Ðề tài áp dụng kỹ thuật SSCP để phát hiện đột biến trên 3 trình tự của gene pbp2b ở các chủng S. pneumoniae kháng penicillin. Trước hết, chúng tôi xác định một số chỉ tiêu của kỹ thuật để đạt độ phân tích tốt nhất cho các trình tự đã nêu. Các chỉ tiêu này bao gồm: tác nhân biến tính, hàm lượng DNA, nồng độ gel polyacrylamide, phương pháp nhuộm). Sau đó áp dụng quy trình với các chỉ tiêu đã xác định được để phát hiện đột biến trên 20 chủng kháng penicillin so sánh với chủng nhạy. Kết quả cho thấy 18/20 chủng khảo sát có mang đột biến ít nhất trên 1 trong 3 trình tự. Hai chủng kháng còn lại không cho thấy có sự khác biệt với chủng nhạy, có thể do đột biến nằm ngoài khu vực khảo sát hoặc do độ nhạy của kỹ thuật.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 6* Số 2* 2002 Nghiên cứu Y học ÁP DỤNG KỸ THUẬT SSCP (SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM) ĐỂ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN TRÊN GEN PBP2B Ở CÁC CHỦNG STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KHÁNG PENICILLIN Đỗ Thanh Ngân1, Hồ Huỳnh Thùy Dương 2, Võ Thò Chi Mai3 TÓM TẮT Streptococcus pneumoniae kháng penicillin vấn đề lớn, mang tính toàn cầu lónh vực sức khỏe người Cơ chế kháng chủ yếu dựa biến đổi cấu trúc PBP (Penicillin Binding Protein) mà quan trọng PBP1A, 2B, 2X mã hóa gene pbp tương ứng Kỹ thuật SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism – Tính đa hình cấu hình mạch đơn nucleic acid) kỹ thuật thông dụng cho phép phát tồn đột biến điểm trình tự nucleic acid so sánh với trình tự chuẩn (không mang đột biến) Đề tài áp dụng kỹ thuật SSCP để phát đột biến trình tự gene pbp2b chủng S pneumoniae kháng penicillin Trước hết, xác đònh số tiêu kỹ thuật để đạt độ phân tích tốt cho trình tự nêu Các tiêu bao gồm: tác nhân biến tính, hàm lượng DNA, nồng độ gel polyacrylamide, phương pháp nhuộm) Sau áp dụng quy trình với tiêu xác đònh để phát đột biến 20 chủng kháng penicillin so sánh với chủng nhạy Kết cho thấy 18/20 chủng khảo sát có mang đột biến trình tự Hai chủng kháng lại không cho thấy có khác biệt với chủng nhạy, đột biến nằm khu vực khảo sát độ nhạy kỹ thuật SUMMARY USING SSCP (SINGLE S TRAND CONFORMATION POLYMORPHISM) TECHNIQUE FOR DETECTION OF MUTATION OF PENICILLIN-RESISTANT STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE PBP2B GENE Đỗ Thanh Ngân, Hồ Huỳnh Thùy Dương, Võ Thò Chi Mai * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol - No - 2002: 70 - 73 The spread of penicillin resistant strains of Streptococcus pneumoniae is an important worldwide health problem Resistance is essentially based on the modification of PBPs (Penicillin Binding Proteins), particularly PBP1A, 2B and 2X, encoded by corresponding pbp genes SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) electrophoresis analysis is one of well-known techniques used to detect point mutations in DNA fragments We used SSCP analysis for the detection of point mutations in amplified fragments from pbp2b gene of resistant S pneumoniae strains Firstly, we determined some technical conditions of the SSCP protocol, including denaturation agents, DNA quantity, polyacrylamide gel concentration and staining procedure, to optimize the analysis of investigated fragments The protocol set up is used to detect point mutations in 20 penicillin-resistant strains in comparison with the sensitive one Results obtained showed the probable presence of point mutations in at least of the fragments of 18/20 strains studied The remaining resistant strains showed Cử nhân Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên Tiến só, môn Vi sinh-Sinh học Phân tử, Đại học Khoa học Tự nhiên Tiến só, môn Vi sinh Khoa Y, khoa Vi sinh bệnh viện Chợ Rẫy no difference in the electrophoretic pattern in comparison with the sensitive one, possibly due to the sensitivity of SSCP technique or to the absence of mutations in investigated region of pbp2b 70 Nghiên cứu Y học MỞ ĐẦU Sự phát triển lan truyền Streptococcus pneumoniae kháng penicillin vấn đề quan trọng lónh vực chăm sóc sức khỏe giới Tại Việt Nam, năm 1999, theo số liệu chương trình Giám sát quốc gia tính kháng thuốc số vi khuẩn thường gặp, có 13,7% chủng S pneumoniae xác đònh kháng penicillin (trên 153 chủng khảo sát) Tỷ lệ số đáng báo động(4) Tình hình kháng thuốc số vi khuẩn người khỏe mạnh cộng đồng năm 1999 (tại ba đòa điểm ngoại thành thành phố Hà Nội, Huế TP Hồ Chí Minh) cho thấy tỉ lệ mang vi khuẩn S pneumoniae có độc lực người khỏe mạnh 40,1% Hà Nội, 16,7% Huế 30,9% Tp Hồ Chí Minh Mức độ nhạy cảm với penicillin 153 chủng S pneumoniae trẻ khỏe mạnh giảm 19,6% tính chung cho ba đòa phương này(4) Nguyên nhân kháng penicillin S pneumoniae thay đổi PBP (penicillin binding protein – phức hợp enzym acyl serine transferase xúc tác tạo cầu peptide hình thành thành tế bào)(3) Ở chủng S pneumoniae kháng penicillin, PBP 1A, 2A, 2B 2X PBP có khả thay đổi giảm lực với penicillin Trong đó, thay đổi PBP 2B có vai trò quan trọng Hơn nữa, gene pbp2b mã hóa cho PBP 2B có tần số đột biến cao đột biến xảy gene pbp2b đa dạng(1,2,3) Trong phương pháp phát tồn đột biến trình tự DNA nhö: DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), CCM (Chemical Cleavage Method), EMC (Enzyme Mismatch Cleavage), kỹ thuật SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) kỹ thuật thông dụng Kỹ thuật cho phép phân tích tính đa hình cấu hình sợi đơn nucleic) Đây phương pháp đơn giản để xác đònh đột biến điểm trình tự DNA so sánh với trình tự DNA biết Nguyên tắc kỹ thuật điều kiện điện di không biến tính, mạch đơn DNA có cấu hình đònh tùy Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 6* Số 2* 2002 theo trình tự Cấu hình xác đònh liên kết nội phân tử Các cấu hình khác khác biệt nucleotide Sự khác biệt dẫn đến khác biệt khả di chuyển gel polyacrylamide, Chúng khảo sát điều kiện phân tách tối ưu cho kỹ thuật SSCP sử dụng quy trình với điều kiện xác đònh để phân tích sai khác trình tự ba đoạn DNA nhân từ gene pbp2b S pneumoniae VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP Sản phẩm DNA khảo sát sản phẩm PCR ba đoạn trình tự gen pbp2b 20 chủng Streptococcus pneumoniae kháng penicillin chủng ATCC 49619 Đoạn trình tự khảo sát (pbp 2B1) (pbp 2B2) (pbp 2B3) Kích thước(nucleotide) 331 130 242 Vò trí gen pbp2b 346 – 676 657 – 786 787 – 1028 DNA biến tính nhiệt (đun sôi 10 phút, làm lạnh đột ngột nước đá tan), formamide, NaOH 500mM Các sản phẩm biến tính phân tích gel polyacrylamide 8% Điện di 16 hiệu điện 100V Phát sản phẩm gel sau điện di cách nhuộm với dung dòch bạc 25% ethidium bromide KẾT QUẢ – BÀN LUẬN Chúng thiết kế ba cặp mồi để nhân ba trình tự DNA từ gene pbp2b với kích thước 331bp, 130bp, 242bp Các trình tự DNA có kích thước khoảng 300 bp xem phù hợp cho phương pháp phân tích SSCP Kết khảo sát điều kiện kỹ thuật SSCP Trước tiên, so sánh ba tác nhân biến tính: nhiệt (nước đun sôi), formamide NaOH Kết cho thấy phương pháp biến tính nhiệt cho kết tốt Điều thể qua cường độ mức độ phân tách vạch tương ứng với mạch đơn DNA 71 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 6* Số 2* 2002 Nghiên cứu Y học Khi khảo sát hai phương pháp phát DNA gel sau điện di: nhuộm ethidium bromide nhuộm bạc Kết cho thấy phương pháp nhuộm bạc có độ nhạy cao Trình tự pbp 2B2 Kết khảo sát hàm lượng mẫu DNA sử dụng cho điện di SSCP cho thấy: hàm lượng 2880ng thích hợp cho việc phát phương pháp nhuộm bạc Do đó, sử dụng nồng độ DNA cho khảo sát sau Trình tự pbp 2B3 Chỉ tiêu cuối khảo sát tiû lệ bisacrylamide : acrylamide dùng để tạo gel Kết khảo sát tỉ lệ 1: 39, 1: 59, 1: 79, 1: 99, 1: 149 gel cho thấy tiû lệ 1: 39 cho kết phân tách hai mạch đơn DNA tốt trình tự DNA nghiên cứu Kết khảo sát trình tự DNA gene pbp2b từ 20 chủng S pneumoniae kháng penicillin chủng nhạy Chúng sử dụng quy trình SSCP với điều kiện chọn để phát đột biến điểm ba trình tự DNA thuộc gen pbp2b 21 chủng S pneumoniae gồm chủng nhạy 20 chủng kháng Trong phương pháp SSCP, người ta phát đột biến điểm trình tự DNA chưa biết so sánh dạng điện di trình tự (dưới dạng mạch đơn) với trình tự chứng biết Trong khảo sát chúng tôi, trình tự chứng nhân từ gen pbp2b chủng S pneumoniae nhạy với penicillin (ATCC 49619) Sau bảng tổng kết kết điện di SSCP trình tự khảo sát: Trình tự DNA Nhóm đồng dạng kết điện di SSCP - nhóm 1: Chủng ATCC, chủng kháng 25, 26, 27, 28, 29, 33, 34 - Nhóm 2: Chủng kháng 17, 19, 21, 32 Trình tự - Nhóm 3: Chủng kháng 15, 18, 22, 23, 24 pbp 2B1 - nhóm 4: Chủng kháng 16 - nhóm 5: Chủng kháng 20 - nhóm 6: Chủng kháng 30 - nhóm 7: Chủng kháng 31 - nhóm 1: Chủng ATCC, chủng kháng 15, 22, 23, 24, 26, 29, 32, 33, 34 - nhoùm 2: Chủng kháng 16, 17, 18, 19, 20, 21 - nhóm 3: Chủng kháng 25, 27, 28, 31 - nhóm 4: Chủng kháng 30 - nhóm 1: Chủng ATCC, chủng khaùng 15, 18, 20, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 33, 34 - nhóm 2: Chủng kháng 16, 17, 19, 21 - nhóm 3: Chủng kháng 26, 29, 31 - nhóm 4: Chủng kháng 30 - nhóm 5: Chủng kháng 32 Một số công trình nghiên cứu cho thấy nhiều đột biến gen pbp2b có ảnh hưởng lớn đến tính kháng penicillin Streptococcus pneumoniae Mức độ kháng penicillin 20 chủng S pneumoniae kháng penicillin mà khảo sát có MIC penicillin > 4g/ml Nồng độ tương ứng với mức độ kháng cao Kết điện di SSCP phù hợp với kết trên: có 18/20 chủng kháng có dạng điện di khác với chủng nhạy ATCC, nghóa có khả mang sai khác trình tự nucleotide so với chủng nhạy Hai chủng kháng lại (33, 34) có dạng SSCP giống hệt chủng nhạy Có thể đột biến dẫn đến tính kháng penicillin hai chủng xảy bên khu vực trình tự khảo sát Ngoài ra, độ nhạy phương pháp SSCP không cho phép phát 70-80% số đột biến tồn Kết điện di SSCP cho thấy 18/20 chủng khảo sát có mang đột biến ba trình tự 1, 2, gen pbp2b Cả ba trình tự nằm vùng tương ứng với vùng mã hóa cho hoạt tính transpeptidase (TER: transpeptidase encoding region) gen pbp2b vùng có biến động lớn mặt di truyền(1,2,4) Theo số công trình nghiên cứu, thay đổi gen pbp2b quan trọng chủ yếu tập trung khu vực Như vậy, kết nhận phù hợp với nhận đònh Do vùng gen khảo sát đề tài chiếm 1/3 vùng TER nên có khả chủng kháng 33, 34 có mang đột biến nằm khu vực khảo sát nói Như vậy, quy trình SSCP hình thành cho 72 Nghiên cứu Y học phép phát sai khác trình tự nucleotide nằm gen pbp2b Các sai khác có liên quan đến tính kháng penicillin S pneumoniae KẾT LUẬN Quy trình SSCP với điều kiện xác đònh bao gồm: biến tính DNA nhiệt, phát sau điện di phương pháp nhuộm bạc, hàm lượng DNA sử dụng 2880ng, tỉ lệ bisacrylamide : acrylamide gel 8% : 39 Sử dụng quy trình để phát tồn đột biến điểm trình tự DNA nhân từ gene pbp2b 20 chủng S pneumoniae kháng penicillin 01 chủng nhạy ATCC49619, nhận thấy có 18/20 chủng kháng có Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 6* Số 2* 2002 mang sai khác ba trình tự khảo sát TÀI LIỆU THAM KHẢO ANTHONY M SMITH & KEITH P KLUGMAN 1995 Alteration in penicillin binding protein 2B from penicillinresistant wild-type strains of Streptococcus pneumoniae Antimicrobial agents and chemotherapy 39: 859-867 KIMIKO UBUKATA, YASUKO ASAHI, AKIO YAMANE & MASATOSHI KONNO 1996 Combination detection of autolysin and penicillin binding protein 2B gene of Streptococcus pneumoniae by PCR Journal of clinical microbiology 34: 592-596 LAWRENCE E BRYAN, ALLAN J GODFREY 1991 lactam antibiotics: Mode of action and bacterial resistance Antibiotics in Laboratory medicine William & Wilking 3th ed: 599-620 LÊ ĐẶNG HÀ, LÊ HUY CHÍNH, LÊ VĂN PHỦNG, PHẠM VĂN CA Một số kết chương trình giám sát quốc giavề tính kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh thường gặp năm 1999 NXB Y học Tháng 4/2201 Soá 73 ... tự DNA gene pbp2b từ 20 chủng S pneumoniae kháng penicillin chủng nhạy Chúng sử dụng quy trình SSCP với điều kiện chọn để phát đột biến điểm ba trình tự DNA thuộc gen pbp2b 21 chủng S pneumoniae. .. Cleavage), kỹ thuật SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) kỹ thuật thông dụng Kỹ thuật cho phép phân tích tính đa hình cấu hình sợi đơn nucleic) Đây phương pháp đơn giản để xác đònh đột biến. .. thấy nhiều đột biến gen pbp2b có ảnh hưởng lớn đến tính kháng penicillin Streptococcus pneumoniae Mức độ kháng penicillin 20 chủng S pneumoniae kháng penicillin mà khảo sát có MIC penicillin