Nội dung bài viết nhằm khai thác nguồn dược liệu làm thuốc kháng nấm, đề tài được thực hiện với mục tiêu khảo sát một số điều kiện chiết cao từ lá trầu không piper betle L. piperaceae. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN CHIẾT XUẤT CAO TRẦU KHÔNG (PIPER BETLE L PIPERACEAE) Phan Thị Thanh Thủy*, Nguyễn Mai Hương*, Nguyễn Nhật Anh*, Nguyễn Đinh Nga* TÓM TẮT Mục tiêu: Nhằm khai thác nguồn dược liệu làm thuốc kháng nấm, đề tài thực với mục tiêu: “Khảo sát số điều kiện chiết cao từ Trầu không Piper betle L Piperaceae” Phương pháp: Nguyên liệu (lá Trầu không tươi non, bánh tẻ, già hay bột khô) chiết dung môi khác (ethanol 96%, 70%, 50%, 30% nước) phương pháp khác (ngâm lạnh, ngấm kiệt, đun hồi lưu) Nguyên liệu phương pháp chiết lựa chọn dựa khối lượng mức độ kháng vi sinh vật cao chiết Một só điều kiện ảnh hưởng đến trình chiết xuất xác định nhờ vào hỗ trợ phần mềm BCPharsoft Kết quả: Lá Trầu không tươi loại bánh tẻ, chiết xuất với nước đun hồi lưu với điều kiện chiết xuất tối ưu hóa (tỉ lệ dược liệu – nước : 5), đun hồi lưu giờ, dịch chiết cô đến 64 ml trước lắc phân bố với dichlorometan) Kết luận: Chiết xuất cao từ Trầu không tươi phương pháp đun hồi lưu với nước cho hiệu suất kháng nấm – kháng khuẩn hàm lượng phenolic tồn phần cao Từ khóa: cao Trầu không, BC Pharsoft ABSTRACT RESEARCH SOME CONDITIONS IN EXTRACTION BETEL LEAVES PIPER BETLE L PIPERACEAE Phan Thi Thanh Thuy, Nguyen Mai Huong, Nguyen Nhat Anh, Nguyen Dinh Nga * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No - 2014: 251 - 255 Purpose: To use betel leaves as an antifungal material source, the aim of this study is “Research some conditions in extraction betel leaves Piper betle L Piperaceae” Method: Betel leaves (Piper betle L Piperaceae) (fresh or powder); young, mature or old betel leaves were used for extraction with different solvents (ethanol 96 %, ethanol 70%, ethanol 50%, ethanol 30% and water) in different methods Materials and method of extraction is selected by extract’s weight and antimicrobial effect Conditions affect to extraction process were determine by using BC Pharsoft software Result: Fresh betel mature leaves were extracted in optimized conditions to get betel extract which reach maximum antimicrobial influence and maximum total phenolic compound such as: Solvent is water at 100 oC (1 litre for 200 g of leaves), extract time (3 hour), extract volume after reducing solvent before extracting with dichloromethan (64 ml) Conclutions: The conditions were determined to give good betle extract with phenolic compound in high level, strong antimicrobial such as using fresh betel leaves; extracting with water at 100 0C in hour Key words: betel extract, BC Pharsoft ĐẶT VẤN ĐỀ Trầu không (Piper betle L Piperaceae) thuốc sử dụng từ lâu đời y học cổ truyền nước ta số nước châu Á trị hắc lào, lang ben4 Đặc biệt tác dụng kháng nấm, * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS Nguyễn Đinh Nga ĐT: 0908836969 Chuyên Đề Dược Học Email: nganguyendinh@yahoo.com 251 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 kháng khuẩn Trầu không nhiều nghiên cứu giới kiểm chứng(5) Khác với tinh dầu Trầu không chiết cất kéo nước, với thành phần eugenol, cao chiết từ Trầu khơng với cồn ethyl có thành phần hydroxychavicol chứng minh có tác động kháng nấm da, Malassezia furfur Candida spp.(5,1) Nhằm khai thác Trầu không nguồn nguyên liệu làm thuốc trị bệnh da niêm mạc, góp phần xây dựng tiêu chuẩn cho cao Trầu không, đặt vấn đề “Nghiên cứu điều kiện chiết xuất cao Trầu không cho tác động kháng vi sinh vật” Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát phương pháp chiết cao Trầu không - Khảo sát điều kiện chiết xuất cao Trầu không với hiệu suất chiết hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm cao - Xác định thời kỳ sinh trưởng để thu hái Trầu khơng có hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm tốt dichloromethan, phân đoạn dichloromethan thu hồi dung môi để có cao Trầu khơng (cao TKLK), hút ẩm đến trọng lượng không đổi trước xác định khối lượng cao2 - Lá trầu tươi cắt nhỏ chiết xuất với cồn ethyl 70% nước cất cách đun hồi lưu (1000 g tươi hiết xuất với lít dung mơi) Cao chiết với cồn ethyl cao nước lắc phân bố với dichloromethan xử lý tương tự chiết bột khơ để có cao Trầu không (cao TKLT) - Hiệu suất chiết (X) tính tốn dựa theo hai tiêu khối lượng cao chiết tác động kháng vi sinh vật (nồng độ tối thiểu ức chế C albicans) theo công thức sau: X = P (mg) ; P: khối lượng cao chiết MIC ( mg ) Cách tính toán giúp đánh giá hiệu kháng vi sinh vật thật độ tinh cao ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU chiết: Hiệu suất chiết cao Trầu không Đối tượng cao khối lượng cao chiết lớn Lá Trầu khơng Bà Điểm-Hóc Mơn tươi (LT) xử lý thành bột khô (LK) giá trị MIC cao phải nhỏ Mỗi loại dung môi phương pháp chiết Candida albicans ATCC 10231, M furfur ATCC 44344, Staphylococcus aureus ATCC 29213, E coli ATCC 25922 lập lại lần Sử dụng F-test để so Phương pháp nghiên cứu pháp chiết, số điều kiện ảnh hưởng đến Chiết xuất cao Trầu không - Lá Trầu khô: Bột Trầu không chiết xuất với cồn ethyl độ cồn khác nhau: 96%, 70%, 50%, 30% nước cách ngâm lạnh, ngấm kiệt đun hồi lưu Lượng dược liệu dung môi sử dụng theo tỉ lệ 1/10 Quá trình chiết xuất lập lại lần Sau bốc dung mơi 1/10 thể tích, dịch chiết với cồn loại nhựa chlorophyll ether dầu hỏa Các dịch chiết cồn loại chlorophyll dịch chiết nước lắc phân bố với trình chiết lượng dung mơi, thời gian chiết 252 sánh hiệu suất chiết - Sau xác định dung môi phương xuất khảo sát với hổ trợ phần mềm BC Pharsoft3 - Các mẫu cao Trầu không xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) phương pháp vi pha loãng theo hướng dẫn NCCLSM27 A26 - Định lượng phenolic toàn phần cao Trầu không phương pháp Folin – Ciocalteu7 Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát điều kiện chiết xuất cao Trầu không từ bột Trầu khô Bảng 1: Khối lượng nồng độ tối thiểu ức chế C albicans cao TKLK Điều kiện chiết xuất Khối lượng cao MIC (µg/ml) TB(g)/10g DL C albicans NL, EtOH 96% 0,27 256 NL, EtOH 70% 0,29 256 NL EtOH 50% 0,08 512 NL EtOH 30% 0,25 768 NK, EtOH 96% 1,2 512 NK, EtOH 70% 1,25 512 ĐHL, EtOH 70% 1,33 256 ĐHL, nước 0,25 512 X Nghiên cứu Y học lưu có hiệu suất chiết cao chiết phương pháp ngâm lạnh có ý nghĩa thống kê với F = 404 > F0,05 = 4,96 - Cao TK chiết phương pháp đun hồi lưu có hiệu suất chiết cao chiết phương pháp ngấm kiệt có ý nghĩa thống kê với F = 289 > F0,05 =4,96 Khảo sát điều kiện chiết xuất cao Trầu không từ Trầu tươi 1055 1133 156 326 2344 2441 5195 488 Theo Ali cộng sự3, cao trầu không chiết xuất từ tươi, với nước cất phương pháp đun hồi lưu thu cao Trầu không chứa hydroxychavicol cao cho tác động kháng vi sinh vật tốt (NL: ngâm lạnh; NK: ngấm kiệt; ĐHL: đun hồi lưu; TB: trung bình; -: khơng thử; khối lượng cao MIC kết trung bình kết lần thí nghiệm) Kết bảng cho thấy chiết xuất cao TK từ bột Trầu với cồn 70% cách đun hồi lưu cho hiệu suất chiết cao Trong dung môi sử dụng để chiết xuất bột Trầu không, cồn ethyl 70% cho hiệu suất chiết cao dung mơi lại Hai điều kiện áp dụng để chiết xuất cao từ Trầu không tươi: Với dung môi chiết EtOH 70%: - Cao TK chiết phương pháp đun hồi Lá Trầu tươi chiết xuất cách đun hồi lưu với hai dung môi cồn ethyl 70% nước cất Kết trình bày bảng Bảng 2: Khối lượng nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật cao TKLT Loại cao Khối lượng cao TB (g) Cao TKLT - EtOH70% Cao TKLT – nước 1,5 3,2 MIC (µg/ml) M furfur E coli 512 256 512 128 C albicans 256 256 S aureus 64 32 khối lượng cao MIC kết trung bình kết lần thí nghiệm Kết bảng cho thấy cao TK chiết từ tươi với nước cất cho hiệu suất cao chiết với EtOH 70% Cao TK chiết từ tươi tinh hơn, màu nâu sáng cao chiết từ dược liệu khô Thực nghiệm cho thấy chiết bột Trầu khô với cồn cao độ, sau bốc dung mơi, q trình xử lý cao cồn sau chiết xuất khó khăn, q trình loại tạp chất nhựa, chlorophyll,…đã ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất chiết Hiệu suất 100 80 TKLT - EtOH70% 60 TKLT - nước 40 TKLK - EtOH70% TKLK- nước 20 C albicans M furfur E coli S aure us Biểu đồ So sánh hiệu suất chiết xuất cao TK điều kiện khác (TKLT: cao TK chiết từ tươi; TKLK: cao TK chiết từ bột khô) So sánh hiệu suất chiết cao TK từ dược liệu khô tươi với hai dung môi EtOH 70% nước biểu đồ cho thấy: Cao TK chiết từ Chuyên Đề Dược Học 253 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học tươi với nước cách đun hồi lưu cho hiệu tốt Khảo sát giai đoạn thu hái Trầu khơng thích hợp Lá Trầu không tươi giai đoạn phát triển già, bánh tẻ, non chiết xuất với nước cất, cách đun hồi lưu Kết bảng cho thấy sử dụng bánh tẻ thích hợp cho việc chiết xuất cao trầu không Bảng 3: Khối lượng nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật cao TK Nguyên liệu Khối MIC trung bình (µg/ml) lượng S cao TB C albicans M furfur E coli aureus (g) Lá già 0,57 256 512 256 64 Lá bánh tẻ 0,64 256 512 256 32 Lá non 0,45 256 512 256 64 Khảo sát điều kiện chiết xuất cao Trầu không với hỗ trợ phần mềm BCPharsoft Các điều kiện cố định Nguyên liệu: Lá Trầu không bánh tẻ tươi 200 g/lô; dung môi: nước cất Phương pháp chiết : đun hồi lưu Các điều kiện khảo sát: x1: lượng nước (lít); x2: thời gian đun hồi lưu (h) x3: lượng dịch chiết sau cô để lắc phân bố với dichloromethan (ml) Trong qui trình chiết xuất, lượng dịch chiết sau cần phải điều chỉnh thích hợp để tránh tạo nhũ nhiều lắc phân bố với dichloromethan, ảnh hưởng đến hiệu suất chiết Bảng 4: Các mức khảo sát điều kiện x1 (lít) 0,4 0,6 0,8 1,0 x2 (giờ) x3 (ml) 20 60 100 Mơ hình thực nghiệm Dựa vào mơ hình D – Optimal với mức khảo sát bảng trên, mơ hình thực nghiệm 254 xây dựng gồm 24 thí nghiệm Thực chiết theo qui trình đun hồi lưu với dung mơi nước Các biến số phụ thuộc xác định thí nghiệm Hiệu suất chiết tính theo mức độ kháng vi sinh vật khối lượng cao chiết y1: Mức độ kháng C albicans y2: Mức độ kháng S aureus Y3: Hàm lượng phenolic tồn phần tính đơn vị đương lượng gam acid gallic/gam cao chiết Bảng 4: Dữ liệu thực nghiệm điều kiện chiết xuất cao Trầu khơng X1 (lít) 0,6 0,6 X2 (giờ) X3 (ml) 100 60 100 0,6 0,8 0,6 1 1 3 20 100 100 20 60 10 11 0,8 0,4 1 12 13 14 15 16 0,6 0,8 0,6 0,8 0,4 17 18 19 20 21 22 23 24 Y1 Y2 Y3 2539 1836 20313 14688 2227 17813 1,09091 1,04132 1,23140 1367 2422 10938 19375 2148 1484 17188 11875 2734 21875 20 20 60 1367 1445 10938 11563 1367 10938 2 20 20 20 60 20 1445 1328 11563 10625 1367 2656 10938 21250 977 7813 1 0,8 60 100 100 2656 2344 21250 18750 2695 21563 0,4 0,4 0,4 0,4 0,8 2 20 60 100 100 60 1445 1758 11563 14063 1563 1953 12500 15625 2344 18750 1,21488 1,06612 1,29752 1,04959 1,30579 1,15702 1,30579 1,09917 1,28926 1,23967 1,07438 1,29752 1,30579 1,13223 1,30579 1,04132 1,04959 1,04132 1,36364 1,04959 1,28926 Dữ liệu bảng dùng làm yếu tố đầu vào cho phần mềm BC Pharsoft Bảng 5: Mức độ liên quan nhân Y1 Y2 Y3 X1 + + + X2 + + + X3 + + + Giá trị dự đoán 2610 21290 1,36 Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Kiểm chứng điều kiện phần mềm tính tốn thực nghiệm Lá Trầu không tươi chiết lần với điều kiện xác định theo mơ hình Kết thực nghiệm so sánh với giá trị dự đoán cao mức độ kháng vi sinh vật cao Việc áp dụng phần mềm thông minh khảo sát điều kiện chiết xuất giúp giảm chi phí thời gian thực nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO Bảng 5: Kết thực nghiệm giá trị dự đoán Lần Lần Lần Lần Lần Lần Trung bình Dự đốn Y1 2812,5 2890,6 2773,4 2812,5 2851,6 2773,4 2819,0 2610,0 Y2 22500 23125 22188 22500 22813 22188 22552 21290 Y3 1,31405 1,32231 1,33884 1,32231 1,33058 1,31405 1,32369 1,36200 Kết thử nghiệm kết dự đốn mơ hình xây dựng phần mềm BC Pharsoft.khác khơng có ý nghĩa thống kê (F=0,29 < F0,05 = 18,51) Từ kết khảo sát, điều kiện chiết xuất cao Trầu không đề nghị sau: Nguyên liệu sử dụng Trầu tươi, loại bánh tẻ; dung môi dùng chiết xuất nước cất với tỉ lệ : (w/v); đun hồi lưu cho cao TK đạt hiệu suất chiết tính lượng Chuyên Đề Dược Học Nghiên cứu Y học Amonkar AJ et al, (1986), “Hydroxychavicol: A new Phenolic Antimutagen from Betel Leaf”, Food and Chemical Toxycology, 24 (12): 1321 – 1324 Bhattacharya S et al, (2005), “Radioprotective property of the ethanolic extract of Piper betleleaf”, J Radiat Res., 46:165 – 171 Chung KK, Đỗ QD (2010), Xây dựng phần mềm BCPharSoft giải tốn tối ưu hố cơng thức quy trình sản xuất dược phẩm Tạp chí Dược học, (4):48-51 Đỗ HB cs (2004), “Cây thuốc Động vật làm thuốc Việt nam”, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, tập I Nguyễn Đinh Nga, Nguyễn Văn Thanh, (2010), Thành phần tác động kháng Candida spp tinh dầu cao chiết từ Trầu khơng Việt Nam, Tạp chí Dược học,(410), tr.27 The National Committee for Clinical Labolatory Standards (2002), “Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility testing of Yeasts”, Approved Standard-Second Edition, M 27-A2.22, 15:1-30 Wen D, Li E, Di H, Liao Y, and Liu H (2005), A universal HPLC method for the determination of phenolic acids in compound herbal medicines, J Agric Food Chern., 53: 66246629 Ngày nhận báo: 11.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo: 21.12.2012 Ngày báo đăng: 10.03.2014 255 ... - Khảo sát phương pháp chiết cao Trầu không - Khảo sát điều kiện chiết xuất cao Trầu không với hiệu suất chiết hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm cao - Xác định thời kỳ sinh trưởng để thu hái Trầu. .. Khảo sát điều kiện chiết xuất cao Trầu không từ Trầu tươi 1055 1133 156 326 2344 2441 5195 488 Theo Ali cộng sự3, cao trầu không chiết xuất từ tươi, với nước cất phương pháp đun hồi lưu thu cao. .. phần cao Trầu không phương pháp Folin – Ciocalteu7 Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát điều kiện chiết xuất cao Trầu không từ bột Trầu