Nghiên cứu này tiến hành thu nhận và khử trùng mô tủy răng người. Sau đó, tế bào tủy răng được phân lập và nuôi cấy, sự hiện diện của quần thể tế bào gốc trong hỗn hợp tế bào sau nuôi cấy được xác định bằng phương pháp khảo sát sự tăng sinh và kỹ thuật flow cytometry. Mời các bạn cùng tim hiểu tiềm năng ứng dụng của tế bào gốc tủy răng người.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Số * 2012 TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG NGƯỜI Trần Lê Bảo Hà*, Đồn Ngun Vũ*, Tơ Minh Qn*, Nguyễn Thị Nhật Uyên*, Lê Thị Ngọc Hương*, Nguyễn Thị Ngọc Mỹ*, Phan Kim Ngọc*, Nguyễn Thị Thư**, Đặng Vũ Ngọc Mai**, Hồng Đạo Bảo Trâm**, Hồng Tử Hùng** TĨM TẮT Mở đầu: Gần đây, nhà khoa học phát tủy mơ có chứa tế bào gốc Tế bào gốc tủy nguồn tế bào dễ thu nhận khơng xâm lấn, có tiềm tăng sinh biệt hóa cao, lưu trữ nhiều năm, tương tác tốt với nhiều loại vật liệu sinh học Đối tượng phương pháp: Trong nghiên cứu này, tiến hành thu nhận khử trùng mơ tủy người Sau đó, tế bào tủy phân lập nuôi cấy Sự diện quần thể tế bào gốc hỗn hợp tế bào sau nuôi cấy xác định phương pháp khảo sát tăng sinh kỹ thuật Flow cytometry Đồng thời, ngà sử dụng làm khung nâng đỡ cho tế bào gốc tủy Kết quả: Kết cho thấy, thu nhận nuôi cấy thành công tế bào gốc tủy người Quần thể tế bào sau nuôi cấy biểu marker CD13, CD44, CD90, CD105, CD166 Tế bào gốc tủy có khả tăng sinh bề mặt ngà xử lí hóa chất Kết luận: Với kết đạt được, tế bào gốc tủy hứa hẹn nguyên liệu quan trọng cho nghiên cứu kỹ nghệ mô lĩnh vực nha khoa tái tạo Từ khóa: Bề mặt ngà, nuôi cấy sơ cấp, flow cytometry, tế bào gốc, tủy người ABSTRACT APPLIED POTENTIAL OF HUMAN DENTAL PULP STEM CELLS Tran Le Bao Ha, Doan Nguyen Vu, To Minh Quan, Nguyen Thi Nhat Uyen, Le Thi Ngoc Huong, Nguyen Thi Ngoc My, Phan Kim Ngoc, Nguyen Thi Thu, Dang Vu Ngoc Mai, Hoang Dao Bao Tram, Hoang Tu Hung * Y hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 – No.1 – 2012: 10 - 17 Background: Recently, scientists have found that dental pulp tissue contains stem cells Dental pulp stem cells as a source of cells are easy to obtain for non-invasive, has the highly potential to grow and differentiate, can be stored for many years, interact well with many types of biomaterials Materials and method: In this research, we performed the experiments to collect and disinfect human dental pulp tissue Then, dental pulp cells are isolated and cultured The presence of stem cell populations in cultured cells is determined by proliferation assay and Flow cytometry Simultaneously, dentin was used as a scaffold for the dental pulp stem cells Results: Results shown that we are successful in collection and culture of human dental pulp stem cells Populations of cultured cells are positive for expression of CD13, CD44, CD90, CD105, CD166 markers Dental pulp stem cells can proliferate on chemically treated dentin surface Conclusion: With the results achieved, dental pulp stem cells promises to be an important material for research in tissue engineering as well as in dental regeneration Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia-thành phố Hồ Chí Minh Đại học Y Dược, thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS.Trần Lê Bảo Hà ĐT: 0988575507 Email: tlbha@hcmus.edu.vn * ** 10 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Số * 2012 Nghiên cứu Y học Keywords: dentin surface, primary culture, flow cytometry, stem cells, human dental pulp DMEM/F12 (Sigma) bổ sung 10% FBS (huyết MỞ ĐẦU thai bò-Gibco), 2mM L-glutamin, Trên giới, tế bào gốc tủy 100U/ml penicillin, 100µg/ml streptomycin ni cấy thành công vài năm gần Xác định tính gốc tế bào tủy có khả ứng dụng cao Đến người nay, có nhiều nghiên cứu việc phân lập tế bào tủy nhiều loài khác Đánh giá tăng sinh tế bào bề mặt Các nghiên cứu chứng minh tế bào gốc chai ni cấy tủy có khả tăng sinh cao biệt Các tế bào cấy chuyền sang đĩa 96 hóa thành dạng tế bào khống hóa mơi giếng với mật độ 104 tế bào/cm2 Mật độ tế bào trường thích hợp (Nakashima, 1991; xác định ngày buồng đếm tế Nakashima et al., 1994; Kettunen et al., 1998; bào với thuốc nhuộm trypan blue Buchaille et al., 2000; Yokose et al., 2000) Các Phương pháp Flow cytometry tế bào tủy xác định có biểu Các tế bào lần cấy chuyền thứ tư số marker tế bào gốc STRO-1 thu nhận trypsin/EDTA 0,25%, điều (Shi, Gronthos, 2003; Shi et al., 2005), CD146 chỉnh mật độ tế bào đạt 106 tế bào/ml Huyền (Gronthos et al., 2003; Miura et al., 2004) phù tế bào 1ml Facs Flow nhuộm với Oct4 (Huang et al., 2006) Bên cạnh 10µl kháng thể 30 phút nhiệt độ nghiên cứu phân lập nuôi cấy tế bào gốc phòng (CD13-PE, CD44-PE, CD90-FITC, tủy răng, khung nâng đỡ ba chiều CD105-PE, CD166-PE, CD34-FITC, CD45-FITC, alginate, collagen, polymer, sứ… BD Sciences, San Jose, CA) Làm lạnh mẫu phát triển nhằm ứng dụng nha khoa tái 15 phút 40C Tiến hành đánh giá tạo (Kumabe et al., 2006; Zhang et al., 2006; marker tế bào máy FACS Calibur sử Young et al., 2002; Gronthos et al., 2002) Trong dụng phần mềm Cell Quest Pro đó, khung nâng đỡ ngà chứng Khảo sát tăng sinh tế bào gốc tủy minh có khả cảm ứng tế bào gốc tủy người khung nâng đỡ ngà răng biệt hóa thành nguyên bào ngà (Huang et al., 2006) Khung nâng đỡ ngà tạo từ ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP khôn người Bề mặt khung Đối tượng nghiên cứu nâng đỡ ngà xử lý với Răng cối nhỏ khơn ngun vẹn, khơng bị sâu thối tủy người tình nguyện thu từ Khoa Răng Hàm Mặt, Trường Đại Học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Khoa Nội Nha, Bệnh viện Răng Hàm Mặt Thành phố Hồ Chí Minh Răng chứa lọ có dung dịch bảo quản Phương pháp phân lập nuôi cấy tế bào tủy Sau tách khỏi răng, mẫu tủy cắt thành mảnh nhỏ (2x2x1 mm) nuôi đĩa 35mm (Nunc) với mơi trường hóa chất citric axit 19% phút, EDTA 17% 10 phút để loại bỏ lớp mùn ngà Hiệu phương pháp xử lý bề mặt khung nâng đỡ ngà đánh giá kính hiển vi điện tử quét Khung nâng đỡ ngà đặt đĩa 96 giếng với môi trường nuôi cấy Sau đó, tế bào gốc tủy lần cấy chuyền thứ tư cấy lên bề mặt ngà với mật độ 104 tế bào/cm2 Sự tăng sinh tế bào xác định phương pháp MTT ngày nuôi cấy thứ 2, 4, 6, 8, 10 11 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Số * 2012 Nghiên cứu Y học Xử lý số liệu Số liệu thu nhận xử lý theo chương trình Statgraphic 7.0 Trường Đại học Michigan (Mỹ) KẾT QUẢ Kết nuôi sơ cấp mô tuỷ Vào ngày nuôi cấy thứ 7, bắt đầu xuất tế bào trải; tế bào có nhiều hình dạng khác dạng hình thoi, dạng kéo dài, dạng hình sao, dạng giống tế bào nội mơ… Trong ngày ni cấy sau đó, dạng tế bào thu hẹp lại; dạng tế bào chiếm ưu dạng tế bào trải rộng, nhân lớn hình oval có nhiều bào tương Ngày thứ 21, tế bào bắt đầu hợp dòng, trải thành lớp đơn phủ kín bề mặt đĩa ni, thời điểm thích hợp để thu nhận tế bào (Hình 1) Kết đánh giá tăng sinh tế bào bề mặt chai nuôi cấy ngày 6, đạt cao vào ngày 6, sau giảm nhanh đến ngày Kết xác định marker tế bào gốc Các tế bào tủy nuôi cấy hệ thứ tư đánh giá biểu marker bề mặt Flow cytometry Kết cho thấy, tế bào ứng viên dương tính mạnh với marker CD13 (99,97%), CD44 (99,84%), CD90 (97,34%), CD105 (91,95%), CD166 (98,18%) âm tính với marker CD34 (0,42%), CD45 (0,08%) (Hình 2) Kết khảo sát tăng sinh tế bào gốc tủy người bề mặt ngà Kết đánh giá hiệu xử lý bề mặt ngà Dựa vào kết chụp kính hiển vi điện tử quét, nhận thấy bề mặt ngà chưa xử lý bị bao phủ hoàn toàn lớp mùn ngà xử lý lớp mùn ngà loại bỏ hoàn toàn để lộ ống ngà bề mặt (Hình 3) Đồ thị cho thấy sau cấy chuyền, tế bào tăng sinh mạnh từ ngày đến A C 12 B D Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Số * 2012 Nghiên cứu Y học Số tế bào (x 10 tế bào/cm ) Hình Tế bào mọc lan từ mảnh mô sau ngày nuôi cấy A Mảnh mô tủy đĩa nuôi (100X); B Tế bào tủy sau ngày nuôi cấy (100X); C Tế bào tủy sau 15 ngày nuôi cấy (100X); D Tế bào tủy sau 21 ngày nuôi cấy (100X) Thời gian 13 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Số * 2012 Nghiên cứu Y học Đồ thị Đường cong tăng trưởng tế bào tủy người ni cấy Hình Kết phân tích Flow cytometry tế bào tủy ứng viên A B Hình Hình chụp bề mặt ngà kính hiển vi điện tử quét A Bề mặt ngà chưa xử lý (1000X); B Bề mặt ngà xử lý (2000X) Kết khảo sát tăng sinh tế bào gốc tủy người khung nâng đỡ ngà 14 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Số * 2012 Mật độ quang (OD) Nghiên cứu Y học Thời gian Đồ thị Biểu diễn tương quan mật độ quang (OD) với mốc thời gian nuôi cấy trưởng thành khác Abbas đồng tác giả Kết khảo sát MTT cho thấy tế (2008) chứng minh tế bào gốc từ tủy bào gốc tủy người có khả bám dính có nguồn gốc từ mào thần kinh Tế bào tăng sinh tốt khung nâng đỡ ngà gốc tủy có biểu marker tế bào có xử lý nguồn gốc phôi Oct-4, Nanog, SSEA-3, SSEA-4, BÀN LUẬN TRA-1-60, TRA-1-81CD44 marker tế bào Tế bào gốc tủy gốc trung mô CD90, CD146, CD166, CD73, CD105, CD44, CD49b (Kerkis et al., 2006; Jo et Các nhà khoa học chứng minh al., 2007; Baghaban et al., 2009; Erdal Karaöz et nguồn tế bào gốc có tiềm ứng dụng al., 2009) Kết nghiên cứu điều trị lâm sàng giống nguồn tế bào chứng minh tế bào tủy có khả gốc tìm trước Sở dĩ, tế bào bám dính tăng sinh điều kiện nuôi gốc tủy nhận quan tâm đặc biệt cấy in vitro Ngoài ra, tế bào ni cấy biểu chúng có nhiều ưu điểm bật Thứ marker CD13, CD44, CD90, CD105, nhất, nguồn tế bào thu nhận CD166 marker tế bào gốc trung suốt đời sống người; đặc biệt mô Từ kết thu được, thấy thu nhận tốt sữa nguồn gen quần thể tế bào gốc trung mô từ tủy chưa chịu nhiều tác động môi trường bên người có đồng hệ ni cấy ngồi Thứ hai, việc thu nhận nguồn tế bào thứ tư tế bào trì đặc gây xâm lấn bệnh nhân, diễn trình tự nhiên (rụng trẻ tính gốc q trình nuôi cấy in vitro em) Thứ ba, việc sử dụng nguồn tế bào Ngoài ra, protein biểu bề mặt không vướng phải vấn đề đạo đức, tôn tế bào gốc tủy cho thấy chúng không giáo giống tế bào gốc phôi Đây có khả biệt hóa thành tế bào nguồn tế bào gốc có tiềm biệt hóa thuộc lớp trung mơ nguyên bào ngà, cao ứng dụng điều trị nhiều mô nguyên bào xương, tế bào sụn, tế bào mỡ, tế quan khác thể Shi đồng tác bào mà có khả chuyển biệt hóa giả (2003) phát dòng tế bào gốc thành tế bào chức khơng thuộc lớp sữa người dễ dàng bảo quản trung mô tế bào β tuyến tụy, tế bào sử dụng cho liệu pháp điều trị thần kinh, tế bào tim, tế bào giống tế bào tương lai Các tế bào xuất tuần thứ gan (Kerkis et al., 2006; Huang et al., 2006; sáu trình phát triển phôi người; Baghaban et al., 2009; Jinhua et al., 2010) chúng có khả tăng trưởng tiềm Tiềm ứng dụng tế bào gốc tủy biệt hóa cao nguồn tế bào gốc 15 Nghiên cứu Y học Tế bào gốc tủy dùng để tái tạo xương sửa chữa khiếm khuyết sọ mặt Những nghiên cứu in vitro in vivo cho thấy tế bào gốc trưởng thành từ có khả tái tạo chân có nhân tố tăng trưởng khung nâng đỡ phù hợp Liệu pháp tái tạo gây tổn thương cho bệnh nhân phẫu thuật cấy ghép; nghiên cứu mơ hình động vật cho thấy hiệu điều trị hoạt động chức mô cấy ghép sinh học trội nhiều so với phương pháp implant phương pháp truyền thống khác Tế bào gốc tủy có khả tăng sinh vô hạn, đa tiềm nên chúng nguồn tế bào gốc quan trọng để tái tạo sửa chữa khiếm khuyết sọ mặt, tổn thương xương Do có khả sản xuất tiết yếu tố thần kinh, tế bào gốc tủy có khả điều trị bệnh thối hóa thần kinh sửa chữa tế bào thần kinh vận động sau đột quỵ hay chấn thương Tế bào gốc từ khơn có khả tiết chất giúp trì sống dây thần kinh sau chấn thương Trong tương lai, tế bào gốc từ ứng dụng nhằm tái tạo tế bào thần kinh cho bệnh nhân chấn thương cột sống Tế bào gốc tủy cấy ghép vào buồng tủy để tái tạo tủy cho bị sâu, giảm thiểu việc điều trị nội nha Cordeiro đồng tác giả (2008) đánh giá đặc điểm hình thái mơ hình thành cấy ghép tế bào gốc sữa vào giá thể có khả phân hủy sinh học; sau đó, đưa phức hợp lên lát cắt ngà người cấy vào chuột suy giảm miễn dịch Kết cho thấy cấu trúc mơ hình thành gần giống với tủy sinh lý Trong nghiên cứu gn õy, De Mendonỗa Costa A (2008) ó phõn lp tế bào gốc từ tủy người để tái tạo khiếm khuyết xương sọ có kích thước lớn chuột Kết cho thấy tổn thương chuột chữa lành, ông cho nguồn tế bào gốc đầy hứa hẹn nhằm tái tạo khiếm khuyết phẫu 16 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Số * 2012 thuật sọ mặt Liệu pháp tế bào gốc đề nghị ứng dụng điều trị nhiều bệnh Parkinson, đa xơ cứng, bệnh gan, tiểu đường, tim mạch, tự miễn, rối loạn xương, tái tạo thần kinh sau chấn thương não hay tủy sống, ứng dụng điều trị gãy xương, ung thư phẫu thuật cột sống Khung nâng đỡ nuôi cấy tế bào gốc tủy Các polymer tự nhiên có tính tương hợp sinh học cao không gây phản ứng thải loại ghép vào bệnh nhân Collagen protein quan trọng thể người Nó thành phần chủ yếu tủy chất ngà Do đó, có nhiều nghiên cứu sử dụng collagen làm khung nâng đỡ nuôi cấy tế bào tủy Zhang đồng tác giả (2006) chứng minh chất collagen kích thích tế bào gốc tủy bám dính tăng sinh tốt Kumabe đồng tác giả (2006) đưa tế bào tủy vào giá thể alginate; sau cấy da bụng chuột Sau tuần cấy ghép, giá thể xuất thể khoáng hóa Các polymer tổng hợp sử dụng phổ biến có ưu điểm tổng hợp kiểm sốt đặc tính hóa lý (cấu trúc, độ bền, kích thước lỗ tỉ lệ thối biến) Young đồng tác giả (2002) ni cấy tế bào gốc tủy ba loại khung nâng đỡ từ polymer tổng hợp polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), poly (lactide-co-glycolide) (PLGA); kết cho thấy có hình thành phức hợp ngà tủy bên khung nâng đỡ Vật liệu sứ ứng dụng rộng rãi kỹ nghệ mô xương nha khoa phục hồi (răng sứ, mão…) Trong ứng dụng lâm sàng cho thấy loại vật liệu có nhiều ưu điểm kích thích tế bào bám dính khống hóa, liên kết tốt với mô xung quanh cấy ghép giúp lành vết thương nhanh kim loại Gronthos đồng tác giả (2002) chứng minh lớp giống ngà hình Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Số * 2012 thành cấy khung nâng đỡ sứ có mang tế bào gốc tủy chuột suy giảm miễn dịch Ngoài ra, nhà khoa học nghĩ tới việc sử dụng ngà làm khung nâng đỡ nuôi cấy tế bào gốc tủy đạt nhiều kết đáng kể Batouli đồng tác giả (2003) nuôi cấy tế bào tủy người bề mặt ngà; sau đó, cấy vào chuột suy giảm miễn dịch, nhận thấy có cấu trúc giống ngà hình thành bề mặt ngà Huang đồng tác giả (2006) chứng minh khung nâng đỡ ngà có khả cảm ứng tế bào gốc tủy biệt hóa thành nguyên bào ngà Trong nghiên cứu này, chứng minh khung nâng đỡ ngà có khả kích thích tế bào gốc tủy bám dính tăng sinh tốt Đây tiền đề cho việc phát triển phương pháp điều trị nhằm ứng dụng nguồn tế bào gốc để tái tạo tủy giống tự nhiên Ngân hàng tế bào gốc tủy Thời gian gần đây, ngân hàng tế bào gốc tủy phổ biến nhận quan tâm đặc biệt nhiều cơng ty giới Các phòng thí nghiệm BioEden (Austin, Texas) Mỹ, International laboratories Anh (khu vực Châu Âu) Thái Lan (khu vực Đông Nam Á) với kế hoạch mở rộng sang Nga, Úc Trung Đông Các công ty tham gia thành lập ngân hàng tế bào gốc tủy StemSave Store-A-Tooth Mỹ… Tại Nhật Bản, ngân hàng tế bào gốc tủy thành lập Đại học Hiroshima với tên “Three Brackets” (Suri Buraketto) vào năm 2005 Đại học Nagoya (Kyodo, Nhật Bản) thành lập ngân hàng vào năm 2007 Trường Đại học Y Taipei (TMU) phối hợp với Đại học Hiroshima mở ngân hàng quốc gia vào tháng năm 2008 với mục tiêu lưu trữ cho cấy ghép tự nhiên cung cấp nguồn tế bào gốc tủy KẾT LUẬN Nghiên cứu Y học Chúng nuôi cấy xác định thành công diện quần thể tế bào gốc trung mô hỗn hợp tế bào tủy người nuôi cấy Thêm nữa, tế bào có khả tăng sinh tốt bề mặt ngà Việc thu nhận lưu trữ tế bào gốc tủy nguồn tế bào dự trữ cho tương lai người cần đến chúng Lời cảm ơn: Chúng chân thành cảm ơn Bệnh viện Răng Hàm Mặt Thành phố Hồ Chí Minh Trường Đại Học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp mẫu để tiến hành thí nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 Abigail ST, Paul TS (2004) The Cutting Edge of Mammalian Development: How the Embryo Makes Teeth Nat Rev Genet 5: 499-508 Baghaban Eslaminejad MR, Nazarian H, Shariati M,Vahabi S (2009) Human Dental Pulp Stem Cells: The Culture Optimization for Increased Growth IJHOSCR 3: 5-13 Batouli S, Miura M, Brahim J, Tsutsui TW, Fisher LW, Gronthos S, Robey PG, Shi S (2003) Comparison of stemcell-mediated osteogenesis and dentinogenesis J Dent Res 82: 976-981 Conan SY, Shinichi T, Joseph PV, Masaki H, John DB, Pamela CY (2002) Tissue Engineering of Complex Tooth Structures on Biodegradable Polymer Scaffolds J Den Res 81: 695-700 George TJH, Wataru S, James C, Sang HP (2006) In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods ang culturing enviroment Cell Tissue Res 10: 1-23 Gronthos S, Brahim J, li W, Fisher LW, Cherman N, Boyed A, DenBesten B, Robey PG, Shi S (2002) Stem cell properties of human dental pulp stem cells J Dent Res 81:531-535 Jinhua Y, Huixia H, Chunbo T, Guangdong Z, Yuanfei L, Ruoning W, Junnan S, Yan J (2010) Differentiation potential of STRO-1+ dental pulp stem cells changes during cell passaging BMC Cell Biol 11: 32-39 Jinhua Y, Zhihong D, Junnan S, Huihong Z, Xin N, Heng Z, Yucheng L, Yan J (2006) Differentiation of dental pulp stem cell into Regular-Shaped Dentin-Pulp Complex Induced by Tooth Germ Cell Conditioned Medium Tissue Eng 12: 30973105 Kerkis I, Kerkis A, Dozortsev D, Stukart-Parsons GC, Gomes Massironi SM, Pereira LV, Caplan AI, Cerruti HF (2006) Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers Cells Tissues Organs 184: 105-116 Shunji K (2006) Human dental pulp stem cell culture and cell Transplantation with an alginate scaffold Okajimas Folia Anat Jpn 84: 147-156 Zhang W, Frank Walboomers X, van Kuppevelt TH, Daamen WF, Bian Z, Jansen JA (2006) The performance of human dental pulp stem cells on different three-dimensional 17 ... thấy tế (2008) chứng minh tế bào gốc từ tủy bào gốc tủy người có khả bám dính có nguồn gốc từ mào thần kinh Tế bào tăng sinh tốt khung nâng đỡ ngà gốc tủy có biểu marker tế bào có xử lý nguồn gốc. .. nguồn tế bào gốc có tiềm ứng dụng al., 2009) Kết nghiên cứu điều trị lâm sàng giống nguồn tế bào chứng minh tế bào tủy có khả gốc tìm trước Sở dĩ, tế bào bám dính tăng sinh điều kiện nuôi gốc tủy. .. phát dòng tế bào gốc thành tế bào chức không thuộc lớp sữa người dễ dàng bảo quản trung mô tế bào β tuyến tụy, tế bào sử dụng cho liệu pháp điều trị thần kinh, tế bào tim, tế bào giống tế bào tương