Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4884:2005 - ISO 4833:2003 giới thiệu đến người đọc nội dung về vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - phương pháp định lượng vi sinh vật trên đĩa thạch - kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 oc. Mời các bạn tham khảo.
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 4884 : 2005 ISO 4833 : 2003 VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT TRÊN ĐĨA THẠCH - KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Ở 30 oC Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of microorganisms - Colony count technique at 30 oC Lời giới thiệu Do tính đa dạng thực phẩm thức ăn chăn ni nên phương pháp khơng thích hợp đến chi tiết cho sản phẩm cụ thể Trong trường hợp này, sử dụng phương pháp khác đặc trưng cho sản phẩm, hoàn tồn lý kỹ thuật Tuy nhiên, cần cố gắng áp dụng phương pháp Khi tiêu chuẩn sốt xét tiếp cần phải tính đến thơng tin liên quan đến phạm vi mà phương pháp đếm đĩa phải tuân theo nguyên nhân gây sai lệch so với phương pháp trường hợp sản phẩm cụ thể Việc hài hòa phương pháp thử khơng thực vài nhóm sản phẩm tồn tiêu chuẩn quốc tế và/hoặc tiêu chuẩn quốc gia mà không phù hợp với tiêu chuẩn Trong trường hợp có sẵn tiêu chuẩn quốc tế cho sản phẩm cần thử nghiệm phải tuân theo tiêu chuẩn Hy vọng tiêu chuẩn sốt xét, chúng phải sửa đổi để phù hợp với tiêu chuẩn này, cho cuối sai lệch với phương pháp đếm đĩa lý kỹ thuật thừa nhận VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT TRÊN ĐĨA THẠCH - KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Ở 30 oC Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of microorganisms - Colony count technique at 30 oC Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp định lượng vi sinh vật đĩa thạch cách đếm khuẩn lạc phát triển môi trường đặc sau ủ điều kiện hiếu khí 30 °C Tiêu chuẩn áp dụng cho sản phẩm dùng cho người thức ăn chăn nuôi Khả áp dụng tiêu chuẩn bị hạn chế kiểm tra thực phẩm thức ăn chăn nuôi lên men Để kiểm tra thực phẩm thức ăn chăn ni lên men mơi trường và/hoặc điều kiện ủ khác thích hợp Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi TCVN 6507 (tất phần) (ISO 6887), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi Chuẩn bị mẫu thử dung dịch huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218 : 1996), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi Nguyên tắc chung kiểm tra vi sinh vật TCVN 6253 (ISO 8261), Sữa sản phẩm sữa Chuẩn bị mẫu thử dung dịch pha loãng để kiểm tra vi sinh ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory (Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn bị tạo môi trường cấy - Phần 1: Các hướng dẫn chung đảm bảo chất lượng cho việc chuẩn bị mơi trường cấy phòng thử nghiệm) Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau đây: 3.1 vi sinh vật (micro-organisms) vi khuẩn, nấm men nấm mốc hình thành khuẩn lạc đếm được, sinh điều kiện qui định tiêu chuẩn Nguyên tắc 4.1 Chuẩn bị hai đĩa rót sử dụng mơi trường cấy qui định lượng mẫu thử qui định, sản phẩm ban đầu dạng lỏng, dùng lượng huyền phù ban đầu qui định sản phẩm dạng khác Chuẩn bị cặp đĩa rót khác, điều kiện, sử dụng dung dịch pha loãng thập phân mẫu thử huyền phù ban đầu 4.2 Ủ điều kiện hiếu khí đĩa 30 °C 72 h 4.3 Tính số lượng vi sinh vật mililit gam mẫu từ số lượng khuẩn lạc thu đĩa chọn (xem điều 10) Mơi trường cấy dịch pha lỗng Đối với thực hành phòng thử nghiệm, xem TCVN 6404 (ISO 7218) ISO/TS 11133-1 5.1 Dịch pha loãng Xem phần tương ứng TCVN 6507 (ISO 6887) 5.2 Môi trường thạch để đếm đĩa (PCA) 5.2.1 Thành phần Pepton từ casein 5,0 g Cao nấm men 2,5 g Glucoza, dạng khan (C6H12O6) 1,0 g Thạch 1) Nước 1) g đến 18 g 000 ml Tùy thuộc vào sức đông thạch Khi kiểm tra sản phẩm sữa, cho 1,0 g bột sữa gầy vào lít mơi trường cấy Bột sữa gầy không chứa chất gây ức chế 5.2.2 Chuẩn bị 5.2.2.1 Chuẩn bị từ mơi trường hồn chỉnh khơ loại thương mại Theo dẫn nhà sản xuất thêm bột sữa gầy (xem 5.2.1), cần Chỉnh pH cho sau khử trùng 7,0 ± 0,2 25 °C, cần 5.2.2.2 Chuẩn bị từ thành phần khơ Hòa tan thành phần nước, theo thứ tự sau: cao nấm men, pepton từ casein, glucoza bột sữa gầy, cần Đun nóng nước để hồ tan nhanh Thêm thạch đun đến sôi, khuấy tan hết thạch Chỉnh pH cho sau khử trùng 7,0 ± 0,2 25 °C, cần 5.2.2.3 Phân phối, khử trùng bảo quản Phân phối môi trường vào ống nghiệm (6.8), với lượng từ 12 ml đến 15 ml vào ống bình chai (6.8) có dung tích khơng q 500 ml Khử trùng 15 phút nồi hấp áp lực 121°C Nếu môi trường sử dụng làm nguội nồi cách thủy (6.5) đến nhiệt độ từ 44 °C đến 47 oC trước sử dụng Nếu không dùng bảo quản nơi tối nhiệt độ oC oC không tháng điều kiện khơng làm thay đổi thành phần đặc tính Ngay trước kiểm tra vi sinh vật, để tránh chậm trễ rót mơi trường, nên làm tan chảy hồn tồn mơi trường để nguội nồi cách thủy (6.5) đến nhiệt độ từ 44 oC đến 47 °C trước sử dụng Để kiểm tra nhiệt độ thạch, nên đặt nhiệt kế vào dung dịch kiểm soát thạch 15 g /I đựng vật chứa riêng biệt giống hệt sử dụng cho mơi trường Nhiệt độ dung dịch kiểm sốt cần qua bước đun nóng làm nguội giống mơi trường 5.2.3 Kiểm tra tính môi trường cấy đảm bảo chất lượng Để kiểm tra tính mơi trường, xem ISO/TS 11133-1 5.3 Môi trường phủ (xem 9.2.7, cần) 5.3.1 Thành phần Thạch 1) Nước 1) 12 g đến 18 g 000 ml Tùy thuộc vào sức đông thạch 3.2 Chuẩn bị Cho thạch vào nước đun đến sôi, thường xuyên khuấy tan hết thạch, dùng nước khoảng 30 phút Chỉnh pH cho sau khử trùng 7,0 ± 0,2 25 °C, cần 5.3.3 Phân phối, khử trùng bảo quản Phân phối vào ống nghiệm (6.8) bình chai (6.8) có dung tích thích hợp, ống ml Khử trùng 15 phút nồi hấp áp lực 121°C Nếu môi trường sử dụng làm nguội nồi cách thủy (6.5) đến nhiệt độ từ 44 oC đến 47oC trước sử dụng Nếu khơng dùng ngay, bảo quản nơi tối nhiệt độ °C °C không tháng điều kiện không làm thay đổi thành phần đặc tính Ngay trước kiểm tra vi sinh vật, để tránh chậm trễ rót mơi trường, nên làm tan chảy hồn tồn mơi trường để nguội nồi cách thủy (6.5) đến nhiệt độ từ 44 °C đến 47 °C trước sử dụng Thiết bị dụng cụ thủy tinh Có thể dùng dụng cụ thủy tinh sử dụng lần thay cho dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần chúng có đặc tính thích hợp Sử dụng thiết bị phòng thử nghiệm vi sinh thông thường cụ thể là: 6.1 Thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực) Xem TCVN 6404 (ISO 7218) 6.2 Tủ ấm, có khả hoạt động 30 °C ± °C 6.3 Đĩa Petri, thủy tinh chất dẻo có đường kính từ 90 mm đến 100 mm 6.4 Pipet, có dung tích danh định ml 6.5 Nồi cách thủy, hoạt động 44 °C đến 47 °C 6.6 Thiết bị đếm khuẩn lạc, ví dụ: sử dụng chiếu sáng với phơng tối, gắn với kính lúp có độ phóng đại thích hợp khoảng 1,5 x đếm học điện tử số 6.7 pH mét, có độ xác ± 0,1 đơn vị pH 25 °C 6.8 Ống nghiệm, bình chai có dung tích thích hợp khơng lớn 500 ml Lấy mẫu Điều quan trọng phòng thử nghiệm nhận mẫu đại diện không bị hư hỏng biến đổi suốt trình vận chuyển bảo quản Việc lấy mẫu không qui định tiêu chuẩn Xem tiêu chuẩn riêng lấy mẫu cho sản phẩm tương ứng Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng bên liên quan tự thỏa thuận với vấn đề Chuẩn bị mẫu thử Việc chuẩn bị mẫu thử theo phần tương ứng TCVN 6507 (ISO 6887) TCVN 6263 (ISO 8261) tiêu chuẩn riêng tương ứng với sản phẩm Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng bên liên quan tự thoả thuận với vấn đề Cách tiến hành 9.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng Xem phần tương ứng TCVN 6507 (ISO 6887) tiêu chuẩn riêng liên quan đến sản phẩm 9.2 Cấy ủ 9.2.1 Lấy hai đĩa Petri vô trùng (6.3) Dùng pipet vô trùng (6.4) cho vào đĩa ml mẫu thử sản phẩm chất lỏng ml huyền phù ban đầu sản phẩm dạng khác (độ pha lỗng 10-1) 9.2.2 Lấy hai đĩa Petri vơ trùng (6.3) khác Dùng pipet vô trùng (6.4) cho vào đĩa ml dịch pha loãng 10-1 (nếu sản phẩm chất lỏng) ml dung dịch pha loãng 10 -2 (nếu sản phẩm dạng khác) 9.2.3 Lặp lại trình tự với dịch pha lỗng tiếp theo, sử dụng pipet vơ trùng dung dịch pha loãng thập phân, cần 9.2.4 Nếu thích hợp có thể, chọn bước pha lỗng tới hạn (ít hai dung dịch pha loãng thập phân liên tiếp) để cấy đĩa Petri cho thu số đếm từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc đĩa petri 9.2.5 Rót vào đĩa Petri khoảng từ 12 ml đến 15 ml môi trường thạch đếm đĩa (5.2) 44 °C đến 47 °C Thời gian từ chuẩn bị xong huyền phù ban đầu (hoặc dung dịch pha loãng 10 -1 sản phẩm chất lỏng) đến rót mơi trường (5.2) vào đĩa khơng vượt 45 phút 9.2.6 Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường cách xoay đĩa Petri hỗn hợp đông đặc lại cách đặt đĩa Petri bề mặt nằm ngang, mát 9.2.7 Sau đơng đặc hồn tồn nghi ngờ sản phẩm cần kiểm tra có chứa vi sinh vật mà khuẩn lạc chúng mọc lan khắp bề mặt mơi trường, rót khoảng ml môi trường phủ (5.3) 44 °C đến 47 °C lên bề mặt môi trường cấy mẫu Để cho đông đặc mô tả 9.2.8 Lật ngược đĩa cấy mẫu đặt vào tủ ấm (6.2) 30 °C °C 72 h h Không xếp chồng cao sáu đĩa Các chồng đĩa cần tách khỏi cách xa thành tủ 9.3 Đếm khuẩn lạc 9.3.1 Sau giai đoạn ủ qui định (9.2.8), đếm khuẩn lạc đĩa (10.1) sử dụng dụng cụ đếm khuẩn lạc (6.6), cần Kiểm tra đĩa ánh sáng dịu Điều quan trọng khuẩn lạc phải đếm tránh đếm nhầm với hạt khơng hòa tan chất kết tủa đĩa Kiểm tra cẩn thận khuẩn lạc nghi ngờ, cần nên dùng kính lúp có độ khuyếch đại lớn để phân biệt khuẩn lạc với tạp chất lạ 9.3.2 Các khuẩn lạc mọc lan rộng coi khuẩn lạc đơn lẻ Nếu hợp phần tư đĩa mọc dày lan rộng, đếm khuẩn lạc phần đĩa lại tính số tương ứng cho đĩa Nếu phần tư đĩa bị mọc dầy lan rộng loại bỏ đĩa không đếm 10 Biểu thị kết 10.1 Phương pháp tính Xem phần sửa đổi ISO 7218 : 1996 10.2 Độ chụm 10.2.1 Yêu cầu chung Các liệu độ chụm đánh giá đĩa chứa nhiều 15 khuẩn lạc 300 khuẩn lạc Dữ liệu độ chụm phụ thuộc vào liên kết hệ vi sinh vật chất mẫu Các liệu thu từ nghiên cứu cộng tác (xem [1], [2] [3]) có giá trị sữa nguyên liệu sữa trùng Chúng dùng làm số ước tính cần xác định số khuẩn lạc có sản phẩm khác 10.2.2 Độ lặp lại Chệnh lệch tuyệt đối kết hai phép thử độc lập đơn lẻ, thu sử dụng cùng, phương pháp, vật liệu thử giống hệt nhau, phòng thử nghiệm, người thực hiện, sử dụng thiết bị, thực khoảng thời gian ngắn, tính theo log 10 vi sinh vật có lít (tương ứng với 1,8 thang danh định số vi sinh vật lít) khơng lớn giới hạn lặp lại r = 0,25 CHÚ THÍCH: Giới hạn lặp lại thu từ nghiên cứu cộng tác sữa nguyên liệu sữa tiệt trùng (xem [1], [2] [3]) sử dụng cho sản phẩm 10.2.3 Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối kết hai phép thử đơn lẻ, thu sử dụng phương pháp vật liệu thử giống hệt phòng thử nghiệm khác nhau, người khác thực hiện, sử dụng thiết bị khác nhau, tính theo log 10 vi sinh vật có lít (tương ứng với 2,8 thang danh định số vi sinh vật lít) khơng lớn giới hạn tái lập R = 0,45 CHÚ THÍCH Giới hạn tái lập thu từ nghiên cứu cộng tác sữa nguyên liệu sữa tiệt trùng (xem [1], [2] [3]) sử dụng cho sản phẩm 10.3 Giải thích kết thử nghiệm Trong ví dụ xem xét đến số liệu độ chụm trung bình, mức xác suất 95 % phân tích mẫu Trong thực tế thường sử dụng trung bình vài mẫu Các số tính số vi sinh vật lít a) Các điều kiện lặp lại Kết thứ nhất: 105 = 100 000 Chênh lệch kết thứ kết thứ hai không lớn 0,25 log 10 đơn vị Kết thứ hai: log 104,75 = 56 000 log 105,25 = 178 000 Chênh lệch kết thứ thứ hai chấp nhận kết thứ hai không thấp 56 000 không cao 178 000 b) Các điều kiện tái lập Các kết thu phòng thử nghiệm thứ (trung bình phép xác định kép): 10 = 100 000 Chênh lệch kết thứ thứ hai thu phòng thử nghiệm thứ hai không lớn 0,45 log10 đơn vị: Các kết thứ hai: log 104,55 = 36 000 log 105,45 = 280 000 Chênh lệch kết thu phòng thử nghiệm thứ thứ hai chấp nhận phòng thử nghiệm thứ hai thu kết khơng thấp 36 000 không cao 280 000 Phụ lục A cho thấy cách tính cách sử dụng sai lệch tới hạn (CD) để giải thích kết 10.4 Giới hạn tin cậy Xem TCVN 6404 (ISO 7218) 11 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải rõ a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử nghiệm dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn điều coi tùy ý cố mà ảnh hưởng đến kết quả: e) kết thử nghiệm thu Phụ lục A (tham khảo) Cách sử dụng sai lệch tới hạn (CD) để giải thích kết Trong ví dụ xem xét đến liệu độ chụm trung bình, mức xác suất 95 % phân tích mẫu Trong thực tế thường sử dụng trung bình vài mẫu Các số tính số vi sinh vật lít a) Các điều kiện tái lập Các kết thu phòng thử nghiệm thứ (trung bình phép xác định kép): 10 = 100 000 Chênh lệch kết kết thu phòng thử nghiệm thứ hai (trung bình n phép xác định: ví dụ n = 2) chấp nhận khơng vượt q sai lệch tới hạn (CD), theo log10 đơn vị: r giới hạn lặp lại; R giới hạn tái lập Chênh lệch kết thu phòng thử nghiệm thứ thứ hai chấp nhận phòng thử nghiệm thứ hai thu kết không thấp 10 4,59 = 39 000 không cao 105,41 = 257 000 b) So sánh với giới hạn (thử phía) Giới hạn: 105 = 100 000 Chênh lệch giới hạn kết phòng thử nghiệm (trung bình n phép xác định, ví dụ n = 2) so sánh với giới hạn sai lệch tới hạn (CDL): Các kết thử nghiệm đến 105,24 = 174 000 không không phù hợp với giới hạn THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] PITON, C., GRAPPIN, R A Model for statistical evaluation of precision parameters of microbiological methods: Application to dry rehydratable film methods and IDG reference methods for enumeration of total aerobic mesophilic flora and coliforms in raw milk J AOAC, 74, 1991, pp 92-103 [2] SCOTTER, S., ALDRIDGE, M BACK, J., WOOD, R Validation of European Community methods for microbiological and chemical analysis of raw and heat-treated milk J Assoc Publ Analyst., 29, 1993, pp -32 [3] DAHMS S., WEISS H Estimation of precision values for microbiological reference methods: Standardized pour plate technique Milchwiss., 53, 1988, pp 555-559 ... tiêu chuẩn Xem tiêu chuẩn riêng lấy mẫu cho sản phẩm tương ứng Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng bên liên quan tự thỏa thuận với vấn đề Chuẩn bị mẫu thử Việc chuẩn bị mẫu thử theo phần tương ứng TCVN. .. Việc chuẩn bị mẫu thử theo phần tương ứng TCVN 6507 (ISO 6887) TCVN 6263 (ISO 8261) tiêu chuẩn riêng tương ứng với sản phẩm Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng bên liên quan tự thoả thuận với vấn đề Cách... chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn bị tạo môi trường cấy - Phần 1: Các hướng dẫn chung đảm bảo chất lượng cho việc chuẩn bị mơi trường cấy phòng thử nghiệm) Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng