Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 9723:2013 - ISO 20481:2008 trình bày về Cà phê và sản phẩm cà phê – xác định hàm lượng Cafein bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) – phương pháp chuẩn. Mời các bạn cùng tham khảo.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9723:2013 ISO 20481:2008 CÀ PHÊ VÀ SẢN PHẨM CÀ PHÊ – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) – PHƯƠNG PHÁP CHUẨN Coffee and coffee products – Determination of the caffeine content using high performance liquid chromatography (HPLC) – Reference method Lời nói đầu TCVN 9723:2013 hồn tồn tương đương với ISO 20481:2008; TCVN 9723:2013 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F16 Cà phê sản phẩm cà phê biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố CÀ PHÊ VÀ SẢN PHẨM CÀ PHÊ – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) – PHƯƠNG PHÁP CHUẨN Coffee and coffee products – Determination of the caffeine content using high performance liquid chromatography (HPLC) – Reference method Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) để xác định hàm lượng cafein của: cà phê nhân; cà phê rang; cà phê hòa tan, loại thơng thường loại tách cafein; sản phẩm cà phê hòa tan hỗn hợp (ví dụ: hỗn hợp cà phê/chicory (rễ rau diếp xoăn) đồ uống từ cà phê kiểu capuccino) Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 2230 (ISO 565), Sàng thử nghiệm – Lưới kim loại đan, kim loại đột lỗ lưới đột lỗ điện – Kích thước lỗ danh nghĩa TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích phòng thí nghiệm – u cầu kỹ thuật phương pháp thử TCVN 5567 (ISO 3726), Cà phê hòa tan – Phương pháp xác định hao hụt khối lượng nhiệt độ 70 oC áp suất thấp TCVN 6928 (ISO 6673), Cà phê nhân – Xác định hao hụt khối lượng 105 oC TCVN 7151 (ISO 648), Dụng cụ thí nghiệm thủy tinh – Pipet mức TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm thủy tinh – Bình định mức TCVN 9721 (ISO 11817), Cà phê rang xay – Xác định độ ẩm – Phương pháp Karl Fischer (Phương pháp chuẩn) Nguyên tắc Cafein chiết khỏi mẫu nước 90 oC với có mặt magie oxit Sau lọc, hàm lượng cafein dịch chiết xác định HPLC cột RP-18, dùng phương pháp rửa giải đẳng dòng, sử dụng detecter UV bước sóng khoảng 272 nm Khi thích hợp, hàm lượng cafein tính theo chất khơ độ ẩm xác định phương pháp chuẩn phù hợp Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích nước phù hợp với yêu cầu loại TCVN 4851 (ISO 3696) trừ có quy định khác 4.1 Metanol, loại dùng cho HPLC 4.2 Magie oxit (MgO), loại nặng, có chất lượng cao1 CHÚ THÍCH: Việc sử dụng MgO quan trọng tuổi thọ cột phân tích, đặc biệt phân tích cà phê nhân Lượng MgO sử dụng tùy thuộc vào thiết bị dạng sản phẩm cà phê Dữ liệu độ chụm Phụ lục A thu quy trình mơ tả tiêu chuẩn Việc xuất pic gây nhiễu sắc đồ hấp thụ không Trong trường hợp này, cần kiểm tra MgO sử dụng 4.3 Cafein (1,3,7-trimetylxantin; 1,3,7-trimetyl-1H-purin-2,6(3H,7H)-dion; metyltheobrom; C8H10N4O2), dạng khan tinh khiết 4.4 Pha động, 24 % phần thể tích metanol nước CHÚ Ý AN TỒN – Đeo găng tay, kính bảo vệ mắt phân phối thuốc thử buồng hút khói tốt Chuyển 240 ml metanol (4.1) vào bình định mức vạch lít (5.11) Thêm nước đến vạch, trộn lọc qua lọc cỡ lỗ 0,45 µm (5.2) CHÚ THÍCH: Thời gian lưu cafein chỉnh để tối ưu hóa việc tách HPLC cột sử dụng cách thay đổi tỷ lệ metanol với nước 4.5 Dung dịch chuẩn cafein 4.5.1 Dung dịch gốc, tương ứng với 200 mg/l Cân (0,200 ± 0,100) g cafein dạng khan (4.3) vào bình định mức vạch lít (5.11) Thêm nước ấm đủ đến nửa bình Xoay bình để hòa tan cafein, để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm nước đến vạch trộn Dung dịch bền tháng bảo quản +4 oC Bảo quản dung dịch tủ lạnh 4.5.1 Dung dịch chuẩn pha loãng cà phê thông thường, tương ứng với khoảng 40 mg/l Dùng pipet (5.12) lấy 50 ml dung dịch chuẩn gốc cafein (4.5.1) cho vào bình định mức vạch 250 ml (5.11) Thêm nước đến vạch trộn Chuẩn bị dung dịch chuẩn pha loãng ngày sử dụng 4.5.3 Dung dịch chuẩn pha loãng cà phê tách cafein, tương ứng với khoảng mg/l Dùng pipet (5.12) lấy ml dung dịch chuẩn gốc cafein (4.5.1) cho vào bình định mức vạch 250 ml (5.11) Thêm nước đến vạch trộn Chuẩn bị dung dịch chuẩn pha loãng ngày sử dụng 4.5.4 Đường chuẩn Việc sử dụng từ ba đến năm điểm đường chuẩn tùy chọn Dải nồng độ khuyến cáo từ mg/l đến 25 mg/l mẫu cà phê thông thường từ 0,5 mg/l đến 2,5 mg/l mẫu tách cafein Thiết bị, dụng cụ Merck 105867 ví dụ sản phẩm phù hợp bán sẵn Thông tin đưa tạo thuận tiện cho người sử dụng không ấn định phải sử dụng sản phẩm Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường cụ thể sau: 5.1 Cân phân tích, có khả cân xác đến ± 0,1 mg 5.2 Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,45 µm, để lọc pha động dịch chiết mẫu pha loãng 5.3 Máy sắc ký lỏng hiệu nâng cao, trang bị để thực rửa giải đẳng dòng, có detector UV cài đặt 272 nm (270 nm đến 280 nm) detector có lọc (254 nm) có hệ thống thu nhận/tích phân liệu Việc sử dụng khử khí tùy chọn 5.4 Cột sắc ký dùng cho HPLC, dài tối thiểu 125 mm, nhồi vật liệu C18, tốt hạt hình cầu có cỡ µm, hiệu tách 000 đĩa lý thuyết Số đĩa lý thuyết cột, Nth tính cách xác định diện tích pic sau bơm dung dịch chuẩn cafein, Công thức (1): Nth = tr b 5,54 (1) Trong đó: tr thời gian lưu pic, tính giây (s); b chiều rộng pic, nửa chiều cao pic, tính giây (s) 5.5 Máy khuất từ, có phận gia nhiệt nồi cách thủy 5.6 Bể siêu âm 5.7 Xiranh microlit 5.8 Máy xay cà phê, phù hợp để xay nhân cà phê rang 5.9 Máy xay với bánh xe có răng, có túi làm lạnh, máy nghiền phân tích, có lưỡi dao túi làm lạnh dụng cụ phù hợp khác để xay nhân cà phê nhân 5.10 Sàng, cỡ lỗ danh định 630 µm, phù hợp với yêu cầu TCVN 2230 (ISO 565), dãy R 20 5.11 Bình định mức vạch, dung tích lít 250 ml, phù hợp với loại A TCVN 7153 (ISO 1042) 5.12 Pipet, dung tích 50 ml ml, phù hợp với loại A TCVN 7151 (ISO 648) Lấy mẫu Phòng thử nghiệm phải nhận mẫu đại diện Mẫu không hư hỏng thay đổi suốt trình vận chuyển bảo quản Việc lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn Các bên có liên quan cần thỏa thuận với vấn đề Bảo quản mẫu thử cho mẫu không bị giảm chất lượng thay đổi thành phần Trong trường hợp bột uống hỗn hợp, cần tối thiểu 50 g sản phẩm (đối với bao gói chia nhỏ: tối thiểu năm bao gói) Chuẩn bị mẫu thử 7.1 Cà phê nhân Dùng máy nghiền (5.9) nghiền nhân cà phê nhân cho 50 % phần khối lượng mẫu lọt qua sàng (5.10) Sau lấy mẫu thử từ toàn cà phê bột trộn kỹ 7.2 Cà phê rang Dùng máy xay (5.8) xay nhân cà phê rang cho 50 % khối lượng lọt qua sàng (5.10) Dùng cà phê rang xay bao gói bán sẵn mà khơng cần xử lý thêm đồng hóa mẫu 7.3 Cà phê hòa tan Đối với cà phê hòa tan khơng cần xay 7.4 Đồ uống hỗn hợp Dùng máy xay (5.8) đồng hóa bột uống cà phê hỗn hợp trước chiết để tránh bị tách rời Cách tiến hành 8.1 Phép xác định tùy chọn chất khô cà phê (xem 9.2) Tính hàm lượng chất khơ cà phê sử dụng 9.2 từ độ ẩm xác định phần mẫu thử (Điều 7) theo: - TCVN 6928 (ISO 6673) cà phê nhân, - TCVN 9721 (ISO 11817) cà phê rang, - TCVN 5567 (ISO 3726) cà phê hòa tan Đối với dạng khác cà phê sản phẩm có nguồn gốc từ cà phê, bên có liên quan cần thỏa thuận phép xác định hàm lượng chất khô 8.2 Phần mẫu thử 8.2.1 Cà phê rang cà phê nhân Dùng cân (5.1) cân khoảng g mẫu thử (7.1, 7.2) xác đến miligam chuyển vào bình định mức 250 ml (5.11) 8.2.2 Cà phê hòa tan Dùng cân (5.1) cân khoảng 0,5 g mẫu thử (7.3) xác đến miligam chuyển vào bình định mức 250 ml (5.11) 8.2.3 Đồ uống hỗn hợp Dùng cân (5.1) cân khoảng g mẫu thử (7.4) xác đến miligam chuyển vào bình định mức 250 ml (5.11) 8.3 Chiết cafein Thêm g magie oxit (4.2) khoảng 200 ml nước vào phần mẫu thử (8.2.1, 8.2.2 8.2.3) đựng bình định mức Đặt bình vào nồi cách thủy trì điểm sơi chờ dung dịch đạt đến 90 oC Tiếp tục gia nhiệt bình nồi cách thủy 20 min, trộn lượng chứa bình cách khuấy lắc bình Lấy bình khỏi nồi cách thủy, làm nguội đến nhiệt độ phòng vòi nước thêm nước đến vạch Chờ chất rắn lắng xuống Lấy phần dịch lỏng phía lọc qua lọc cỡ lỗ 0,45 µm (5.2), loại bỏ vài mililit Dịch lọc dùng để tách HPLC 8.4 Xác định 8.4.1 Chỉnh thiết bị ĐIỀU QUAN TRỌNG – Pha động phải khử khí 20 bể siêu âm (5.6) lọc heli trước sử dụng Nếu thiết bị HPLC có khử khí, 10 đủ Cài đặt máy sắc ký (5.3) theo dẫn nhà sản xuất chỉnh sau: a) tốc độ dòng pha động (4.4): 1,0 ml/min; b) detector UV cài đặt 272 nm (hoặc 254 nm trường hợp detector có lọc) Đảm bảo phạm vi nhạy detector phù hợp với pic dung dịch chuẩn (trong trường hợp nhiều chất chuẩn, theo pic cao nhất) 8.4.2 Phân tích HPLC Khi tốc độ dòng pha động áp suất tương ứng ổn định, hệ thống cân 10 Sau bơm 10 µl dung dịch chuẩn lên cột, dùng xyranh microlit (5.7), lần chạy sau đó, bơm tiếp thể tích tương tự dịch chiết mẫu (8.3) Khi sử dụng dung dịch chuẩn đơn lẻ, bơm với khoảng cách đặn (thông thường sau sáu lần bơm dịch chiết mẫu bơm lần) Sau mẻ phân tích, rửa kỹ hệ thống sắc ký với cột metanol 50 % thể tích (4.1) nước, đậy nút cột để bảo quản không tiếp tục dùng Tính kết 9.1 Hàm lượng cafein mẫu Tính hàm lượng cafein, wx, biểu thị phần trăm khối lượng, tương đương với gam 100 g cà phê, theo Công thức (2): wx = Ax cV 100 Ac ms Ax c 25 Ac ms (2) Trong đó: Ac diện tích pic cafein dung dịch chuẩn cafein xác định HPLC, tính đơn vị diện tích; Ax diện tích pic cafein dung dịch mẫu xác định HPLC, tính đơn vị diện tích; ms khối lượng phần mẫu thử, tính gam (g); V thể tích dung dịch mẫu chiết được, xác định 8.2 (V = 0,25 l), tính lít (l); ρc nồng độ khối lượng dung dịch chuẩn cafein, tính gam lít (g/l) CHÚ THÍCH: Chiều cao pic sử dụng để thay cho diện tích pic Nếu sử dụng nhiều chuẩn hiệu chuẩn dựng đường chuẩn tuyến tính nồng độ chuẩn cafein, để thu độ dốc giá trị chắn Sử dụng đường chuẩn để tính nồng độ cafein mẫu Lấy kết giá trị trung bình hai lần xác định tiến hành điều kiện lặp lại (10.2) 9.2 Phép xác định tùy chọn hàm lượng cafein mẫu theo chất khơ (xem 8.1) Tính hàm lượng cafein, w’x, theo phần trăm khối lượng, tương ứng với số gam 100 g chất khô, Công thức (3): w’x = Ax cV 100 100 Ac ms wd Ax 2500 Ac ms wd c (3) wd hàm lượng chất khô mẫu (gam 100 g), xác định 8.1 Lấy kết giá trị trung bình hai lần xác định tiến hành điều kiện lặp lại (10.2) 10 Độ chụm 10.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm Các kết chi tiết phép thử liên phòng thử nghiệm để xác định độ chụm phương pháp nêu Phụ lục A Các kết cafein đưa theo loại cà phê Các giới hạn lặp lại giới hạn tái lập định nghĩa 3.16 3.20 TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994) [2], tương ứng, tính theo 4.14 TCVN 6910-6:2002 (ISO 5725-6:1994) [4] Để ước tính giới hạn tái lập Horwitz, sử dụng hàm Horwitz Tài liệu viện dẫn [6] Các giá trị thu từ phép thử liên phòng thử nghiệm khơng áp dụng cho dải nồng độ chất khác với giá trị nêu Dữ liệu độ chụm đánh giá theo TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994) nêu Bảng Bảng – Giá trị trung bình, giới hạn lặp lại giới hạn tái lập Mẫu/sản phẩm Giá trị trung bình Giới hạn lặp lại Giới hạn tái lập r R % phần khối lượng % phần khối lượng % phần khối lượng Cà phê nhân Cà phê tách cafein (decaf) 0,057 0,004 0,009 Cà phê tách cafein 0,075 0,003 0,006 Cà phê chè (arabica) thông thường 1,14 0,05 0,15 Cà phê vối (robusta) thông thường 2,18 0,096 0,37 Cà phê rang Cà phê tách cafein 0,055 0,007 0,026 Hỗn hợp cà phê thông thường/ cà phê tách cafein 0,642 0,054 0,091 Cà phê thông thường 1,22 0,053 0,176 Bột uống có thành phần cà phê Cà phê kiểu cappucino 0,403 0,024 0,068 Cà phê hòa tan Cà phê tách cafein 0,072 0,004 0,024 Cà phê tách cafein 0,109 0,008 0,030 Cà phê đông khô thông thường 2,51 0,050 0,23 Cà phê kết tụ thông thường 3,19 0,085 0,372 0,066 0,216 Hỗn hợp cà phê hòa tan Cà phê/chicory 2,45 10.2 Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối kết hai phép thử nghiệm độc lập, đơn lẻ thu sử dụng phương pháp, vật liệu thử, phòng thử nghiệm, người thực hiện, sử dụng thiết bị, khoảng thời gian ngắn, không % (nghĩa độ lặp lại xác suất 95 %) trường hợp vượt giá trị giới hạn lặp lại, r, nêu Bảng 10.3 Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử nghiệm đơn lẻ thu sử dụng phương pháp, tiến hành thử vật liệu giống thử hệt nhau, phòng thử nghiệm khác nhau, người khác thực hiện, sử dụng thiết bị khác nhau, không % (nghĩa độ tái lập xác suất 95 %) trường hợp vượt giá trị giới hạn tái lập, R, nêu Bảng 11 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm thơng tin sau: a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu; b) phương pháp sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; c) kết thử nghiệm thu được; d) kiểm tra độ lặp lại, nêu kết cuối thu được; e) chi tiết thao tác khác với quy định tiêu chuẩn tùy chọn cố ảnh hưởng đến kết thử nghiệm Phụ lục A (Tham khảo) Dữ liệu độ chụm nghiên cứu đánh giá xác nhận phương pháp xác định cafein cà phê sản phẩm cà phê Bảng A.1 – Dữ liệu độ chụm phép thử liên phòng thử nghiệm phép xác định cafein cà phê sản phẩm cà phê Cà phê nhân Thơng số Bột uống có cà phê Cà phê rang Hỗn hợp hòa tan Cà phê hòa tan Cà Hỗn hợp Đông Arabica Robusta Kết tụ phê/rễ Đã tách Đã tách Đã tách thông Thông Kiểu Đã tách Đã tách khô thông thông thông rau cafein cafein cafein thường/đã thường cappucino cafein cafein thông thường thường thường diếp tách cafein thường xoăn Số lượng phòng thử nghiệm tham gia 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 Bộ liệu giữ lại sau loại trừ ngoại lệ 16 15 16 16 16 16 16 15 15 15 15 16 14 Số lượng liệu ngoại lệ w/o 32 29 33 32 32 32 32 30 29 29 30 32 28 Hàm lượng trung bình, % khối lượng 0,057 0,075 1,14 2,18 0,055 0,642 1,22 0,403 0,072 0,109 2,51 3,19 2,45 Trung bình, % khối lượng 0,057 0,075 1,13 2,22 0,056 0,643 1,22 0,400 0,074 0,109 2,51 3,19 2,47 Độ lệch chuẩn lặp lại, sr 0,0014 0,0011 0,018 0,034 0,0026 0,019 0,019 0,0085 0,0016 0,0027 0,018 0,30 0,024 Giới hạn lặp lại, r = 2,8 x sr 0,004 0,003 0,05 0,096 0,007 0,054 0,053 0,024 0,004 0,008 0,050 0,085 0,066 Hệ số biến thiên lặp lại, % 2,4 1,5 1,6 1,6 4,7 3,0 1,6 2,1 2,2 2,5 0,7 1,0 1,0 0,052 0,133 0,0093 0,033 0,063 0,024 0,0085 0,107 0,083 0,133 0,077 0,006 0,15 0,37 0,026 0,091 0,176 0,068 0,024 0,030 0,23 0,372 0,216 3,1 4,6 6,1 16,8 5,1 5,2 6,1 11,8 9,8 3,3 4,2 3,1 0,012 0,125 0,217 0,010 0,077 0,133 0,052 0,012 0,017 0,245 0,30 0,24 0,5 1,2 1,7 2,7 1,2 1,3 1,3 2,0 1,7 0,9 1,2 0,9 Độ lệch chuẩn tái lập, sR 0,0033 0,0023 Giới hạn tái lập, R = 2,8 x sR 0,009 Hệ số biến thiên tái lập, % 5,8 Giới hạn tái lập theo Horwitz 0,010 Chỉ số HorRat R/RHorr 0,9 THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] ISO Guide 30:1992, Term and definition used in connection with reference material [2] TCVN 6910-1:2010 (ISO 5725-1:1994), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo – Phần 1: Nguyên tắc định nghĩa chung [3] TCVN 6910-2:2010 (ISO 5725-2:1994), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo – Phần 2: Phương pháp xác định độ lặp lại độ tái lập phương pháp đo tiêu chuẩn [4] TCVN 6910-6:2010 (ISO 5725-6:1994), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo – Phần 6: Sử dụng giá trị độ xác thực tế [5] TCVN 9722 (ISO 20938), Cà phê hòa tan – Xác định độ ẩm – Phương pháp Karl Fischer (Phương pháp chuẩn) [6] Thompson, M Ellison, S.R.L., Wood, R., for the international working party for harmonization of quality assuarance schemes The international harmonized protocol for the proficiency testing of analitycal chemistry laboratories IUPAC technical report Pure appl.Chem 2006, 78, pp 145196 Available (2007-12-06) at: http://www.iupac.org/pulications/pac/2006/pdf/7801x0145.pdf ... [3] TCVN 691 0-2 :2010 (ISO 572 5-2 :1994), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo – Phần 2: Phương pháp xác định độ lặp lại độ tái lập phương pháp đo tiêu chuẩn [4] TCVN 691 0-6 :2010 (ISO 572 5-6 :1994),... dụng 9.2 từ độ ẩm xác định phần mẫu thử (Điều 7) theo: - TCVN 6928 (ISO 6673) cà phê nhân, - TCVN 9721 (ISO 11817) cà phê rang, - TCVN 5567 (ISO 3726) cà phê hòa tan Đối với dạng khác cà phê sản... hạn lặp lại giới hạn tái lập định nghĩa 3.16 3.20 TCVN 691 0-1 :2001 (ISO 572 5-1 :1994) [2], tương ứng, tính theo 4.14 TCVN 691 0-6 :2002 (ISO 572 5-6 :1994) [4] Để ước tính giới hạn tái lập Horwitz,