Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 739-2006 về Sữa tươi - Xác định Tetracycline - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) áp dụng để xác định dư lượng Tetracycline trong sữa tươi. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN 10TCN TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 7392006 SỮA TƯƠIXÁC ĐỊNH TETRACYCLINE PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 10 TCN 7392006 Hà Nội 2006 TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 739 2006 SỮA TƯƠIXÁC ĐỊNH TETRACYCLINE PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) (freshmilk determination of Tetracycline) (Ban hành kèm theo Quyết định số QĐ/BNNKHCN ngày tháng 6 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nơng nghiệp và Phát triển nơng thơn) 1.Đối tượng và phạm vi áp dụng Qui trình này áp dụng để xác định dư lượng Tetracycline trong sữa tươi Giới hạn phát hiện của phương pháp là: 50 g/l 2.Giải thích thuật ngữ Dư lượng Tetracycline trong sữa tươi: Lượng Tetracycline còn tồn dư trong sữa tươi chưa biến đổi thành dạng khác 3. Ngun tắc Tetracycline được chiết ra từ mẫu bằng dung mơi thích hợp, sau đó được làm sạch và đưa vào phân tích sắc ký. Tetracycline được tách ra trên pha tĩnh của cột C18 và được phát hiện bởi detector UV Vis 4. Hố chất và thuốc thử Hố chất và thuốc thử phải đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho sắc ký 4.1. Acetonitrile; 4.2. Methanol; 4.3. Dung dịch axit trichloroacetic 1g/ml trong nước ; 4.4. Dung dịch axít oxalic 0,01M nước cất; lọc bằng phễu với màng lọc kích thước lỗ 0,45 m bằng chân khơng (5.20); 4.5. Dung dịch axit oxalic 0,01M trong methanol ; 4.6. Dung dịch axít citric 0.1M trong nước ; 4.7. Dung dịch disodium photphat 0.2M trong nước ; 10 TCN 7392006 4.8. Disodium Ethylene Diamine Tetraacetate Dihydrat (EDTA); 4.9. Dung dịch đệm Mc livaine: trộn đều 1l dung dịch axít citric (4.6) với 625 ml dung dịch disodium photphat (4.7), chỉnh pH 4 0,05; 4.10. Dung dịch đệm Mc livaine/EDTA: hồ tan 60,5g EDTA (4.8) trong 1,625 l dung dịch đệm Mc livaine (4.9); 4.11. Dumg mơi pha động: Acetonitrile (4.1) và dung dịch axít oxalic 0,01M (4.4); 4.12. Chuẩn Tetracycline 5. Thiết bị, dụng cụ: 5.1. Ống ly tâm polypropylene, 50ml có nắp; 5.2. Ống thuỷ tinh 30ml, có nắp; 5.3. Ống polypropylen 5ml, có nắp; 5.4. Bình định mức 25; 50; 100; 200; 1000 ml; 5.5. Pipet thuỷ tinh 2; 5; 20; 25ml; 5.6. Pipet tự động 100 l; 250 l; 1ml; 5.7. Máy ly tâm tốc độ cao 20.000vòng/phút; 5.8. Cân phân tích 100mg – 2000g; 5.9. Cân phân tích kỹ thuật 10mg – 210g có độ chính xác đến 0,1mg; 5.10. Hút dung mơi tự động 5ml; 25ml; 50ml; 5.11. Máy đo pH có độ chính xác đến 0,01; 5.12. Máy lắc vortex 700vòng/phút; 5.13. Máy lắc quay tròn; 5.14. Máy khuấy từ; 5.15. Máy ly tâm lạnh 6000vòng/phút 40C; 5.16. Cột chiết pha rắn BondElut C18, 3cc, 500mg; 5.17. Bộ chiết pha rắn Manifold (supelco), adaptor, kim; 5.18. Bơm chân khơng 0,4 bar, 12w; 5.19. Phễu lọc đường kính 25mm, thể tích 50ml; 5.20. Gía đỡ phễu lọc và màng lọc kích thước lỗ 0,45 m; 5.21. Hệ thống máy sắc kí lỏng HPLC: Bơm 2 kênh dung mơi gradient; Detector UV Vis; Máy tính và phần mềm phân tích; Cột phân tích RP C18, 25 cm x 4,6 mm, 5 m 6. Lấy mẫu và bảo quản mẫu: Lấy mẫu theo TCVN 5531:1991 Mẫu được bảo quản ở –200C. Mẫu phải được giải đơng trước khi phân tích 7. Cách tiến hành 10 TCN 7392006 Phải tiến hành phân tích đồng thời mẫu âm tính, mẫu dương tính và mẫu phân tích 7.1 Chiết tách: Chiết mẫu: Lấy 5ml mẫu đã được giải đơng cho vào ống ly tâm (5.1). Cho vào đó 25 ml dung dịch đệm Mc Ivaine/ EDTA (4.10), lắc 30 giây bằng máy lắc vortex (5.12). Lắc 15 phút máy lắc quay tròn (5.13) tốc độ 100 vòng/phút Ly tâm tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ 40C bằng máy ly tâm lạnh (5.15). Kết tủa protein: Chuyển phần lỏng vào ống thuỷ tinh 30 ml (5.2); đặt ống vào cốc phòng thí nghiệm đưa lên máy khuấy từ (5.14) Cho từ từ 2,5 ml dung dịch axit tricloroacetic 1g/ml (4.3) vào và khuấy đều. Sau đó khuấy nhanh hơn trong 1 phút. Nhấc ống ra khỏi máy quấy từ. Ly tâm 5 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút 7.2. Làm sạch: Hoạt hố cột chiết pha rắn Bond Elut (5.16) bằng 1ml methanol, 1ml nước và cuối cùng là 1ml nước đệm Mc livaine (4.9); Nối phễu lọc (5.19) với cột, bộ chiết pha rắn (5.17) và bơm chân khơng (5.18); Chuyển dung dịch mẫu lên phễu lọc (5.19) để mẫu được lọc bằng bơm chân khơng (5.18) Điều chỉnh tốc độ lọc khơng q 2 giọt/giây. Khơng để cột bị khơ trong bước này; Bỏ phễu và rửa cột bằng 1ml nước cất; Làm khơ cột trong 5 phút bằng bơm chân khơng; Rửa giải cột lần lượt bằng 1ml dung dịch axit oxalic 0,01M trong methanol (4.5), ti ếp theo ml nước cất vào ống polypropylen (5.3) Ly tâm phút với tốc độ 20.000 vòng/phút ở 4oC bằng máy ly tâm tốc độ cao (5.21) trước khi bơm mẫu lên hệ thống máy HPLC (5.22); 7.3 Xây dựng đường chuẩn: Dung dịch chuẩn gốc 1 mg/ml: Pha chuẩn có nồng độ 1mg/ml trong methanol. Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở 20oC trong 1 tháng Dung dịch chuẩn dùng để phân tích mẫu: Dung dịch chuẩn trung gian 50 g/ml: Pha loãng dung dịch chuẩn gốc nồng độ 1mg/ml trong methanol để được dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ 50 g/ml. Bảo quản ở 40C trong 1 tuần; Dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 0,125; 0,25; 0,5 và 1 g/ml: Pha lỗng dung dịch chuẩn trung gian 50 g/ml bằng dung dịch axit oxalic 0,01M (axit oxalic 0,01M pha trong 10 TCN 7392006 methanol/nước theo tỷ lệ 30/70) để có dung dịch chuẩn làm việc nồng độ 0,125; 0,25; 0,5 và 1 g/ml. Những dung dịch chuẩn này được pha và sử dụng hàng ngày 7.4 Phân tích sắc kí: Điều kiện chạy máy: Pha động Thời gian 0 phút 15 phút Acetonitrile (4.1) (%) 13 36 Dung dịch axit oxalic 0,01M (4.4) (%) 87 64 Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút; Bước sóng: 355 nm; 8. Tính tốn và biểu thị kết quả 8.1Xử lý kết quả thu được: Dựa vào thời gian lưu (độ lệch 5% ) và chiều cao (diên tích) của pic chuẩn và pic mẫu để xác định và tính kết quả 8.2Kết quả được tính theo phương pháp đường chuẩn trong đó đường chuẩn được xây dựng từ kết quả thu được của các dung dịch chuẩn làm việc. Phương trình đường chuẩn: y ax b Trong đó: y là diện tích pic x là nồng độ (ng/ml) a là hệ số góc b là hằng số Hàm lượng của Tetracycline trong mẫu được tính bằng phương trình đường chuẩn và độ thu hồi theo cơng thức: Cf Ca F R Trong đó: Ca: Nồng độ Tetracycline trong mẫu phân tích Cf: Nồng độ cuối cùng của mẫu đối chứng R: Độ thu hồi F: Hệ số nồng độ 3 Độ thu hồi: Độ thu hồi được xác định từ mẫu đối chứng, xác định bằng phương pháp đường chuẩn theo công thức: Cf Yt b a 10 TCN 7392006 Trong đó: Cf: nồng độ cuối cùng của mẫu đối chứng Yt: diện tích pic mẫu đối chứng a: hệ số góc b: hằng số Độ thu hồi được xác định như sau: Cf R F Ct Trong đó: R: Độ thu hồi Cf: Nồng độ cuối cùng của mẫu đối chứng được xác định như trên Ct: Nồng độ thực (nồng độ chuẩn cho vào mẫu trắng ) F: Hệ số nồng độ Kiểm tra lại kết quả phân tích: Kết quả được chấp nhận nếu độ thu hồi đạt được giới hạn sau: Rm SD Trong đó: R Rm SD R: Độ thu hồi Rm: Độ thu hồi trung bình SD: Độ lệch chuẩn của độ thu hồi trung bình 8.3 Biểu thị kết quả: mg/l đến 3 chữ số sau dấu phẩy 9. Tài liệu tham khảo: Dtermination of Tetracyclines residues in kidney and muscle by HPLC AFSSA Fougères (pháp) Dtermination of Tetracycline residues in milk by HPLC AFSSA Fougères (pháp) Chlortetracycline, Oxytetracycline and Tetracycline in Edible Animal Tissues AOAC Offical Method 995.09. KT. BỘ TRƯỞNG THỨ TRƯỞNG Bùi Bá Bổng ... 10 TCN 7392006 Hà Nội 2006 TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 739 2006 SỮA TƯƠIXÁC ĐỊNH TETRACYCLINE... HPLC (5.22); 7.3 Xây dựng đường chuẩn: Dung dịch chuẩn gốc 1 mg/ml: Pha chuẩn có nồng độ 1mg/ml trong methanol. Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở 20oC trong 1 tháng Dung dịch chuẩn dùng để phân tích mẫu: ... 5.4. Bình định mức 25; 50; 100 ; 200; 100 0 ml; 5.5. Pipet thuỷ tinh 2; 5; 20; 25ml; 5.6. Pipet tự động 100 l; 250 l; 1ml; 5.7. Máy ly tâm tốc độ cao 20.000vòng/phút; 5.8. Cân phân tích 100 mg – 2000g; 5.9. Cân phân tích kỹ thuật 10mg – 210g có độ chính xác đến 0,1mg;