Nội dung bài viết với mục tiêu xây dựng và đánh giá phương pháp định lượng bằng HPLC cho chất chuẩn diosgenin, thiết lập chất chuẩn diosgenin thông qua thẩm định liên phòng thí nghiệm tại 3 phòng thí nghiệm độc lập đạt GLP/ISO.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN DIOSGENIN Phạm Quỳnh Khoa*, Nguyễn Minh Cang*, Nguyễn Minh Đức* TÓM TẮT Mục tiêu: Xây dựng đánh giá phương pháp định lượng HPLC cho chất chuẩn diosgenin Thiết lập chất chuẩn diosgenin thông qua thẩm định liên phòng thí nghiệm phòng thí nghiệm độc lập đạt GLP/ISO Phương pháp: Khảo sát phương pháp định lượng diosgenin nguyên liệu phương pháp HPLC Đánh giá chất lượng thẩm định chất chuẩn diosgenin dựa vào hướng dẫn ISO Guide 31; 34; 35 ISO 13528:2005 Kết quả: Xây dựng quy trình định lượng diosgenin nguyên liệu phương pháp HPLC đạt yêu cầu đánh giá Kiểm tra đánh giá chất lượng chuẩn diosgenin theo đầy đủ tiêu chí đánh giá chất chuẩn xác định liệu hóa lý (điểm chảy, phổ UV-Vis, phổ IR, phổ MS phổ NMR), đánh giá tạp chất liên quan (HPLC DSC), định tính, định lượng, độ đồng lọ chuẩn xác định giá trị ấn định theo ISO Kết luận: Kết thẩm định cho thấy chất chuẩn diosgenin thiết lập có chất lượng cao, đáng tin cậy, đạt tiêu chuẩn sở chất chuẩn gốc (Primary Reference Standard) Từ khóa: Thiết lập chất chuẩn đối chiếu, diosgenin, ISO Guide, thẩm định ABSTRACT ESTABLISHMENT OF DIOSGENIN AS A REFERENCE STANDARD Pham Quynh Khoa, Nguyen Minh Cang, Nguyen Minh Duc * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No - 2014: 303 - 309 Objectives: Establishing and validating an HPLC method for quantitative analysis of diosgenin Establishment of diosgenin as a reference standard through inter-laboratory validation at three independent GLP/ISO laboratories Methods: The HPLC quantitative process of diosgenin was established using an RP8 comlumn and detection at the wavelength of 203 nm The quality valuation was carried out based on guidelines of ISO Guide 31; 34; 35 and ISO 13528:2005 Results: The established HPLC method for diosgenin satisfied all requirements of a trustworthy quantitative analysis The reference standard was evaluated based on criteria including determination of chemical and physical criteria (such as melting point, UV-Vis, IR, MS and NMR spectrum), related impurities (HPLC and DSC), qualitative and quantitative test, homogeneity among the bottles and assignment of value Conclusions: The established reference standard diosgenin is of high quality and meets the requirement for a primary standard Keywords: Establishment of reference standard, diosgenin, ISO Guide, validation chuẩn từ dược liệu, ngày cao ĐẶT VẤN ĐỀ nay, phần lớn chất chuẩn sử dụng Việt Nam Chất chuẩn đối chiếu cần thiết cho chủ yếu phải nhập từ nước ngồi với giá thành cơng việc, nghiên cứu, đánh giá chất lượng cao, thời gian đặt hàng kéo dài vài tuần chí thuốc Yêu cầu chất chuẩn, chất ∗ Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh ĐT: 0908988820 Tác giả liên lạc: GS.TS Nguyễn Minh Đức Chuyên Đề Dược Học Email: ducng@hcm.vn.vnn 303 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 vài tháng Một số chất chuẩn từ dược liệu khơng có thị trường Chất đối chiếu, trang thiết bị, hóa chất, dung mơi Tại Việt Nam, bên cạnh hệ thống chất chuẩn Viện Kiểm Nghiệm thuốc Trung ương Viện Kiểm Nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh thiết lập, số đơn vị nghiên cứu khoa học (viện, trường …) phân lập số chất chuẩn từ dược liệu việc sử dụng hạn chế phạm vi sở thẩm định đầy đủ Vì cần xây dựng hệ thống chất chuẩn với chất lượng cao để áp dụng rộng rãi phạm vi nước; từ giúp tiết kiệm chi phí, thời gian mua chuẩn từ nước đảm bảo kết kiểm nghiệm đáng tin cậy hiệu để làm sở kiểm tra chất lượng chế phẩm đông dược dược liệu làm thuốc Chất đối chiếu diosgenin: Chuẩn thứ cấp (SH) công ty Chromadex (Mỹ), số lô 00004915-227, hàm lượng 98,5% Diosgenin sapogenin steroid ứng dụng để bán điều chế thuốc steroid Nó aglycon nhiều saponin steroid có dược liệu Củ mài (Dioscorea spp), Tỳ giải (Dioscorea tokoro Makino), Mía dò (Costus speciosus (Koenig) Smith)…(4) nên ứng dụng vào việc kiểm định dược liệu chế phẩm chứa chúng Xuất phát từ lý trên, nghiên cứu thực đề tài “Thiết lập chất chuẩn diosgenin” với nguyên liệu diosgenin tinh khiết điều chế từ Mía dò (3) nhằm góp phần thiết lập chất chuẩn từ dược liệu thơng qua bước xây dựng quy trình chung thiết lập đánh giá chất chuẩn đạt tiêu chuẩn sở chất chuẩn gốc, tiến tới xây dựng chất chuẩn đạt chất lượng mức quốc gia ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Trang thiết bị: - Máy sắc ký lỏng hiệu cao Shimadzu LC-20A (Nhật), detector PDA - Máy đo phổ hồng ngoại Shimadzu FTIR8201PC (Nhật) - Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 500 MHz NMR (Mỹ) - Máy đo khối phổ Bruker µQ-TOF MS (Mỹ) Hóa chất, dung mơi phù hợp với mục đích sử dụng Phương pháp nghiên cứu Xây dựng quy trình định lượng HPLC cho diosgenin Tiến hành đánh giá tiêu bao gồm tạp chất liên quan, định tính xác định cấu trúc sắc ký lớp mỏng, điểm chảy, phổ IR, phổ UV, phổ MS, phổ NMR định lượng Thẩm định chất chuẩn liên phòng thí nghiệm phòng thí nghiệm độc lập đạt GLP/ISO thiết lập chất chuẩn theo hướng dẫn ISO Guide 31; 34; 35 ISO 13528:2005 Xây dựng quy trình định lượng diosgenin nguyên liệu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Điều kiện sắc ký: Cột: C8 150 x 4,6 mm, kích thước hạt µm Pha động: Acetonitril – H2O (90:10) Detector: UV 203 nm Đối tượng nghiên cứu Tốc độ dòng: ml/ phút Diosgenin phân lập tinh chế từ cao Mía dò chuẩn hóa Ban Nghiên cứu Khoa học – Thư viện, Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh sản xuất từ Mía dò (Costus speciosus (Koenig) Smith, Costaceae) Lơ Dios.Ref.012012 Số lượng: 15,5 g ; lơ đóng gói 100 lọ, lọ 10 mg Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng 304 Thể tích bơm: 20 µl Dung mơi pha mẫu: Pha động Dung dịch chuẩn: Cân khoảng 10,0 mg diosgenin chuẩn cho vào bình định mức 50 ml Thêm pha động, siêu âm phút Để nguội, bổ Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 sung pha động đến vạch Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Dung dịch thử Cân khoảng 10,0 mg mẫu thử cho vào bình định mức 50 ml Thêm pha động, siêu âm phút Để nguội, bổ sung pha động đến vạch Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiến hành Lần lượt tiêm vào hệ thống dung dịch chuẩn dung dịch thử Ghi nhận sắc ký đồ, tính hàm lượng (%) diosgenin (nguyên trạng) mẫu thử so với chuẩn Nghiên cứu Y học không thay đổi sau n lần tính; sử dụng giá trị ấn định x*(n) để đánh giá kết phân tích theo test-z, loại bỏ kết phân tích có |z| > 2,0; chọn giá trị |z| ≤ 2,0, tính giá trị trung bình (1) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Sắc ký lớp mỏng Sau sắc ký qua ba hệ dung môi khác trên, vết diosgenin điều chế cho vết có màu sắc Rf tương ứng với vết diosgenin đối chiếu, đồng thời mẫu diosgenin điều chế khơng lẫn tạp kèm theo Đánh giá quy trình định lượng Quy trình đánh giá: Tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ ứng dụng để xác định hàm lượng diosgenin nguyên liệu Điểm chảy Đánh giá đồng lọ Theo ISO Guide 35: Các lọ xem đồng S r < ubb với n Phổ hồng ngoại (KBr, FTIR-8210 PC) cho đỉnh hấp thu tương ứng với nhóm chức: Sr = ubb= MS within Kết trung bình đo điểm chảy diosgenin 205 oC nằm giới hạn cho phép (204 – 207 oC) Phổ IR 3384,8 cm-1: Nhóm chức –OH 1647,1 cm-1: Nối đơi C=C vòng 1053,1 cm-1: -C-O-C- vòng Phổ HR-MS MS among − MS within n0 Trong đó, n0 = n = Tuy nhiên, thực tế bất đẳng thức khó đạt Nếu trường hợp Sr n > ubb, áp dụng công thức chuyển đổi sau để tính ubb MS within n υ MS within ubb = Khi đó, lọ xem đồng thỏa mãn bất đẳng thức sau (2): MS among − MS within n s2 2 ≤ ubb ≤ sbb + r n0 Xác định giá trị công bố phiếu kiểm nghiệm (CoA) Giá trị ấn định x*(n) chọn giá trị s* Chuyên Đề Dược Học Hình 1: Phổ HR-MS diosgenin điều chế Phổ HR-MS diosgenin điều chế cho pic ion (M + Na)+ 437,3051 m/z ; phù hợp với công thức phân tử C27H42O3 diosgenin Phổ NMR Phổ 1H-NMR Phổ 1H-NMR mẫu điều chế đo 500 MHz dung mơi CDCl3 cho tín hiệu proton phù hợp với diosgenin: tín hiệu proton 0,77 ppm (3H, s), 0,785 ppm (3H, s), 0,973 ppm (3H, d, J = Hz), 1,02 305 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 ppm (3H, s) gán cho nhóm – CH3 vị trí 27; 18; 21 19 Hình 2: Phổ 13C-NMR diosgenin điều chế tín hiệu proton 3,368 ppm (1H, t, J = 11 Hz), gán cho H – tín hiệu proton 3,47 ppm (2H, m) gán cho proton vị trí 26 tín hiệu proton 4,380 ppm (1H, q, J = Hz Hz) gán cho H – 16 tín hiệu proton 5,336 ppm (1H, t-like, J = Hz) gán cho H – Phổ 13C-NMR 10 11 12 13 14 31,63 71,89 42,46 140,99 121,57 32,23 31,57 50,27 36,82 21,05 39,97 40,44 56,71 31,6 71,5 42,2 140,8 121,3 32,0 31,4 50,1 36,6 20,9 39,8 40,2 56,5 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 80,99 62,32 16,43 19,57 41,79 14,65 109,44 31,81 28,98 30,47 67,01 17,27 80,7 62,1 16,3 19,7 41,6 14,5 109,9 31,4 28,8 30,3 66,7 17,1 Nhận xét: Dữ liệu phổ 13C-NMR diosgenin điều chế phù hợp với diosgenin theo tài liệu Tạp chất liên quan Phương pháp HPLC dựa vào phần trăm diện tích pic Bảng 2: Kết xác định tạp chất liên quan diosgenin tR tạp chất (phút) 4,88 10,23 Tổng Hàm lượng tạp (%) 0,12 0,27 0,39 Nhận xét: Hàm lượng tạp chất có mẫu diosgenin điều chế tính theo phần trăm diện tích pic 0,39% (< 2%) Quét nhiệt vi sai Độ tinh khiết mẫu diosgenin điều chế 98,32 mol% Đánh giá phương pháp định lượng diosgenin Hình 3: Phổ 1H-NMR diosgenin điều chế So sánh liệu phổ 13C-NMR diosgenin điều chế (125 MHz, d = ppm, CDCl3) với diosgenin theo tài liệu (5) Bảng 1: So sánh liệu phổ 13C-NMR diosgenin điều chế (125 MHz, δ = ppm, CDCl3) với diosgenin theo tài liệu C 306 Diosgenin Diosgenin C ( ) điều chế 37,41 37,2 15 Diosgenin Diosgenin ( ) điều chế 32,02 31,8 Tính tương thích hệ thống Bảng 3: Các thơng số sắc ký ứng với đỉnh diosgenin sau sáu lần tiêm liên tiếp (n = 6) Số lần Diện tích t (phút) bơm R đỉnh 5,619 2833568 5,615 2832848 5,608 2833984 5,605 2833774 5,601 2833136 5,605 2834915 TB 5,609 2833704 RSD 0,116% 0,026% Số đĩa lý thuyết 5430,735 5412,480 5408,392 5359,913 5265,265 5355,641 5288,738 0,598% Hệ số kéo đuôi 0,984 0,984 0,983 0,983 0,983 0,983 0,983 0,052% Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học 0,598% 0,052% nhỏ 2% Như hệ thống đạt tính tương thích Nhận xét: RSD thời gian lưu 0,116% nhỏ 1%; RSD diện tích đỉnh, số đĩa lý thuyết, hệ số kéo đuôi tương ứng 0,026%, Tính đặc hiệu (a) (b) (c) (d) Hình Sắc ký đồ đánh giá tính đặc hiệu diosgenin (a): Mẫu chuẩn; (b): Mẫu thử; (c) Mẫu trắng; (d): Mẫu thử thêm chuẩn Thời gian lưu pic diosgenin mẫu thử 5,6 phút tương đương thời gian lưu pic diosgenin mẫu chuẩn, đồng thời mẫu trắng khơng có pic trùng với pic diosgenin Khi thêm lượng chất chuẩn diosgenin vào mẫu thử, chiều cao diện tích pic diosgenin tăng lên so với trước thêm chuẩn Phổ UV-Vis thời gian lưu pic diosgenin mẫu thử giống phổ UV-Vis thời gian lưu pic diosgenin mẫu chuẩn Hình 5: Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích đỉnh nồng độ diosgenin Sử dụng chức kiểm tra độ tinh khiết cho thấy pic diosgenin khơng có thành phần khác tất mẫu Kiểm tra tính tương thích phương trình hồi quy: y = 13911x + 96494 Tính tuyến tính miền giá trị Bảng 4: Sự tương quan diện tích đỉnh nồng độ F = 37788 > F0,05 = 7,708: Phương trình tương thích Số thứ tự Nồng độ (µg/ml) 98,5 197 354,6 394 433,4 492,5 Chuyên Đề Dược Học Diện tích đỉnh trung bình 1443842 2852224 5052617 5591961 6124276 6919295 t = 3,79 > t0,05 = 2,78: Hệ số 96494 có ý nghĩa Nhận xét: R2 = 0,9999 > 0,995, có tương quan tuyến tính diện tích đỉnh nồng độ diosgenin Độ lặp lại Tiến hành định lượng mẫu khác cho kết quả: 307 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học Bảng 5: Kết độ lặp lại phương pháp định lượng diosgenin (n = 6) Số lần xác định Hàm lượng (%) Số liệu thống kê 98,95 98,88 98,97 98,87 98,9 n=6 = 98,885% SD = 0,081; RSD = 0,082% e = ± 0,085 µ = 98,885 ± 0,085 (α = 0,05) 98,74 Nhận xét: Hàm lượng trung bình diosgenin 98,885%, RSD 0,082% nhỏ 2,0% Độ Bảng 6: Kết đánh giá độ phương pháp định lượng diosgenin Mẫu Mức hàm Lượng thêm Lượng tìm Tỷ lệ phục vào (mg) thấy (mg) hồi (%) lượng 7,76 97 7,77 97,13 80% 100% 120% 7,75 96,88 10 10 10 12 12 12 9,72 9,73 9,71 11,65 11,66 11,67 97,2 97,3 97,1 97,08 97,17 97,25 Nhận xét: Tỉ lệ hồi phục mẫu nồng độ nằm khoảng giới hạn 95,0 – 105,0% Kết luận phương pháp đạt độ Đánh giá đồng lọ Số lọ cần lấy để đánh giá đồng lọ: = 11 lọ Lấy ngẫu nhiên lọ theo phần mềm Excel, số thứ tự lọ lấy để định lượng 100, 74, 12, 38, 49, 22, 56, 23, 60, 9, 29; lọ kiểm tra lần Bảng 7: Kết định lượng diosgenin điều chế đánh giá đồng lô STT 308 Lọ số 100 74 12 38 49 Lần (%) 98,95 98,88 98,97 98,87 98,9 Lần (%) 98,87 98,82 98,91 98,8 98,84 10 11 22 56 23 60 29 98,74 98,69 98,73 98,86 98,88 98,85 98,92 98,76 98,66 98,79 98,88 99,02 Loại giá trị bất thường trắc nghiệm Dixon: Xếp kết theo thứ tự tăng dần, xét hai kết nhỏ lớn so với chuỗi liệu: xmin = 98,66% G = 0,24 < G0,05 = 0,468 xmax = 99,02% G = 0,24 < G0,05 = 0,468 Vậy, chuỗi liệu khơng có giá trị bất thường Phân tích phương sai yếu tố theo ANOVA Bảng 8: Bảng phân tích ANOVA kết đánh giá đồng lơ diosgenin Biến thiên Giữa nhóm Trong nhóm Tổng cộng Tổng độ Bậc tự lệch bình Phương sai phương 0,1217 10 0,01217 0,04905 11 0,004459 0,17075 21 F F0,05 2,729 2,854 Nhận xét: F = 2,729 < F0,05 = 2,854, ta có: = 0,047 < µbb = 0,062 Kết luận: Các lọ diosgenin đồng q trình đóng gói Xác định giá trị ấn định, độ không đảm bảo đo giá trị công bố phiếu kiểm nghiệm Bảng 9: Kết định lượng ba phòng thí nghiệm độc lập Mẫu Trung bình PTN1 98,91 98,85 98,94 98,84 98,87 98,83 98,87 PTN2 98,58 98,42 99,52 98,38 98,26 98,68 98,64 PTN3 98,86 100,07 98,76 98,62 98,46 97,89 98,78 PTN 1: Phòng kiểm tra chất lượng, Công ty Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Cổ phần Hóa dược phẩm Mekophar PTN 2: Khoa thiết lập chất chuẩn chất đối chiếu, Viện Kiểm Nghiệm thuốc TP HCM PTN 3: Khoa kiểm nghiệm dạng bào chế, Viện Kiểm Nghiệm thuốc TP HCM Bảng 10: Kết tính giá trị ấn định hàm lượng (%) diosgenin (n = 18) δ = 1,5 x s* x* - δ x* + δ Trung bình Độ lệch s x* s* x*(0) x*(1) x*(2) x*(3) x*(4) x*(5) - 0,356 0,403 0,399 0,397 0,396 - 98,44 98,334 98,337 98,338 98,339 99,151 99,139 99,134 99,131 99,13 98,763 98,737 98,735 98,735 98,734 98,734 0,473 0,237 0,234 0,233 0,233 0,233 98,795 98,737 98,735 98,735 98,734 98,734 0,237 0,268 0,266 0,264 0,264 0,264 Nhận xét: Sau lần thay đổi, giá trị s* không thay đổi (0,264), giá trị x* chọn 98,734% Từ kết trên, tính z – score Kết có ba giá trị 97,89%, 99,52% 100,07% có z tương ứng -3,2; 2,98 5,07 với > 2, loại bỏ ba giá trị Tính trung bình 15 kết lại, thu kết sau: Hàm lượng trung bình: Độ lệch s: 98,68% (n = 15) tiêu chí đánh giá chất chuẩn gốc xác định liệu hóa lý (điểm chảy, phổ UV-Vis, phổ IR, phổ MS phổ NMR), đánh giá tạp chất liên quan (HPLC DSC), định tính, định lượng, độ đồng lọ chuẩn xác định giá trị ấn định theo ISO Kết cho thấy chất chuẩn diogenin điều chế đạt tất tiêu chí đánh giá Đã tiến hành thẩm định chất chuẩn diosgenin ba phòng thí nghiệm độc lập đạt tiêu chuẩn ISO/GLP Kết thẩm định cho thấy chất chuẩn diosgenin thiết lập có chất lượng cao, đáng tin cậy, đạt yêu cầu TCCS chất chuẩn gốc (P) Điều quan trọng qua trình thực đề tài chúng tơi bước đầu xây dựng quy trình chung để thiết lập chất chuẩn có chất lượng cao, đáng tin cậy, tiến tới góp phần xây dựng hệ thống chất chuẩn quốc gia Chất chuẩn diosgenin thiết lập phân phối tồn quốc thơng qua Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO 0,233 Độ không đảm bảo đo µ: 0,078 Kết luận: Chất chuẩn diosgenin thiết lập lô Dios.Ref.012012 đạt tiêu chuẩn sở chất chuẩn gốc (P) với hàm lượng xác định 98,68% tính theo trạng (n = 15, s = 0,233, µ = 0,078) BÀN LUẬN – KẾT LUẬN Qua nghiên cứu, kiểm tra đánh giá chất lượng chất chuẩn diosgenin theo đầy đủ Chuyên Đề Dược Học Nghiên cứu Y học ISO 13528:2005 (2005), Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons, ISO ISO Guide 35 (2006), Reference materials - General and statistical principles for certification, ISO Trịnh Văn Đua (2009), Chiết xuất, phân lập diosgenin từ mía dò (Costus speciosus Smith., Costaceae) để làm chất đối chiếu, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh, Hồ Chí Minh, tr 13 Trịnh Văn Đua, Nguyễn Minh Đức (2009), “Chiết xuất, phân lập diosgenin từ mía dò (Costus speciosus Smith., Costaceae) để làm chất đối chiếu”, Y học TP Hồ Chí Minh, 13(1):92-95 Zheng CJ, Quin LP (2007), “Chemical components of C asiatica and their bioactivities”, Journal of Chinese Integrative Medicine, 5, (3):348 – 351 Ngày nhận báo: 12.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo: 24.12.2012 Ngày báo đăng: 10.03.2014 309 ... tài Thiết lập chất chuẩn diosgenin với nguyên liệu diosgenin tinh khiết điều chế từ Mía dò (3) nhằm góp phần thiết lập chất chuẩn từ dược liệu thông qua bước xây dựng quy trình chung thiết lập. .. thấy chất chuẩn diogenin điều chế đạt tất tiêu chí đánh giá Đã tiến hành thẩm định chất chuẩn diosgenin ba phòng thí nghiệm độc lập đạt tiêu chuẩn ISO/GLP Kết thẩm định cho thấy chất chuẩn diosgenin. .. thiết lập có chất lượng cao, đáng tin cậy, đạt yêu cầu TCCS chất chuẩn gốc (P) Điều quan trọng qua q trình thực đề tài chúng tơi bước đầu xây dựng quy trình chung để thiết lập chất chuẩn có chất