Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8683-9:2011

Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8683-9:2011. Tiêu chuẩn về Giống vi sinh vật thú y – Phần 9: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng trâu bò, các chủng Pb.1, Pb.2, P.52, Pbu.1 và Pbu.2. Mời các bạn cùng tham khảo.

TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8683-9:2011 Xuất lần GIỐNG VI SINH VẬT THÚ Y – PHẦN 9: QUY TRÌNH GIỮ GIỐNG VI KHUẨN TỤ HUYẾT TRÙNG TRÂU BÒ, CÁC CHỦNG PB.1, PB.2, P.52, PBU.1 VÀ PBU.2 Master seed of microorganisms for veterinary use – Part 9: The procedure for preservation of Pasteurella multocida boviseptica, Pb.1, Pb.2, P.52, Pbu.1 and Pbu.2 strains HÀ NỘI 2011 TCVN 8683-9:2011 Lời nói đầu TCVN 8683-9:2011 chuyển đổi từ 10 TCN 265:1996 thành tiêu chuẩn quốc gia theo quy định khoản Điều 69 Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật điểm a khoản Điều Nghị định số 127/2007/NĐ-CP ngày 01/8/2007 Chính phủ quy định chi tiết thi hành số điều Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật; TCVN 8683-9:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN 8683-9:2011 TIỂU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8683-9:2011 Giống vi sinh vật thú y – Phần 9: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng trâu bò, chủng Pb.1, Pb.2, P.52, Pbu.1 Pbu.2 Master seed of microorganisms for veterinary use – Part 9: The procedure for preservation of Pasteurella multocida boviseptica, Pb.1, Pb.2, P.52, Pbu.1 and Pbu.2 strains CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn đưa hết tất vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an toàn sức khỏe thích hợp xác định khả áp dụng giới hạn quy định trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định quy trình giữ giống áp dụng cho việc giữ giống chủng Pb1, Pb2, P52, Pbu1 Pbu2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 8684:2011, Vắc xin chế phẩm sinh học dùng thú y – Phép thử độ khiết Yêu cầu giống vi sinh vật 3.1 Nhận dạng TCVN 8683-9:2011 Serotype đặc hiệu giống xác định nhiều phương pháp huyết học sau với kháng huyết đặc hiệu: – Ngưng kết nhanh phiến kính (kháng nguyên vi khuẩn sống) – Ngưng kết hồng cầu gián tiếp (kháng nguyên giáp mô) – Ngưng kết trực tiếp ống nghiệm (kháng nguyên xử lý axit) – Miễn dịch khuyếch tán (kháng nguyên chịu nhiệt kháng nguyên ổn định nhiệt) 3.1.1 Chuẩn bị động vật Chuẩn bị thỏ mẫn cảm, khỏe mạnh, có khối lượng từ 1,8 kg đến 2,0 kg 3.1.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn Giống đơng khơ hồn ngun nước thịt Ria lên thạch BAB có bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 24 h Chọn khuẩn lạc, cấy vào mơi trường BHI có bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 24 h Kháng nguyên, kháng huyết chuẩn bị sau: a) Chuẩn bị kháng huyết thanh: Canh khuẩn ria thạch BAB có bổ sung % máu thỏ, ủ 37 0C 18 h đến 20 h Rửa mặt thạch nước sinh lý 0,3 % formalin, thu hoạch huyễn dịch Pha loãng cho huyễn dịch đạt mật độ vào khoảng ống Brown’s số Tiêm cho thỏ với liều 0,2 ml; 0,5 ml; 1,0 ml; 1,5 ml cuối 2,0 ml kháng nguyên chết theo đường tĩnh mạch, lần cách ngày đến ngày Sau mũi tiêm kháng nguyên chết cuối tuần, tiêm cho thỏ liều 0,5 ml kháng nguyên sống tương ứng theo đường da bắp thịt 10 ngày sau tiêm mũi cuối thỏ lấy máu kiểm tra hiệu giá kháng thể Huyết bảo quản – 20 0C, lượng nhỏ bảo quản nhiệt độ 0C Huyết bổ sung 1/10000 merthiolat b) Chuẩn bị kháng nguyên: Dùng hai phương pháp sử dụng kháng nguyên: IHA, ngưng kết, khuếch tán thạch – Phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu cừu (IHA) (sử dụng kháng nguyên capsular) Chuẩn bị kháng nguyên: Canh khuẩn ria thạch BAB có bổ sung % máu thỏ, ủ 37 0C 18 h đến 20 h Rửa mặt thạch nước sinh lý có 0,3 % formalin, thu huyễn dịch Huyễn dịch đun 56 0C TCVN 8683-9:2011 30 min, sau ly tâm với gia tốc 000 g 15 0C Sau thu hoạch nước trong, bảo quản – 20 0C sử dụng kháng nguyên tinh khiết Chuẩn bị hồng cầu: Lấy hồng cầu cho vào ống vơ trùng có chất chống đơng ly tâm với gia tốc 500 g 10 Rửa hồng cầu lần nước sinh lý, sau tiến hành làm phản ứng Hồng cầu sử dụng cho phản IHA hồng cầu nhóm O người Có thể dùng hồng cầu cừu – Phản ứng ngưng kết ống nghiệm dùng đĩa 96 giếng (sử dụng kháng nguyên somatic) Chuẩn bị kháng nguyên: Canh trùng giống gốc cấy thạch BAB có bổ sung % máu thỏ, ủ 37 0C qua đêm Rửa mặt thạch nước sinh lý 0,3 % formalin, thu huyễn dịch Sau ly tâm với gia tốc 000 g 15 0C (hoặc từ 200 g đến 500 g 30 đến 45 nhiệt độ phòng) Bỏ phần nước trong, cặn vi khuẩn hoàn nguyên 2,5 ml dung dịch HCl N saline (0,85 % nước sinh lý dung dịch HCl N), cho mật độ vi khuẩn vào khoảng ống Brown’s số ủ qua đêm Huyễn dịch ly tâm lại loại bỏ phần nước trong, cặn tế bào rửa lần nước sinh lý (PBS) pH 5; 6; Cặn tế bào cuối đạt mật độ khoảng ống số Brown’s hoàn nguyên PBS pH Bất kỳ kháng nguyên tự ngưng kết phải loại bỏ 3.1.3 Cách tiến hành Phản ứng tiến hành đĩa 96 giếng đáy tròn Cho 50 µl nước sinh lý vào giếng bố trí A1 - D12 Cho 50 µl kháng ngun vào A1, B1 pha loãng theo số 2, dãy C1 - D12 dùng làm đối chứng hồng cầu Ủ 37 0C 24 h đọc kết Phản ứng âm tính kháng nguyên lắng xuống đáy giếng thành cục tròn, nước Phản ứng dương tính kháng ngun ngưng kết hình mạng nhện đáy giếng, hiệu giá ngưng kết đọc giếng ngưng kết cuối 3.2 Đặc tính ni cấy Vi khuẩn mọc tốt môi trường BHI bổ sung % huyết ngựa, pH từ 7,2 đến 7,4, yếm khí tùy tiện Khi ủ 37 0C 20 h đến 24 h, môi trường đục vẩn mây, khơng váng, khơng cặn 3.3 Hình thái vi khuẩn Vi khuẩn có dạng cầu trực khuẩn Gram âm, có giáp mơ, khơng nha bào, khơng di động, có tượng bắt màu hai cực TCVN 8683-9:2011 Trên thạch BAB có bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 16 - 18 h, khuẩn lạc dạng S, dung quang Fg Trên thạch máu cừu, khuẩn lạc có dạng tương tự, khơng làm tan máu 3.4 Kiểm tra tính độc 3.4.1 Chuẩn bị động vật – bê mẫn cảm, khỏe mạnh, từ tháng đến năm tuổi – nghé mẫn cảm, khỏe mạnh, từ tháng đến năm tuổi – thỏ mẫn cảm, khỏe mạnh, có khối lượng từ 1,8 kg đến 2,0 kg – chuột nhắt trắng khỏe mạnh, có khối lượng từ 18 g đến 20 g 3.4.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn Giống đơng khơ hồn ngun nước thịt Ria lên thạch BAB có bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 24 h Chọn khuẩn lạc, cấy vào môi trường BHI có bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 24 h Đếm số xác định mật độ vi khuẩn pha loãng đến nồng độ cần tiêm 3.4.3 Cách tiến hành Tiêm cho bê nghé, liều từ ml đến ml canh khuẩn pha loãng nồng độ 10 –1 (MLD: từ x 108 CFU/ml đến x 108 CFU/ml) theo đường da, gây chết động vật Tiêm cho thỏ, liều ml canh khuẩn pha loãng nồng độ 10 –9 (MLD: từ CFU/ml đến CFU/ml) theo đường da, gây chết thỏ Tiêm cho chuột nhắt trắng, liều 0,2 ml canh khuẩn pha loãng nồng độ 10 –7 (MLD: từ 15 CFU/ml đến 20 CFU/ml) theo đường da, gây chết chuột 3.5 Kiểm tra tính gây miễn dịch 3.5.1 Chuẩn bị động vật Chuẩn bị thỏ mẫn cảm, khỏe mạnh, có khối lượng từ 1,8 kg đến 2,0 kg 3.5.2 Chuẩn bị canh khuẩn vô hoạt Chọn khuẩn lạc cấy vào môi trường BHI bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 24 h Đếm số xác định mật độ vi khuẩn cho canh khuẩn đạt từ x 109 CFU/ml đến x 109 CFU/ml TCVN 8683-9:2011 Tiến hành vô hoạt canh khuẩn formol từ 0,2 % đến 0,4 % Để nhiệt độ phòng ngày đến ngày 3.5.3 Cách tiến hành Tiêm cho thỏ, liều x 10 CFU/ml đến x 10 CFU/ml theo đường da Thỏ sống 50 % so với thỏ đối chứng (không tiêm canh khuẩn vô hoạt) sau thử thách với 10 MLD chủng vi khuẩn cường độc tương ứng Phương pháp truyền giống 4.1 Chuẩn bị động vật – bê mẫn cảm, khỏe mạnh, từ tháng đến năm tuổi – nghé mẫn cảm, khỏe mạnh, từ tháng đến năm tuổi 4.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn Giống đơng khơ hồn ngun nước thịt Ria lên thạch BAB có bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 24 h Chọn khuẩn lạc, cấy vào mơi trường BHI có bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 16 h đến 18 h 4.3 Cách tiến hành Ria canh khuẩn từ 16 h đến 18 h thạch BAB huyết ngựa Làm tiêu nhuộm Gram để kiểm tra hình thái kiểm tra khiết theo TCVN 8684:2011 Tiêm cho từ bê đến bê (hoặc nghé), liều ml canh khuẩn nguyên theo đường da Chọn mổ động vật hấp hối sau chết, khoảng 20 h đến 72 h sau tiêm Thu hoạch máu tim Ria máu tim lên thạch BAB có bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 16 h đến 18 h Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào mơi trường thạch BAB có bổ sung % huyết ngựa làm lặp lại bước nêu trên, thay đổi liều tiêm cho bê x 108 CFU/con đến x 108 CFU/con Chọn khuẩn lạc điển hình cấy lên thạch BAB có bổ sung % máu cừu, ủ 37 0C 24 h Dùng huyết ngựa rửa mặt thạch, thu huyễn dịch đông khô Kiểm tra giống sau đông khô 5.1 Tiêu chuẩn vật lý TCVN 8683-9:2011 – Chế phẩm đóng thành bánh, xốp, màu đồng nhất, có chân không – Độ ẩm: không lớn % – Độ hòa tan: lắc nhẹ nước sinh lý, chế phẩm tan trở lại dung dịch ban đầu vòng đến 5.2 Yêu cầu kỹ thuật Giống đông khô phải đạt yêu cầu Điều Bao gói, ghi nhãn bảo quản 6.1 Bao gói Giống sau đơng khơ bao gói giấy, để túi nhựa 6.2 Ghi nhãn - Nơi sản xuất - Tên giống - Số lô…ngày…tháng…năm… sản xuất - Người thực - Điều kiện bảo quản 6.3 Bảo quản Giống giữ nhiệt độ đến 0C năm Thư mục tài liệu tham khảo OIE Manual 2008: Chapter 2.4.12: Haemorrhagic septicaemmia .. .TCVN 8683-9:2011 Lời nói đầu TCVN 8683-9:2011 chuyển đổi từ 10 TCN 265:1996 thành tiêu chuẩn quốc gia theo quy định khoản Điều 69 Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật điểm a... chi tiết thi hành số điều Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật; TCVN 8683-9:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định,... cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN 8683-9:2011 TIỂU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8683-9:2011 Giống vi sinh vật thú y – Phần 9: Quy trình giữ giống vi khuẩn