Hoạt hóa và di chuyển của tế bào gốc tủy răng người: Vai trò trong lành tổn thương tủy răng

Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm chứng tỏ sự hoạt hóa và di chuyển của dòng tế bào gốc/chưa biệt hóa sử dụng mô hình nuôi cấy răng người. Bên cạnh đó, nhằm đánh giá vai trò của nguyên bào sợi tủy răng khi bị tổn thương trong tân tạo mạch máu, một quá trình diễn ra sớm trong lành thương của tủy răng và có thể cần thiết cho sự di chuyển của tế bào chưa biệt hóa.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học HOẠT HÓA VÀ DI CHUYỂN CỦA TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG NGƯỜI: VAI TRÒ TRONG LÀNH TỔN THƯƠNG TỦY RĂNG Trần Hùng Lâm*, Odile Téclès**, Mathieu Sylvie**, About Imad** TĨM TẮT Nhiều nghiên cứu chứng minh có diện tế bào gốc/chưa biệt hóa tủy Tuy nhiên nghiên cứu vị trí tế bào tủy hoạt hóa di chuyển chúng để đáp ứng với tổn thương tủy Mục tiêu nghiên cứu nhằm chứng tỏ hoạt hóa di chuyển dòng tế bào gốc/chưa biệt hóa sử dụng mơ hình ni cấy người Bên cạnh đó, chúng tơi đánh giá vai trò nguyên bào sợi tủy bị tổn thương tân tạo mạch máu, trình diễn sớm lành thương tủy cần thiết cho di chuyển tế bào chưa biệt hóa Kết quả: Qua mơ hình ni cấy in vitro, nghiên cứu cho thấy tổn thương tủy kích thích tăng sinh di chuyển tế bào gốc/chưa biệt hóa vùng xung quanh mạch máu đến vùng tổn thương tủy Khi bị tổn thương, nguyên bào sợi tủy tiết yếu tố tăng trưởng mạch máu giúp tủy lành thương hoàn toàn Kết luận: Tân tạo mạch máu cần thiết cho tế bào gốc/chưa biệt hóa di chuyển đến vùng có sang thương Từ khóa: tế bào gốc/chưa biệt hóa, tủy răng, tổn thuơng tủy, tân tạo mạch máu ABSTRACT ACTIVATION AND MIGRATION OF HUMAN DENTAL PULP STEM CELLS: ROLE IN DENTAL PULP HEALING Tran Hung Lam, Odile Téclès, Mathieu Sylvie, About Imad * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 63 - 68 Several lines of evidence strongly suggest the presence of resting progenitor/stem cells in the dental pulp However, little is known about activation and migration of these cells in response to pulp injury The objective of this work was to investigate the activation and migration of these progenitor/stem cells in response to pulp injury in their tissue of origin Besides, we also evaluated the role of pulp fibroblasts in angiogenesis, an early step of pulp healing and may be necessary for migration of progenitor cells Results: Using a tooth culture model, our study demonstrated that pulp injury stimulated the proliferation and migration of perivascular progenitor/stem cells to injury site After pulp amputation, pulp fibroblasts secreted angiogenic factors helping a complete pulp healing Conclusion: Angiogenesis may be necessary for migration of progenitor/stem cells Key words: progenitor/stem cells, dental pulp, pulp injury, angiogenesis thương bệnh lý hay điều trị, ngà phản ứng MỞ ĐẦU ngà sửa chữa thành lập tùy Trong nha khoa phục hồi, có tổn *: Khoa Răng Hàm Mặt, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh **: Laboratoire IMEB, Khoa Nha, Đại học Méditerranée, Cộng hòa Pháp Tác giả liên lạc: TS Trần Hùng Lâm ĐT 0907773375, Email: drtranhunglam@gmail.com Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 63 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 thuộc vào thể tích tủy (Smith cs, 1995; Tziafas cs, 2000)(4,7) Sự hình thành giúp giới hạn thương tổn gây bên Những nguyên bào ngà sống sót sang thương sâu nhẹ, chúng tiết lớp ngà phản ứng Trái lại, sang thương lớn lớp nguyên bào ngà bị phá hủy, chúng thay dòng tế bào nguồn gốc tủy răng: nguyên bào ngà hệ thứ chế tiết lớp ngà sửa chữa Nhiều nghiên cứu chứng minh nguyên bào ngà hệ thứ biệt hóa từ dòng tế bào gốc/chưa biệt hóa diện tủy (About cs, 2000; Gronthos cs, 2000)(1,2) Tuy nhiên nghiên cứu vị trí tế bào gốc tủy hoạt hóa di chuyển chúng để đáp ứng với tổn thương tủy(3) Mục tiêu nghiên cứu nhằm chứng tỏ hoạt hóa di chuyển dòng tế bào gốc/chưa biệt hóa sử dụng mơ hình ni cấy người Bên cạnh đó, chúng tơi đánh giá vai trò nguyên bào sợi tủy bị tổn thương tân tạo mạch máu, trình diễn sớm lành thương tủy cần thiết cho di chuyển tế bào chưa biệt hóa PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu thực la bô IMEB, Khoa Nha, Đại học Méditerranée, Cộng hòa Pháp từ tháng 09-2004 đến 09-2006 Răng cối thu nhận từ bệnh nhân có điều trị chỉnh nha (có đồng ý bệnh nhân hay cha mẹ bệnh nhân 18 tuổi phù hợp với luật pháp Cộng hòa Pháp) sử dụng để nghiên cứu hoạt hóa di chuyển tế bào gốc chưa biệt hóa sau tạo sang thương vào tủy Răng nhổ đem trực tiếp đến la bô nghiên cứu môi trường MEM (minimum essential medium) có thêm 300UI/ml penicillin, 300 g/ml streptomycin, 0.75 g/ml amphotericin B Răng rửa với dụng cụ vô trùng sau loại bỏ dây chằng nha chu bao mầm Sang thương tủy sửa soạn với mũi khoan kim cương 64 (đường kính 016) tay khoan siêu tốc (300 000 vòng/phút) nước bơm rửa vơ trùng lạnh Răng khơng có tạo xoang tạo xoang vào ngà (khơng có tổn thương tủy) sử dụng làm nhóm chứng cho nghiên cứu tăng sinh tế bào Răng nuôi cấy hộp nuôi cấy lỗ (Nonclon, Nunc, Roskilde, Đan Mạch) Phần thân cố định sợi kẽm, phần chóp ngập dung dịch ni cấy khơng chạm đáy hộp nuôi cấy Môi trường nuôi cấy MEM có thêm 10% huyết phơi bò, 200UI/ml penicillin, 200 g/ml streptomycin, 0.5 g/ml amphotericin B Để khảo sát tăng sinh tế bào, nuôi môi trường MEM có chứa BrdU (1mg/ml) ngày Sau đó, để kiểm tra di chuyển tế bào, ni cấy mơi trường có BrdU ngày, sau đó, tiếp tục ni mơi trường khơng có BrdU ngày, tuần tuần Khảo sát mơ học hóa mơ miễn dịch Sau giai đoạn nuôi cấy, cố định dung dịch formol 4% khử khoáng dung dịch gồm sodium formiate 3,4% acid formic 17% đến khử khống hồn tồn cho xử lý mơ học Các xử lý qua cồn xylene cuối nhúng sáp paraffin Hóa mơ miễn dịch thực lớp cắt bề dày 7m với kháng thể đơn dòng anti-BrdU Nhuộm máu với kit streptavidine-biotin (LSAB, Dako Corp, CA) theo hướng dẫn nhà sản xuất Mẫu chứng khơng có kháng thể ngun phát âm tính Phương pháp đánh giá vai trò nguyên bào sợi tân tạo mạch máu Nguyên bào sợi tủy lấy từ cối lớn thứ ba mô tả trước (About cs., 2000)(1) Sau nhổ, rửa loại bỏ phần chóp Tủy cắt thành mảnh nhỏ ni đĩa ni cấy có đường kính 100mm (Becton Dickison Labware, NJ, USA) Khi hộp đầy tế bào, thực chọn lọc tế bào với men Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Trypsine/EDTA Tế bào nuôi cấy môi trường có trộn thêm huyết phơi bò nồng độ 10%, 2mM glutamine, 100UI/ml penicillin/streptomycine 0,25 μg/ml amphotericin B Tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người nuôi môi trường chuyên biệt cung cấp nhà sản xuất Tủ ni cấy tế bào có nồng độ CO2 5% Môi trường nuôi cấy thay ngày Nguyên bào sợi nuôi môi trường EGM Các tổn thương nguyên bào sợi thực trực tiếp với dao mổ vô trùng đĩa nuôi cấy Sau tiếp xúc với nguyên bào sợi bị tổn thương, môi trường sử dụng để nuôi tế bào nội mô khung ngoại bào Matrigel Môi trường ni cấy khơng có tiếp xúc với ngun bào sợi sử dụng làm nhóm chứng Sau 24 giờ, thành lập cấu trúc dạng ống tế bào nội mô đánh giá định lượng cách đo chu vi cấu trúc dạng ống thành lập ảnh chụp từ kính hiển vi Mỗi nhóm chọn 30 quang trường cách ngẫu nhiên để thực đo đạc Chu vi cấu trúc dạng ống phân tích với phần mềm Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD, USA) Thí nghiệm trung hòa yếu tố tăng trưởng mạch máu Hai kháng thể trung hòa có nồng độ 20μg/ml (R&D Systems, Lille, France) sử dụng anti-VEGF anti-FGF-2 Kháng thể trung hòa thêm vào mơi trường ni cấy có tiếp xúc với ngun bào sợi tổn thương Mơi trường sau sử dụng để nuôi tế bào nội mô đánh giá chu vi cấu trúc dạng ống tế bào nội mô mô tả Nghiên cứu Y học KẾT QUẢ Sự tăng sinh tế bào gốc/chưa biệt hóa Sau tạo sang thương vào tủy nuôi cấy với BrdU ngày, nhuộm màu tập trung nhân tế bào vùng quanh mao mạch Hóa mơ miễn dịch sử dụng kháng thể anti-BrdU biểu thang độ: nhuộm màu BrdU đậm mạch máu bao quanh tổn thương giảm xa khỏi tổn thương (hình 1) Hình 1: Tế bào gốc tăng sinh biểu thang độ sau tạo sang thương vào tủy Sau ngày nuôi cấy với BrdU, nhuộm màu tập trung nhân tế bào vùng quanh mao mạch Nhuộm màu đậm mao mạch quanh sang thương (B C) giảm xa sang thương (B D) Chú thích: c: xoang sang thương; d: ngà; p: tủy, mũi tên mạch máu Thanh thước đo hình A: 1mm; hình B: 100 m; hình C D: 50m Sự di chuyển tế bào gốc/chưa biệt hóa Phân tích thống kê Sau ni cấy hai tuần, nhuộm màu tế bào tách biệt khỏi mạch máu gần vùng tổn thương Tại thời điểm tuần, nhuộm màu miễn dịch thấy vùng tổn thương (hình 2) Tất thí nghiệm lặp lại lần Test phi tuyến tính Mann-Whitney sử dụng để kiểm định giả thuyết, khác biệt có ý nghĩa thống kê giá trị p