods for Biomass Pretreatment Experiments In: Vertes A A., Qureshi N., Blaschek H P., Yukawa H., editors Biomass to Biofuels Strategies for Global Industries United Kingdom: Wiley and Sons pp 213-231 Gabrielsson J , Lindberg N and Lundstedt T (2002) Multivariate methods in pharmaceutical applications J Chemometrics 16:141-160 Jessica M A (2009) Fermentation study on Saccharina latissima for bioethanol production considering variable pre-treatments, J Appl Phycol 21:569–574 13 Nguyễn Thị Liên Nghiên cứu trình lên men ethanol sinh học [5] Jang J S., Cho Y K., Jeong G T.and Kim S K (2012) Optimization of saccharification and ethanol production by simultaneous saccharification and fermentation (SSF) from seaweed, Saccharina japonica Bioprocess Biosyst Eng 35:11–18 [6] Llauradó J M., Rozès N., Constantí M., Mas A (2005) Study of some Saccharomyces cerevisiae strains for winemaking after preadaptation at low temperatures Journal of agricultural ang food chemistry 53: 1003 – 1011 [7] Lee S M and Lee J H (2009) Production of Bio-ethanol from Brown Algae by Physicochemical Hydrolysis J Korean Ind Eng Chem 20(5): 517-521 [8] Saha B S., Itena L B., Cotta M A and Wu Y V (2005) Dilute acid pretreatment, enzymatic saccharification and fermentation of wheat straw to ethanol, Process Biochemistry 40: 3693– 3700 [9] Rai P., Tiwari S and Gaur (2012) Saccharification of bagasse BioResources 7(4): 5401-5414 [10] Zhu J Y E A., 2010 Ethanol production from SPORL-pretreated lodgepole pine: preliminary evaluation of mass balance and process energy efficiency Appl Microbiol Biotechnol 86: 1355–1365 14 ... thực Viện Sinh học Nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 2 (37 )- 2018 2 .3 Quy trình nghiên cứu: Rong mền Chaetomorpha sp sau tr? ?ch ly protein, phần bã rong sử... đạt sau: nồng độ cồn thu 2, 23% hiệu suất 84,61% tương ứng với thời gian lên men 27,6 nhiệt độ lên men 37 0C 12 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 2 (37 )- 2018 Hình Sắc ký đồ thu sau kiểm tra... (2, 23% v/v), tương ứng 1 93, 54g ethanol/ 1kg bã rong khơ sau tr? ?ch ly protein cao nhiều so với sản xuất ethanol từ sinh khối rong Kết cao so với nhiều công bố lên men ethanol từ sinh khối rong