Mục tiêu của nghiên cứu này là tạo gel fibrin có tế bào và đánh giá sự tồn tại, di cư của tế bào trong cấu trúc này sau khi ghép trên mảnh ngà răng đã xử lý.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học KHẢ NĂNG TỒN TẠI VÀ DI CƯ CỦA TẾ BÀO TRONG GEL FIBRIN SAU KHI GHÉP TRÊN MẢNH NGÀ RĂNG ĐÃ XỬ LÝ Nguyễn Thị Ngọc Hạnh*, Đoàn Nguyên Vũ**, Trần Xuân Vĩnh***, Trần Lê Bảo Hà** TÓM TẮT Mở đầu: Gel fibrin vật liệu khung nâng đỡ phù hợp cho tái tạo mô tủy Tuy nhiên kĩ nghệ mô nha khoa nay, ứng dụng gel fibrin hạn chế Mục tiêu: Mục tiêu nghiên cứu tạo gel fibrin có tế bào đánh giá tồn tại, di cư tế bào cấu trúc sau ghép mảnh ngà xử lý Đối tượng Phương pháp nghiên cứu: Các mảnh ngà người tạo có kích thước khoảng – mm, đường kính rãnh 1mm Tế bào gốc tủy đưa lên khung nâng đỡ gel fibrin Gel fibrin có tế bào gốc tủy mô tủy nguyên cấy lên mảnh ngà xử lý Cố định thành phần mảnh ngà nuôi cấy in vitro tuần Sự tồn tạo di cư tế bào gel fibrin đánh giá kỹ thuật mô học phản ứng PCR Kết quả: Kết cho thấy có tồn tế bào cấu trúc sau tuần ghép mảnh ngà xử lý có di cư tế bào mô tủy nguyên sang gel fibrin Từ khóa: Gel fibrin, bệnh lý tủy, tồn tại, di cư ABSTRACT THE SURVIVAL AND MIGRATION OF CELLS IN THE GEL FIBRIN-FORMING CELLS AFTER SEEDED HUMAN TREATED DENTIN MATRIX Nguyen Thi Ngoc Hanh, Doan Nguyen Vu, Tran Xuan Vinh, Tran Le Bao Ha * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: - Background: The fibrin gel has many useful characteristics for the pulp tissue regeneration but its application in dental engineering is still limited Objective: The aims of this study are to conduct a cell containing fibrin gel and to evaluate the survival and migration of cells in this structure after seeded on human treated dentin matrix Material and Methods: Firstly, the dentin slices from – mm in length and mm diameter of drain were cut from human tooth Dental pulp stem cells were seeded on fibrin gel Secondly fibrin gel/cell structure and living pulp are seeded to the dentin slices These slices then were fixed and cultured in vitro for weeks The survival and migration of cells in gel fibrin was evaluated by HE staining and PCR Results: The results showed that the cells presented in fibrin gel/cell structure after two weeks Some cells of living pulp tended to move into fibrin gel and proliferated together with dental pulp stem cells Keywords: fibrin gel, survival, migration * Trường Cao đẳng Y tế Kiên Giang ** Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia-thành phố Hồ Chí Minh ***Bộ mơn Nha khoa sở, Khoa RHM, Đại học Y Dược, TpHCM Tác giả liên lạc: PGS.TS Trần Lê Bảo Hà ĐT: 0988575507 Email: tlbha@hcmus.edu.vn Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh lý tủy bệnh phổ biến lĩnh vực nha khoa, nội nha phương pháp điều trị áp dụng nhiều Răng sau nội nha khả nhận cảm với thay đổi môi trường khả sửa chữa với tổn thương sau Chính vậy, nhu cầu đòi hỏi liệu pháp khác nhằm phục hồi tốt cho cần thiết Trên giới, tế bào gốc tủy người phân lập lần vào năm 2000, với phát triển kĩ nghệ mơ nhà nghiên cứu bắt đầu hi vọng tái tạo lại mô ngà tủy tự nhiên thay cho phương pháp điều trị nội nha tại, mở cách mạng cho tái tạo ngà tủy, hay nói cách khác có hy vọng sống lại(3) Ngà người có phân tử tín hiệu nhiều protein chứng minh quan trọng phát triển, khống hóa tái tạo ngà Khi phóng thích, yếu tố đóng vai trò quan trọng thành lập ngà sửa chữa, đáp ứng phức hợp ngà tủy Những nghiên cứu trước chứng minh ngà người xử lý (hTDM) có tính tương hợp sinh học hoạt tính sinh học thích hợp để làm khung nâng đỡ lý tưởng tái tạo răng(5) Khung nâng đỡ fibrin sử dụng nghiên cứu tái tạo mô sụn, tim mạch thần kinh Các đặc tính sinh học gel fibrin phù hợp làm khung nâng đỡ như: tương hợp sinh học, đáp ứng miễn dịch thấp, phân hủy sinh học, dễ dàng thu nhận xử lý, tạo nhiều hình dạng với nhiều kích thước khác Gel fibrin thu nhận từ máu bệnh nhân nên khung nâng đỡ tự thân, không độc, không gây viêm Gel fibrin mềm mại nên đưa vào buồng tủy dễ dàng(2,4,9) Với tính này, gel fibrin vật liệu khung nâng đỡ phù hợp cho tái tạo mô tủy Tuy nhiên kĩ nghệ mô nha khoa nay, ứng dụng gel fibrin hạn chế Vì vậy, thực nghiên cứu với mục tiêu tạo cấu trúc gel fibrin có tế bào đánh giá tồn tại, di cư tế bào cấu trúc ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng Gel fibrin từ huyết tương người; Tế bào gốc tủy người Tạo mơ hình nghiên cứu Xử lý tạo mảnh ngà răng: Các mảnh ngà tạo có chiều dài từ 5-6 mm, đường kính rãnh 1mm khuấy PBS (Phosphat Buffered Saline (Gibco)) 1X 10 phút, EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid - Sigma) 17% 10 phút, axit citric 19% phút Sau đó, mảnh ngà lắc PBS 1X 5-7 ngày, tốc độ lắc 120 vòng/phút Cuối cùng, mảnh ngà xử lý thu nhận, làm khơ, đóng gói chiếu xạ Trung Tâm Nghiên Cứu Triển Khai Công Nghệ Bức Xạ, Thành phố Hồ Chí Minh với liều chiếu xạ 25 kGy(7, 8) Tạo cấu trúc gel fibrin/tế bào Gel fibrin có chứa tế bào bên tạo cách cho 250 µl huyết tương vào giếng, thêm 250 µl dung dịch CaCl2 40mM vào thêm 104 tế bào gốc tuỷ răng, huyền phù để tế bào phân bố gel Sau 24 giờ, thu nhận cấu trúc gel fibrin/tế bào ghép lên mảnh ngà Thu nhận mô tủy nguyên từ người nam Răng tạo rãnh dọc theo thân chân với độ sâu vừa phải, không lộ tủy máy cắt Mô tủy nguyên thu nhận tủ vô trùng theo bước sau: khử trùng povidine 10 phút, rửa lại với PBS 1X (2 lần), đặt lên gạc vô trùng, dùng kéo cắt làm đôi theo rãnh tạo trước đó, thu nhận phần tủy buồng, cắt bỏ phần tủy chân gần chóp để tránh nguy nhiễm khuẩn, cho vào đĩa petri có sẵn PBS 1X, dùng lưỡi dao phẫu thuật cắt mô tủy nguyên thành phần Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Ghép cấu trúc gel fibrin/tế bào lên mảnh ngà Chúng thực nghiệm thức nghiên cứu, nghiệm thức lặp lại lần: Nghiệm thức (NT 1): Mảnh ngà + gel fibrin/tế bào + mô tủy nguyên Nghiệm thức (NT 2): Mảnh ngà + gel fibrin/tế bào Nghiệm thức (NT 3): Mảnh ngà + gel fibrin Cố định gel fibrin mô tủy nguyên lên mảnh ngà Tùy theo thành phần nghiệm thức, tiến hành đặt gel fibrin, gel fibrin/ tế bào mô tủy nguyên lên rãnh mảnh ngà Cố định thành phần ghép cách đặt lưới thép khơng gỉ kích thước 1x1cm, vào giếng đĩa giếng, lên mảnh ngà răng, cho vừa chặt tay Nghiên cứu Y học Đánh giá tồn tế bào Mơ hình sau lấy cố định dung dịch formalin 10% đệm phosphate Sau đó, mẫu khử khống, cắt lát nhuộm H&E Đánh giá di cư tế bào Phần gel fibrin sau tách từ nghiệm thức sau tuần nghiên cứu bảo quản mơi trường ni cấy Sau đó, thực phản ứng PCR xác định biểu gen SRY Tế bào gốc tủy người thu nhận từ người nữ, mô tủy nguyên thu nhận từ người nam Gen SRY gen đại diện cho giới tính nam Phản ứng PCR nhằm xác định có hay khơng diện tế bào người nam vùng tế bào nữ cấu trúc gel fibrin/tế bào, thông qua có mặt gen SRY KẾT QUẢ Tạo cấu trúc gel fibrin/tế bào Kính hiển vi soi ngược sử dụng để quan sát tế bào gel B A C Hình Tế bào gel (40X) A: Tế bào sau đưa lên gel fibrin, B: Tế bào sau 24 đưa lên gel fibrin, C: Bề mặt đĩa sau lấy gel fibrin Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học Gel fibrin/ tế bào Gel fibrin/ tế bào B A Ngà Gel fibrin/ tế bào Ngà Gel fibrin/ tế bào C D Hình Tế bào bên gel fibrin sau tuần: (A) NT 1; (C) NT sau tuần: (B) NT 1; (D) NT 2 F M L Hình Kết PCR gen SRY mẫu gel sau tuần, L: thang đánh giá; M: mô tủy nguyên người nam, F: mô tủy nguyên người nữ, 1: mẫu gel NT 1, 2: mẫu gel NT kính hiển vi khơng thấy tế bào (Hình Khi cố định lên gel, tế bào có dạng A, B, C) tròn Sau 24 giờ, tế bào có dạng trải dài Sau lấy gel fibrin khỏi giếng, bề mặt giếng Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Kết nhuộm H&E Ở NT NT 2, mật độ tế bào bên gel tuần tuần tương đương nhau, khó nhận thay đổi (Hình A, B, C, D) Kết PCR Kết PCR (Hình 3) cho thấy mẫu biểu gen chứng nội GAPDH (97bp) Mẫu gel NT biểu gen SRY (224bp) giống với mẫu chứng mơ tủy ngun người nam, chứng tỏ có tế bào phần mơ tủy ngun mơ hình in vitro di chuyển sang phần gel fibrin Mẫu gel NT biểu âm tính giống với mẫu chứng mô tủy nguyên người nữ, phù hợp với thí nghiệm, NT khơng bổ sung mơ tủy ngun mơ hình nghiên cứu BÀN LUẬN Cấu trúc gel fibrin/tế bào Tế bào đưa vào gel fibrin dung dịch fibrin tồn dạng lỏng (chưa hình thành gel) Khi đó, tế bào huyền phù dung dịch fibrin Khoảng 20 phút sau, dung dịch fibrin chuyển thành dạng gel, tế bào bắt giữ bên gel Dưới kính hiển vi soi ngược, thấy tế bào phân bố gel fibrin Khi cố định lên gel, tế bào có dạng tròn tế bào chưa bám dính trạng thái co lại ảnh hưởng trypsin Sau cố định tế bào lên gel fibrin, cần giữ gel tủ ni cấy 24 trước thu nhận Đó thời gian để tế bào thích nghi với mơi trường bám trải Quan sát sau 24 giờ, tế bào bắt đầu có dạng bám trải khung nâng đỡ gel fibrin Sau lấy gel fibrin khỏi giếng, quan sát bề mặt giếng kính hiển vi, không thấy xuất tế bào Điều cho thấy, hiệu suất cố định tế bào lên gel fibrin cao Sự tồn tế bào Sau tuần điều kiện nuôi cấy in vitro quan sát thấy nhiều tế bào diện bên gel Ở NT NT 2, mật độ tế bào Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Nghiên cứu Y học bên gel tuần tuần tương đương nhau, khó nhận thay đổi Điều cho thấy tế bào tồn bên gel Kết nghiên cứu phù hợp với kết luận giới gel fibrin chứng minh có khả hỗ trợ bám, tăng sinh biệt hóa tế bào Christman (2004) Zha (2008) chứng minh gel fibrin tế bào tồn phát triển Gel fibrin có cấu trúc khơng gian chiều, lỗ thông với Gel fibrin đóng vai trò chất ngoại bào tạm thời, cung cấp mơi trường cho tế bào phát triển Ngồi ra, gel fibrin có vùng RGD (Arginine-glycineasparagine) vùng cho phép thụ thể tế bào bám vào Khi đưa lên gel fibrin, tế bào giữ lại chất ngoại bào này(1, 6) Theo Sharma (2014) Jamey (2009), mềm mại tương hợp sinh học tốt gel fibrin hiệu để tạo khung nâng đỡ cho tế bào Hơn nữa, khung nâng đỡ fibrin có nhiều đặc tính phân hủy sinh học, dễ dàng thu nhận xử lý, tạo nhiều hình dạng với nhiều kích thước khác Gel fibrin thu nhận từ máu bệnh nhân nên khung nâng đỡ tự thân, không độc, không gây viêm Không giống với hydrogel tổng hợp, fibrin không khung nâng đỡ giúp phân phối tế bào cách thụ động, mà chứa nhân tố tăng trưởng đặc biệt thành phần đông máu, gồm fibronectin, axit hyaluronic nhân tố von Willebrand(2, 4) Sự di cư tế bào Kết PCR để đánh giá di cư tế bào từ mô tủy nguyên người nam sang gel fibrin Đồng thời với việc khuếch đại gen SRY (224 bp) khuếch đại gen GAPDH (97 bp) Đây gen thể tế bào, không phụ thuộc vào thể loại, trạng thái hoạt động hay nguồn gốc nên dùng gen nội chuẩn để đánh giá chất lượng sản phẩm DNA tách chiết Kết cho thấy biểu GAPDH tất mẫu rõ ràng Điều chứng tỏ khâu tách chiết khuyếch Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 đại đạt độ nhạy Cả mẫu có chất lượng DNA thu nhận tốt, đảm bảo tiêu chuẩn cho phản ứng, phản ứng PCR với chu trình thiết lập diễn bình thường, đồng thời khơng có khác biệt lượng mẫu sử dụng phản ứng PCR Hai mẫu đối chứng có kết hợp lý, mẫu mơ tủy ngun giới tính nam biểu dương tính với gen SRY, mẫu mơ tủy ngun giới tính nữ khơng biểu gen SRY Về kết khuếch đại gen SRY, mẫu biểu dương tính có nghiệm thức Trong mơ hình thí nghiệm, nghiệm thức bổ sung mô tủy nguyên người nam gel fibrin có tế bào nữ Kết cho thấy phần gel fibrin nghiệm thức xuất tế bào mang giới tính nam, từ kết luận tế bào từ mơ tủy ngun người nam di cư sang phần gel fibrin mơ hình thí nghiệm Nghiệm thức âm tính với gen SRY, phù hợp với mơ hình thí nghiệm, nghiệm thức không bổ sung mô tủy nguyên người nam, có gel fibrin có tế bào nữ Kết PCR đưa kết luận tế bào từ mô tủy nguyên di cư sang cấu trúc gel fibrin/tế bào TÀI LIỆU THAM KHẢO Christman KL, Vardanian AJ, Fang Q., Sievers R E., Fok H H., et al (2004), "Injectable fibrin scaffold improves cell transplant survival, reduces infarct expansion, and induces neovasculature formation in ischemic myocardium", J Am Coll Cardiol, 44 (3), pp.654-660 Cornelissen C G., Dietrich M., Kruger S., Spillner J., SchmitzRode T., et al (2012), "Fibrin gel as alternative scaffold for respiratory tissue engineering", Ann Biomed Eng, 40 (3), pp.679-687 Gronthos S., Mankani M., Brahim J., Robey P G., Shi S (2000), "Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo", Proc Natl Acad Sci USA, 97 (25), pp.13625-13630 Janmey P A., Winer J P., Weisel J W (2009), "Fibrin gels and their clinical and bioengineering applications", Journal of The Royal Society Interface, (30), pp.1-10 Li R., Guo W., Yang B., Guo L., Sheng L., et al (2011), "Human treated dentin matrix as a natural scaffold for complete human dentin tissue regeneration", Biomaterials, 32 (20), pp.4525-4538 Shaikh F M., Callanan A., Kavanagh E G., Burke P E., Grace P A., et al (2008), "Fibrin: a natural biodegradable scaffold in vascular tissue engineering", Cells Tissues Organs, 188 (4), pp.333-346 Tran Le Bao Ha, Nguyen Thi Ngoc My, Doan Nguyen Vu (2015), "Fabrication and evaluation of human dentin as scafford for dental pulp stem cells", Tissue engineering and Regenerative medicine Tran Le Bao Ha, Đoan Nguyen Vu, To Minh Quan, Phan Kim Ngoc, Nguyen Thi Thu, et al (2011), "Study on Culture of Human Dental Pulp Stem Cells to apply in Tissue Engineering", Journal of Biomimetics, Biomaterials & Tissue Engineering, 11, pp.13-20 KẾT LUẬN Kết nghiên cứu tạo cấu trúc gel fibrin/tế bào từ huyết tương dung dịch CaCl2 với nồng độ cuối CaCl2 20mM, mật độ 104 tế bào 500 µl gel Có tồn tế bào bên cấu trúc gel fibrin sau tuần ghép mảnh ngà xử lý di cư tế bào mô tủy nguyên sang gel fibrin Ngày nhận báo: 27/01/2016 Ngày phản biện nhận xét báo: 26/02/2016 Ngày báo đăng: 25/03/2016 Zhao H., Ma L., Zhou J., Mao Z., Gao C., et al (2008), "Fabrication and physical and biological properties of fibrin gel derived from human plasma", Biomed Mater, (1), pp.15001-15010 Lời cảm ơn: Nghiên cứu tài trợ Bộ Khoa học Công nghệ khuôn khổ đề tài mã số ĐTĐL.2012-G34 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt ... trúc gel fibrin /tế bào từ huyết tương dung dịch CaCl2 với nồng độ cuối CaCl2 20mM, mật độ 104 tế bào 500 µl gel Có tồn tế bào bên cấu trúc gel fibrin sau tuần ghép mảnh ngà xử lý di cư tế bào. .. Gel fibrin/ tế bào B A Ngà Gel fibrin/ tế bào Ngà Gel fibrin/ tế bào C D Hình Tế bào bên gel fibrin sau tuần: (A) NT 1; (C) NT sau tuần: (B) NT 1; (D) NT 2 F M L Hình Kết PCR gen SRY mẫu gel sau. .. LUẬN Cấu trúc gel fibrin /tế bào Tế bào đưa vào gel fibrin dung dịch fibrin tồn dạng lỏng (chưa hình thành gel) Khi đó, tế bào huyền phù dung dịch fibrin Khoảng 20 phút sau, dung dịch fibrin chuyển