Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 7786:2007 - ISO 14675:2003. Tiêu chuẩn về Sữa và sản phẩm sữa - hướng dẫn mô tả chuẩn về các phép phân tích miễn dịch enzym cạnh tranh - xác định hàm lượng aflatoxin M1.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 7786:2007 ISO 14675:2003 SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA - HƯỚNG DẪN MÔ TẢ CHUẨN VỀ CÁC PHÉP PHÂN TÍCH MIỄN DỊCH ENZYM CẠNH TRANH - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AFLATOXIN M1 Milk and milk products - Guidelines for a standardized description of competitive enzyme immunoassays - Determination of aflatoxin M1, content Lời nói đầu TCVN 7786:2007 hoàn toàn tương đương với ISO 14675:2003; TCVN 7786:2007 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F12 Sữa sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Lời giới thiệu Các phương pháp độc quyền phương pháp ELISA mô tả tiêu chuẩn riêng rẽ Do đó, mục đích tiêu chuẩn nhằm đưa hướng dẫn thông số cần thiết để đánh giá/xác nhận phép phân tích miễn dịch enzym cạnh tranh để định lượng aflatoxin M1, sữa sản phẩm sữa Một vài dạng phép thử định lượng hóa học miễn dịch có sẵn hành, chung nguyên tắc phân tích miễn dịch enzym cạnh tranh Tuy nhiên, dạng phép thử phân tích vi đĩa 96 giếng thường sử dụng hầu hết phép định lượng, nên thông số nêu tiêu chuẩn chấp nhận riêng biệt cho dạng phép thử khơng cần thiết phải áp dụng toàn cho dạng phép thử khác SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA - HƯỚNG DẪN MÔ TẢ CHUẨN VỀ CÁC PHÉP PHÂN TÍCH MIỄN DỊCH ENZYM CẠNH TRANH - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AFLATOXIN M1 Milk and milk products - Guidelines for a standardized description of competitive enzyme immunoassays - Determination of aflatoxin M 1, content Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn đưa hướng dẫn sử dụng phương pháp sàng lọc dùng để xác định hàm lượng aflatoxin M1 sữa sản phẩm sữa, dựa vào phép phân tích miễn dịch enzym cạnh tranh Về mục đích hợp pháp, kết phân tích miễn dịch enzym dương tính cần phải thử khẳng định phương pháp chuẩn chấp nhận Tuy nhiên, tùy thuộc vào phép thử tuân theo yêu cầu đây, mà phép phân tích miễn dịch enzym sử dụng để kiểm sốt chất lượng thơng thường, đặc biệt cần chứng minh khơng có mặt aflatoxin M 1, giới hạn qui định Nguyên tắc Các phương pháp hóa học miễn dịch dựa khả liên kết kháng thể với chất cụ thể Việc kết hợp thuận nghịch kháng thể kháng nguyên tương ứng chúng gọi phản ứng miễn dịch học Lực liên kết kéo theo tương tác phân tử yếu, lực Coulomb van der Waals, giống liên kết hydro liên kết kỵ nước Phản ứng kháng nguyên-kháng thể dựa vào qui luật tác dụng khối lượng lượng kháng thể kháng nguyên có mặt hỗn hợp phản ứng suy từ qui mơ phản ứng "Chất lượng" phép phân tích miễn dịch hàm số nguyên tắc hóa học miễn dịch phương pháp, đặc tính thuốc thử, kiểu loại phép phân tích sai số thực nghiệm Các nguyên tắc xác định độ nhạy, tính đặc thù, độ chụm độ phương pháp Liên quan đến nguyên tắc phương pháp, có khác biệt phương pháp cạnh tranh không cạnh tranh Về lý thực tế, phương pháp cần kháng nguyên đánh dấu kháng thể đánh dấu để quan sát phản ứng kháng nguyên-kháng thể Các phương pháp cạnh tranh dựa cạnh tranh kháng nguyên tự (A g) kháng nguyên đánh dấu (Ag*) lượng giới hạn vị trí liên kết kháng thể (AB) Ở dạng biểu đồ, nguyên tắc hóa học miễn dịch thể theo công thức sau đây: Ag + Ag* + AB = AgAB + Ag*AB + Ag + Ag* Trong phần lớn trường hợp, phép phân tích cho thấy có kháng nguyên liên kết đánh dấu, nguyên tắc phép đo phân bố kháng nguyên đánh dấu Để phát hợp chất khối lượng phân tử thấp mycotoxin mà chiếm vị trí liên kết kháng thể (epitop), phép phân tích cạnh tranh bắt buộc Để có phân biệt chất phản ứng tạo phức chất khơng phản ứng, phần lớn phép phân tích sử dụng kháng thể (phân tích cạnh tranh trực tiếp) kháng nguyên (phân tích cạnh tranh gián tiếp) kết hợp với pha rắn làm chất hấp thụ miễn dịch Còn tất thuốc thử mà không liên kết kháng thể dễ dàng loại cách "rửa" pha rắn Phân tích miễn dịch enzym aflatoxin M1 Dựa vào thông tin đưa nguyên tắc chung phép phân tích miễn dịch (xem điều 2), khuyến cáo phương pháp ELISA để xác định aflatoxin M1 cần tuân thủ yêu cầu đưa bảng Bảng - Yêu cầu thông số phép phân tích Thơng số u cầu Kháng thể Nguồn Vơ tính đơn dòng vơ tính đa dòng Kháng nguyên đánh dấu Enzym đánh dấu Peroxidaza cải ngựa Kiểu Aflatoxin B1, peroxidaza cải ngựa-oxim-M1 Dạng phân tích Ngun tắc hóa học miễn dịch Phân tích enzym cạnh tranh Kiểu Phân tích vi đĩa 96 giếng Thời gian h đến h Độ nhạy phép phân tích Nồng độ AFM1 cho độ hấp thụ tương đối a: 80 % < 20 ng/l 50 % < 50 ng/l Tính đặc thù phép phân tích Khả phản ứng chéo với aflatoxin M1 100 % Khả phản ứng chéo với aflatoxin khác (xuất sữa) < 20 % Thiết kế thống kê Các chuẩn - nhiều - độ pha loãng nhiều kể chuẩn zero - dải nồng độ (ng/ml) từ ng/l đến 50 ng/l khoảng rộng Các mẫu - nhiều - độ pha lỗng cần Tính tốn Gần với trục bậc ba, mơ hình logic bốn thơng số, hồi qui tuyến tính (chỉ phần tuyến tính đường chuẩn)b Sự trùng khớp đường chuẩn Độ chụm Các chuẩn - hệ số biến thiên lặp lại độ hấp thụ tương đối < 10 % - hệ số biến thiên tái lập độ hấp thụ tương đối < 20 % Các mẫu - giới hạn lặp lại (ng/kg) < 100 ng/kg mức 200 ng/kg (sữa bột) - giới hạn tái lập (ng/kg) < 150 ng/kg mức 200 ng/kg (sữa bột) - giới hạn phát (ng/kg) < ng/kg (sữa) - giới hạn định lượng (ng/kg) < 10 ng/kg (sữa) Chuẩn bị mẫu Loại chất béo ly tâm; hoàn nguyên sữa bột (thành dung dịch) Độ thu hồi > 80 % dải từ 10 ng/kg đến 50 ng/kg (sữa)c a Độ hấp thụ chuẩn mẫu/độ hấp thụ chuẩn zero x 100 b Xem thông số thống kê 6.3 c Hiệu chỉnh độ thu hồi thương không cần thiết Độ nhạy Độ nhạy phép phân tích miễn dịch liên quan trực tiếp đến lực kháng thể tính biết trước số cân (xem [2]) Vì phản ứng kháng nguyên-kháng thể mơ tả cách sử dụng phản ứng động học công thức nhiệt động học, nên thời gian nhiệt độ có ảnh hưởng đến độ nhạy phép phân tích Tính đặc thù Sau độ nhạy tính đặc thù thực phép phân tích quan trọng phương pháp hóa học miễn dịch Về nguyên tắc, phản ứng đặc thù miễn dịch học xác định sau: có mặt phân tử khác nhau, kháng thể đặc thù liên kết với dạng phân tử Khả hình thành liên kết "sai" xác định tính đặc thù phản ứng Nói cách khác, tính đặc thù xác định cách đánh dấu ba chiều kháng nguyên kháng thể số lượng tương tác phân tử xảy hai phân tử Về tính đặc thù đòi hỏi cần xem xét cấu trúc kháng nguyên tính đồng khơng đồng kháng thể Việc chuẩn bị kháng thể đồng kháng thể kết hợp với epitop, cho dù với lực khác Điều kiện thực kháng thể vơ tính đơn dòng, huyết miễn dịch dựa theo hợp chất có khối lượng phân tử thấp (haptenes) Mặt khác, việc chuẩn bị kháng thể khơng đồng chứa quần thể kháng thể khác đặc trưng cho epitop khác Về sở phân tử khả phản ứng chéo "thật sự" diễn tả trường hợp mà có hai kháng ngun khác vị trí cạnh tranh liên kết kháng thể Phần lớn khả phản ứng chéo quan sát phép thử cạnh tranh sử dụng kháng thể vơ tính đơn dòng kháng huyết hợp chất phân tử thấp Trong thực tiễn, điều có nghĩa nồng độ đủ cao chất phản ứng chéo thực cho kết giống chất "thích hợp" phân tích cạnh tranh Điều quan trọng cần ý ảnh hưởng khơng đặc thù lên phép phân tích (ví dụ: ảnh hưởng chất nền) thường phân biệt với ảnh hưởng đặc thù chất phản ứng chéo Trong hai trường hợp, độ nhạy phép phân tích thu kết dương tính giả âm tính giả Tuy nhiên, nguyên lý phân tích miễn dịch, nên kết âm tính giả khơng giống phép phân tích cạnh tranh Thơng số thống kê 6.1 Khái qt Nói thơng số thống kê ảnh hưởng đến "chất lượng" phân tích miễn dịch cần ý phương pháp thống kê thông thường để xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khả tái lập, … áp dụng cho phép phân tích miễn dịch Tuy nhiên, vài thông số ảnh hưởng đến độ chụm phép phân tích (độ lặp lại) độ kết phân tích miễn dịch điển hình cho phân tích miễn dịch enzym dùng vi đĩa 96 giếng Đối với phép phân tích thường nhật, phương pháp thường qui định số lượng giếng để chuẩn bị đường chuẩn số lượng cố định phân tích kép chất chuẩn mẫu, số lượng dung dịch pha loãng mẫu 6.2 Độ chụm Trong 6.1 có hai yếu tố ảnh hưởng đến độ chụm ước tính phạm vi lớn Yếu tố thứ vị trí giá trị độ hấp thụ quan sát đường hiệu chuẩn Yếu tố thứ hai số lượng phép thử kép sử dụng cho mẫu thử Do hình dạng khơng tuyến tính đường hiệu chuẩn, mà số đọc độ hấp thụ gần với 50 % liên kết tương đối cho nhiều kết xác số đọc gần với 100 % % liên kết khơng an tồn Đối với mục đích thực tế, kết cần phải dao động từ 20 % đến 80 % "liên kết khơng hồn tồn" Phép đo trở nên xác tăng số lượng phép thử kép với phương pháp thử khác 6.3 Độ xác Độ xác dự đốn chủ yếu bị ảnh hưởng độ xác đường hiệu chuẩn Tuy nhiên, thường trước cách xác đường hiệu chuẩn dự đoán từ số đọc độ hấp thụ nồng độ chuẩn đĩa Do phương pháp trùng khớp đường chuẩn số giá trị đường hiệu chuẩn sử dụng nồng độ thực chất chuẩn xác định độ xác đường hiệu chuẩn Trong phương pháp toán học sử dụng để mơ tả đường chuẩn phân tích miễn dịch, có mơ hình logic bốn thơng số gần trục bậc ba sử dụng để phân tích miễn dịch enzym (xem [2]) Cả hai phương pháp cho kết so sánh hai phương pháp áp dụng nhiều chương trình sẵn có để xử lý số liệu phân tích miễn dịch Kết luận Cho dù chất lượng tổng thể phép phân tích miễn dịch hàm số phức hợp, mà khó mơ tả, vài yếu tố ảnh hưởng đến thông số chất lượng phân tích thống kê bảng theo cách đơn giản Bảng - Các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp lên thông số chất lượng phân tích miễn dịch enzym Yếu tố Thơng số chất lượng phân tích Độ nhạy Tính đặc thù Có Có Có Khơng Hóa học miễn dịch - nguyên tắc phương pháp Kháng thể - lực Độ chụm Độ xác - tính đặc thù Khơng Có Khơng Khơng - hoạt tính Có Khơng - kiểu Có Có - phép thử kép Khơng Có - độ pha lỗng Khơng Có - phép thử kép Có Khơng - độ pha lỗng Có Khơng Khơng Có Thuốc thử đánh dấu Các chuẩn Các mẫu Không Không Trùng khớp đường chuẩn Sai số thực nghiệm Có Có Có Có Chuẩn bị mẫu Có Có Có Có CHÚ THÍCH: Liên quan đến tính đặc thù bị hạn chế khả cho kết dương tính giả ức chế khơng đặc thù phép phân tích, mà cần phải khẳng định kết phân tích miễn dịch tính hợp pháp mục đích mang tính pháp lý THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] MARTLBAUER E Basic principles which determine the quality of immunoassays IDF Special Issue No 9302, 1983, p 137 [2] RODBARD D., MUNSON P.J and DE LEAN A Improved curve-fiiting, paralelism testing, characterization of sensitivity and specificity, validation and optimization for radioligand assays In: Radioimmunoassay and ralated procedures in medicine Vol 1, 1977, pp 469-514 International Atomic Energy Agency, Vienna, 1978 ... pháp Kháng thể - lực Độ chụm Độ xác - tính đặc thù Khơng Có Khơng Khơng - hoạt tính Có Khơng - kiểu Có Có - phép thử kép Khơng Có - độ pha lỗng Khơng Có - phép thử kép Có Khơng - độ pha lỗng Có... (xuất sữa) < 20 % Thiết kế thống kê Các chuẩn - nhiều - độ pha loãng nhiều kể chuẩn zero - dải nồng độ (ng/ml) từ ng/l đến 50 ng/l khoảng rộng Các mẫu - nhiều - độ pha loãng cần Tính tốn Gần với... tính đường chuẩn) b Sự trùng khớp đường chuẩn Độ chụm Các chuẩn - hệ số biến thiên lặp lại độ hấp thụ tương đối < 10 % - hệ số biến thiên tái lập độ hấp thụ tương đối < 20 % Các mẫu - giới hạn