Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8102:2009 - ISO 9231:2008. Tiêu chuẩn về Sữa và sản phẩm sữa - xác định hàm lượng axit benzoic và axit sorbic. Tiêu chuẩn do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn. Mời các bạn cùng tham khảo.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8102 : 2009 ISO 9231 : 2008 SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT BENZOIC VÀ AXIT SORBIC Milk and milk products - Determination of the benzoic and sorbic acid contents Lời nói đầu TCVN 8102 : 2009 hồn tồn tương đương với ISO 9231 : 2008; TCVN 8102 : 2009 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT BENZOIC VÀ AXIT SORBIC Milk and milk products - Determination of the benzoic and sorbic acid contents Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định hàm lượng axit benzoic và axit sorbic sữa sản phẩm sữa Phương pháp áp dụng cho sữa, sữa bột, sữa chua sản phẩm sữa lên men khác, phomat sản phẩm phomat chế biến, thích hợp để xác định hàm lượng hai hợp chất ở mức lớn mg/kg Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản nhất, bao gồm các sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm thuỷ tinh - Bình định mức Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn áp dụng thuật ngữ định nghĩa sau đây: 3.1 Hàm lượng axit benzoic axit sorbic (benzoic and sorbic acid contents) Phần khối lượng của axit benzoic axit sorbic xác định bằng quy trình quy định tiêu chuẩn CHÚ THÍCH Hàm lượng axit benzoic axit sorbic biểu thị bằng miligam kilogam sản phẩm Nguyên tắc Chất béo protein tách khỏi dung dịch kiềm nhẹ sản phẩm kết tủa Carrez Sau pha lỗng phần dung dịch lại với metanol, lọc phần chất lỏng phía Axit benzoic axit sorbic tách sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) với cột pha đảo C18, đo độ hấp thụ ở bước sóng 227 nm 250 nm Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích nước cất nước loại khoáng nước có độ tinh khiết tương đương, trừ có quy định khác 5.1 Metanol (CH3OH) 5.2 Thuốc thử tạo kết tủa, chuẩn bị sau: 5.2.1 Dung dịch kali hexaxyanoferat (II) Hoà tan 10,6 g kali hexaxyanoferat (II) ngậm ba phân tử nước (K 4[Fe(CN)6].3H2O) với nước bình định mức vạch dung tích 100 ml (6.3) Pha loãng nước đến vạch trộn CHÚ THÍCH 100 ml dung dịch đủ cho 40 lần chạy sắc ký 5.2.2 Dung dịch kẽm axetat Hòa tan 21,9 g kẽm axetat ngậm hai phân tử nước [(CH 3COO)2Zn.2H2O] 32 ml axit axetic (CH3COOH) với nước bình định mức vạch dung tích 100 ml (6.3) Pha loãng bằng nước đến vạch trộn Nếu kẽm axetat ngậm hai phân tử nước khơng hồ tan hoàn tồn, thì đun nóng bình định mức 100 ml với dung dịch chứa bình nồi cách thuỷ (6.2), trì nhiệt độ 70 oC xoay bình Khi kẽm axetat ngậm hai phân tử nước hồ tan hồn tồn, làm nguội dung dịch nhiệt độ phòng Pha lỗng nước đến vạch trộn CHÚ THÍCH 100 ml dung dịch đủ cho 40 lần chạy sắc ký 5.3 Dung dịch đệm phosphat, pH 6,7 Hoà tan 2,5 g kali dihydro phosphat (KH2PO4) 2,5 g kali hydro phosphat ngậm ba phân tử nước (K2HPO4.3H2O) I nước trộn Lọc dung dịch thu qua hệ thống lọc dung môi (6.8) 5.4 Pha động, dùng cho HPLC Trộn 10 thể tích metanol (5.1) với 90 thể tích dung dịch đệm phosphat (5.3) Tách khí hồ tan dung dịch cách sử dụng chân không nhẹ 5.5 Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 0,1 mol/l Hoà tan 4,0 g natri hydroxit dạng hạt nước bình định mức vạch dung tích 000 ml (6.3) Pha loãng nước đến vạch trộn 5.6 Axit sulfuric, c(H2SO4) = 0,5 mol/l Rót cẩn thận 15 ml axit sulfuric đậm đặc, nồng độ nhất 95 % đến 98 % khối lượng vào 250 ml nước bình định mức vạch dung tích 500 ml (6.3) làm nguội Pha loãng nước đến vạch trộn 5.7 Dung dịch axit sorbic axit benzoic chuẩn, chuẩn bị sau: 5.7.1 Dung dịch chuẩn gốc Hoà tan 50 mg axit sorbic 50 mg axit benzoic bằng metanol (5.1) bình định mức vạch dung tích 100 ml (6.3) Pha loãng metanol (5.1) đến vạch và trộn Dung dịch ch̉n gốc bền ba tuần bảo quản tủ lạnh ở nhiệt độ oC đến oC 5.7.2 Dung dịch chuẩn làm việc Trộn 500 ml metanol (5.1) với 500 ml nước để thu dung dịch nước-metanol 50 % thể tích Trong ngày sử dụng, dùng pipet lấy ml dung dịch chuẩn gốc (5.7.1) cho vào bình định mức vạch dung tích 250 ml (6.3) Pha lỗng dung dịch nước-metanol 50 % tới vạch trộn Dung dịch chuẩn làm việc thu chứa 10 g/ml tổng hàm lượng axit sorbic axit benzoic Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường cụ thể sau: 6.1 Cân phân tích, có thể cân xác đến mg, có khả đọc đến 0,1 mg 6.2 Nồi cách thuỷ, có thể trì nhiệt độ 70 oC ± oC 6.3 Bình định mức vạch, dung tích 100 ml, 250 ml, 500 ml 000 ml, phù hợp với cấp A TCVN 7153 (ISO 1042) 6.4 Sắc kí lỏng, gắn với bơm tạo áp suất lên đến 4,37 MPa (6 000 psi), bơm mẫu, detector UV bước sóng kép lưỡng cực, máy ghi tích phân Detector bước sóng kép có cuvet cm đo độ hấp thụ ở bước sóng 227 nm (đối với axit benzoic) 250 nm (đối với axit sorbic) 6.5 Cột HPLC, làm bằng thép không gỉ, dài 250 mm, đường kính mm, chứa pha đảo, octađexyl (ODC) xử lí với chất hấp thụ silic, ví dụ Micro-Bondapak C 181) loại tương tự 6.6 Xyranh dùng cho HPLC 6.7 Bộ lọc máu, có màng Iọc với cỡ lỗ 0,45 μm sử dụng với dung dịch nước 6.8 Hệ thống lọc dung mơi, có màng lọc với cỡ lỗ 0,45 μm sử dụng với dung dịch nước 6.9 Thiết bị siêu âm 6.10 Máy đo pH Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện không bị hư hỏng không bị biến đổi chất lượng trình vận chuyển bảo quản Việc lấy mẫu không qui định tiêu chuẩn Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) Mẫu thử bảo quản cho tránh hư hỏng biến đổi thành phần Chuẩn bị mẫu thử 8.1 Sữa chua sản phẩm sữa lên men khác Trước bắt đầu tiến hành thử, đồng hoá mẫu bằng cách làm ấm từ từ tới 40 oC khuấy Cân, 20 g mẫu thử đồng hố, xác đến 0,1 g, vào bình định mức vạch (6.3) 8.2 Các sản phẩm sữa khác Cân g mẫu, chính xác đến 0,1 g, vào cốc thuỷ tinh có mỏ dung tích 20 ml Hoà tan hoàn toàn mẫu thử 10 ml nước, thêm lượng nhỏ khuấy đũa thuỷ tinh Chuyển hết dung dịch vào bình định mức vạch dung tích 100 ml (6.3), tráng cốc có mỏ hai lần lần dùng ml nước Cách tiến hành 9.1 Kết tủa chất béo, protein làm Thêm 25 ml dung dịch natri hydroxit (5.5) vào mẫu thử (xem 8.1 8.2) trộn Có thể đặt bình với dung dịch vào thiết bị siêu âm (6.9) 15 đặt nồi cách thuỷ (6.2) trì ở nhiệt độ 70 oC và gia nhiệt 15 min, sau để dung dịch nguội tới nhiệt độ phòng Chỉnh pH đến ± bằng cách thêm dung dịch axit sulfuric (5.6) trộn Sau thêm ml dung dịch kali hexaxyanoferat (II) (5.2.1) ml dung dịch kẽm axetat (5.2.2) để làm kết tủa chất béo protein Lắc mạnh để yên huyền phù thu 15 Sau thêm khoảng 40 ml metanol (5.1) trộn Để nguội đến nhiệt độ phòng Pha loãng metanol (5.1) đến vạch tiếp tục trộn Giữ yên hỗn hợp thêm 15 Lọc phần chất lỏng nổi lên bằng lọc mẫu (6.7) 9.2 Sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) Tiến hành phân tích HPLC ở nhiệt độ phòng, dùng pha động (5.4) với tốc độ dòng khoảng 1,2 ml/min Để cho hệ thống cân 30 trước bơm dung dịch Sau bơm μl đến 20 μl dung dịch lọc trong 9.1 và thể tích tương đương dung dịch chuẩn làm việc (5.7.2) Kiểm tra dòng chảy cột detector UV ở bước sóng 227 nm 250 nm, dùng detector liên tiếp ở hai bước sóng cài đặt dùng đồng thời bước sóng kép CHÚ THÍCH Đường chuẩn phải tuyến tính, chỉ cần điểm hiệu chuẩn là đủ Lượng metanol dung dịch chuẩn dung dịch mẫu thử cao nhiều pha động, điều ảnh hưởng đến hình dạng pic phân tách pic số trường hợp Khi cần kiểm tra hình dạng pic phân tách pic cách so sánh với pic thu bơm dung dịch chuẩn làm việc (5.7.1) metanol (5.1) thay bằng pha động (5.4) với thể tích tương đương Micro-Bondapak C18® tên sản phầm có bán sẵn Thơng tin này đưa tạo thuận tiện cho người sử dụng, ISO không ấn định phải sử dụng chúng 1) Thời gian lưu axit benzoic axit sorbic điều kiện nêu tương ứng khoảng 5,5 Nếu pic tạo thành bị ảnh hưởng bởi chất gây nhiễu khác, chuẩn bị độ pha lỗng thích hợp nước-metanol 50 % bơm μl đến 20 μl dung dịch pha loãng để thu chiều cao pic thích hợp Để phát xem có hợp chất gây nhiễu bị phân giải với axit sorbic hay không, cần kiểm tra tỉ lệ tín hiệu UV ở bước sóng 250 nm 227 nm Khi phân tích sữa sữa bột, quan sát pic thứ ba sau rửa giải Pic tạo thành bởi axit hippuric, thành phần tự nhiên của sữa Pic axit hippuric chờng mợt phần lên pic axit sorbic Độ phân giải cột axit sorbic axit hippuric tốt nhất > 10 Tính tốn biểu thị kết 10.1 Tính tốn Tính hàm lượng axit sorbic, ws, và/hoặc hàm lượng axit benzoic, wb, miligam kilogam, theo công thức sau: Hts chiều cao diện tích của pic thu từ dung dịch mẫu thử (xem 9.2), tính theo đơn vị thích hợp; Hst chiều cao diện tích pic thu từ dung dịch chuẩn làm việc (xem 9.2), tính theo đơn vị; ms khối lượng chuẩn làm việc (5.7.2) bơm, tính microgam (μg); m là khối lượng mẫu thử (xem 8.1 8.2), tính gam (g); V1 thể tích dịch chiết chuẩn bị 9.1 (= 100 ml), tính mililit (ml); V2 là thể tích dung dịch mẫu thử (xem 9.2) bơm, tính microlit (μl) 10.2 Biểu thị kết Biểu thị kết đến số nguyên gần 11 Độ chụm 11.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm Các giá trị nhận từ phép thử liên phòng thử nghiệm không áp dụng cho dải nồng độ chất khác với dải nồng độ chất nêu Các giá trị độ lặp lại độ tái lập thu từ kết của hai phép thử liên phòng thử nghiệm tiến hành năm 1984 2004 (xem Phụ lục A) Các phép thử tiến hành mẫu có hàm lượng axit benzoic và axit sorbic dao động từ mg/kg đến 920 mg/kg 11.2 Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối hai kết quả thử riêng rẽ, thu sử dụng phương pháp, loại vật liệu thử, cùng phòng thử nghiệm, cùng người thao tác sử dụng thiết bị khoảng thời gian ngắn nhau, không % trường hợp lớn 2,235 + 0,031x ϖs,(hoặc ϖb ) mg/kg 11.3 Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử độc lập, riêng rẽ, thu sử dụng phương pháp, loại vật liệu thử, phòng thử nghiệm khác nhau, người thao tác khác thực và sử dụng thiết bị khác nhau, không % trường hợp lớn 8,987 + 0,130 x ϖs,(hoặc ϖb ) mg/kg 12 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) thông tin cần thiết việc nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn này, với chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả; e) kết thử nghiệm thu được, kiểm tra độ lặp lại nêu kết cuối cùng thu Phụ lục A (Tham khảo) Các phép thử liên phòng thử nghiệm Các giá trị độ lặp lại độ tái lập thu từ kết hai phép thử liên phòng thử nghiệm quốc tế tiến hành vào năm 1984 [4] 2004 [6] Các kết thu hai phép thử liên phòng thử nghiệm phân tích thống kê theo TCVN 4550 : 1988 (ISO 5725 : 1981) TCVN 6910-2 : 2001 (ISO 5725-2 : 1994) cho số liệu độ chụm Bảng A.1 Bảng A.1 - Kết quả thử nghiệm liên phòng thử nghiệm Thơng số Axit benzoic Axit sorbic 1984 [4] 1984 [4] 2004 [6] 2004 [6] 1984 [4] 2004 [6] 2004 [6] Mẫu Aa Ba Cb Db B+ c Cb Db Số phòng thử nghiệm tham gia 14 14 14 14 14 14 Số phòng thử nghiệm ngoại lệ 2 1 Số phòng thử nghiệm lại sau trừ ngoại lệ 12 12 13 11 13 14 Giá trị trung bình, mg/kg 26,4 40,6 7,61 35,0 36,1 920 57,0 Độ lặp lại, r, mg/kg 2,0 3,8 1,6 4,4 3,4 30,5 4,5 Độ lặp lại theo giá trị trung bình, rrel, % 7,7 9,4 20,5 12,7 9,4 3,3 7,8 Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, % 0,7 1,3 0,6 1,6 1,2 10,8 1,6 RSDr, % 2,7 3,3 7,2 4,5 3,3 1,2 2,8 Độ tái lập, R, mg/kg 13,5 15,3 11,0 9,9 12,1 128,9 18,6 Độ tái lập theo giá trị trung bình, Rrel, % 51,1 37,7 144 28,4 33,5 14,0 32,6 Độ lệch chuẩn tái lập, SR, mg/kg 4,8 5,4 3,9 3,5 4,3 45,6 6,6 RSDR, % 18,1 13,3 50,9 10,0 11,9 5,0 11,5 a Mẫu A và mẫu B: Sữa chua có hương liệu b Mẫu C mẫu D: Phomat chế biến (xem thông tin bổ sung Tài liệu tham khảo [6]) c Spiked với 40 mg/kg axit sorbic quá trình chuẩn bị Sử dụng phân tích hồi quy tuyến tính với phương trình hồi quy x = b + ay, thu hệ số tương quan 0,9973486, với n = 7, s = 0,8249 t0,95 = 2,57 (xem Hình A.1): axit sorbic, r = 2,2354088 + 0,0307787 ϖs, axit benzoic, r = 2,2354088 + 0,0307787 ϖb Sử dụng phân tích hồi quy tuyến tính với phương trình hồi quy x = b + ay, thu hệ số tương quan 0,9989653, với n = 7, s = 2,1815 t0,95= 2,57 độ tái lập (xem Hình A.2): axit sorbic, R = 8,9874965 + 0,1304663 ϖs, axit benzoic, R = 8,9874965 + 0,1304663 ϖb CHÚ DẪN X giá trị trung bình (mg/kg) Y độ lặp lại, r ( mg/kg) Hình A.1 - Độ lặp lại theo hàm số giá trị trung bình X CHÚ DẪN X giá trị trung bình (mg/kg) Y độ tái lập, R (mg/kg) Hình A.2 - Độ tái lập theo hàm số giá trị trung bình THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu [2] TCVN 4550 : 1988 (ISO 5725 : 1981), Thống kê ứng dụng - Độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp thử (đã huỷ) [3] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp bản xác định độ lặp lại độ tái lập phương pháp đo tiêu chuẩn [4] Stijve, T., and Hischenhuber, C: High performance liquid chromatographic determination of low levels of benzoic acid and sorbic acid in yoghurts, Deutsche Lebensmittel-Rundschau, 80 (1984), pp 81-84 [5] BITIKOFER, H., Baumann, E., and Bosset, F.O.: Mitt Gebiete Lebensm Hyg., 79 (1988), pp 392405 [6] Carl, M., and BlTIKOFER, U.: Bulletin of the International Dairy Federation, publication in preparation ... TCVN 6400 (ISO 707), Sữa sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu [2] TCVN 4550 : 1988 (ISO 5725 : 1981), Thống kê ứng dụng - Độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp thử (đã huỷ) [3] TCVN 691 0-2 ... nghiệm quốc tế tiến hành vào năm 1984 [4] 2004 [6] Các kết thu hai phép thử liên phòng thử nghiệm phân tích thống kê theo TCVN 4550 : 1988 (ISO 5725 : 1981) TCVN 691 0-2 : 2001 (ISO 572 5-2 : 1994)... huỷ) [3] TCVN 691 0-2 (ISO 572 5-2 ), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp bản xác định độ lặp lại độ tái lập phương pháp đo tiêu chuẩn [4] Stijve, T., and