Paclitaxel (PTX) là hoạt chất phân lập từ vỏ cây thông đỏ. PTX chỉ được dùng dạng tiêm truyền do không hấp thu qua hệ tiêu hoá. Tuy nhiên độ tan của PTX rất kém. Do vậy, nghiên cứu này nhằm cải thiện độ tan PTX bằng phương pháp tạo phức chất với hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD).
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN ĐỘ TAN CỦA PACLITAXEL BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẠO PHỨC VỚI HYDROXYPROPYL-β-CYCLODEXTRIN Nguyễn Thanh Hà*, Lê Minh Trí**, Nguyễn Thiện Hải**, Lương Khánh Duy**, Lê Nguyễn Nguyệt Minh** TÓM TẮT Mục tiêu: Paclitaxel (PTX) hoạt chất phân lập từ vỏ thông đỏ (Taxus brevifolia), chất có tác dụng hiệu sử dụng điều trị ung thư buồng trứng, phổi, vú não lâm sàng PTX dùng dạng tiêm truyền không hấp thu qua hệ tiêu hoá Tuy nhiên độ tan PTX Do vậy, nghiên cứu nhằm cải thiện độ tan PTX phương pháp tạo phức chất với hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD) Phương pháp: điều chế dung dịch chứa PTX đậm đặc phương pháp tạo phức chất hoà tan với hydroxypropyl-β-cyclodextrin (chế phẩm nghiên cứu NC-10) Khảo sát tính ổn định chế phẩm hàm lượng PTX 27 sau pha loãng với dung dịch NaCl 0,9% Kết quả: HPβCD có tác dụng tăng độ hồ tan PTX Tỉ lệ mol PTX: HPβCD để tạo phức nghiên cứu 1:360 Dung dịch đậm đặc thêm polysorbat 80 (6%) vào để tăng tính ổn định phức chất sau pha loãng dung dịch NaCl 0,9% Dung dịch chứa PTX 0,6 mg/ml sau pha dung dịch NaCl 0,9% ổn định 27 Kết tương đương với chế phẩm đối chiếu Intaxel® Hàm lượng PTX xác định phương pháp HPLC, cột Pentafluorophenyl-propyl detector PDA, phát bước sóng 227 nm, pha động hỗn hợp acetonitril:nước Phương pháp phân tích kiểm nghiệm đáp ứng yêu cầu quy trình phân tích định lượng chế phẩm theo ICH Kết luận: dung dịch pha loãng từ dung dịch đậm đặc ban đầu có khả trì nồng độ PTX giới hạn trị liệu cho phép 27 Bên cạnh việc khảo sát khả hòa tan sau loại dung mơi cho thấy triển vọng áp dụng dạng bào chế đông khô cho chế phẩm Từ khoá: paclitaxel, HPLC, hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD), Intaxel(R), NC-10 ABSTRACT AMELIORATE THE SOLUBILITY OF PACLITAXEL BY FORMING THE COMPLEX WITH HYDROXYPROPYL-β-CYCLODEXTRINE Nguyen Thanh Ha, Le Minh Tri, Nguyen Thien Hai, Luong Khanh Duy, Le Nguyen Nguyet Minh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No - 2014: 359 - 367 Objectives: Paclitaxel (PTX), isolated from the bark of the Pacific yew tree (Taxus brevifolia), is one of the most effective antitumor agents used in clinical trials for ovarian, breast, lung and cervical cancers Paclitaxel is only used in infusion because it is not absorb in gastrointestinal system However, the aqueous solubility of paclitaxel is very low This study was to make a solution containing paclitaxel by forming the complex with hydroxypropyl-β-cyclodextrin Methods: this study was to make a concentrated solution containing paclitaxel by forming an inclusion complex with hydroxypropyl-β-cyclodextrine (sample NC-10) Study on stability of sample and PTX’s content in * Viện kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh ** Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS TS Lê Minh Trí ĐT: 0903718190 Chuyên Đề Dược Học Email: leminhtri1099@gmail.com 359 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 27 hours after dilute in solution of NaCl 0.9% Results: HPβCD had increased the water-solubility of paclitaxel The molar ratio of paclitaxel to HPβCD was found to be 1:360 to form the complex Polysorbate 80 (6%) was added to the concentrated solution showed the stabilization of the complex after diluted in solution of NaCl 0.9% Approximately 0.6 mg/ml paclitaxel could be maintained after diluted in solution of NaCl 0.9% for 27 hours This result was also the same with referent product - Intaxel® Paclitaxel was determined by HPLC, using Pentafluorophenyl-propyl column and detector PDA, wavelength of detector at 227 nm Mobile phase was acetonitrile and water This method was met all the requirements of a pharmaceutical analytical procedure Conclusion: dilute solution from initial concentrate solution is able to keep concentration of paclitaxel adapte for therapy in 27 hours After eliminate the solvent, the solution is stable and able to prepare the infusion lyophilisate paclitaxel in the future Key words: paclitaxel (PTX), HPLC, hydroxypropyl-β-cyclodextrine (HPβCD), Intaxel(R) ĐẶT VẤN ĐỀ Paclitaxel (PTX), hoạt chất phân lập từ vỏ thông đỏ Taxus brevifolia, chứng minh mang lại hiệu cao trị liệu ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư phổi ung thư cổ tử cung PTX không hấp thu qua đường tiêu hoá nên sử dụng đường tiêm truyền tĩnh mạch Tuy nhiên, PTX có độ tan hầu hết dung môi pha tiêm nên nghiên cứu tâp trung cải thiện độ tan PTX Các kết nghiên cứu cho thấy việc tạo phức bao PTX với dẫn chất β-cyclodextrin có nhiều triển vọng có khả ứng dụng vào sản xuất Từ nhu cầu thực tiễn tạo chế phẩm chứa PTX an toàn hiệu cao trị liệu, kết hợp với xu hướng ứng dụng cyclodextrin dẫn chất vào việc cải thiện độ tan khả hấp thu, đề tài tiến hành nhằm điều chế dung dịch đậm đặc chứa PTX dùng pha tiêm truyền ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Đối tượng Nghiên cứu xây dựng cơng thức quy trình bào chế dung dịch đậm đặc chứa paclitaxel sử dụng hydroxypropyl-β-cyclodextrin tạo phức trợ tan Dung dịch sau pha lỗng phải trì nồng độ PTX khoảng 0,3 mg/ml-1,2 mg/ml thời gian định đạt yêu cầu trị liệu (chế phẩm NC-10) 360 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng paclitaxel chế phẩm sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC với đầu dò PDA Nguyên liệu PTX đạt tiêu chuẩn Dược điển USP 34 (Cty Jingi Wen, lô 20090312, Trung Quốc); 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin ® (Kleptose ) theo tiêu chuẩn nhà sản xuất Roquette Pharma Chế phẩm đối chiếu Intaxel® nhà sản xuất Fresenius Kabi Oncology Ltd Ấn Độ, số lô 881AY003, số đăng ký VN-2405-06, ngày sản xuất – hạn dùng: 06/07/13 Phương pháp nghiên cứu Thẩm định quy trình định lượng PTX sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò PDA Khảo sát điều kiện phân tích PTX định lượng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò UV PDA Tham khảo chuyên luận thuốc tiêm PTX Dược điển Hoa Kỳ USP 34(7) số tài liệu(2,6,5,4), rút thông số sắc ký pha tĩnh, nhiệt độ cột, thành phần pha động, tốc độ dòng, bước sóng phát để xây dựng quy trình định lượng PTX chế phẩm đạt yêu cầu quy trình phân tích Chuẩn bị mẫu Dung dịch mẫu thử: dung dịch PTX đậm đặc pha lỗng đến nồng độ trị liệu thích hợp dung môi pha tiêm NaCl 0,9% Dung dịch Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học thu được lọc qua màng 0,45 µm đem định lượng khoảng 12 mg hòa tan ethanol (với Dung dịch chuẩn: hòa tan hồn tồn PTX chuẩn hỗn hợp theo thể tích nước : acetonitril (50:50) để thu dung dịch có nồng độ PTX dung dịch thử Dung dịch lọc qua màng 0,45 µm trước định lượng HPβCD) Một lượng HPβCD tương ứng với Thẩm định quy trình phân tích Hai dung dịch phối hợp vào khuấy trộn thời gian Dung dịch thu được pha lỗng dung mơi pha tiêm NaCl 0,9 % để thu thể tích 20 ml, tương ứng với nồng độ PTX 0,6 mg/ml Quy trình định lượng PTX chế phẩm thẩm định theo tiêu chuẩn hướng dẫn Hiệp ước hòa hợp quốc tế yêu cầu kỹ thuật châu Âu, Nhật Hoa Kỳ - gọi tắt ICH Harmonised tripartite guideline Các yếu tố cần thẩm định tính đặc hiệu, tính phù hợp hệ thống, tính tuyết tính, độ độ xác quy trình định lượng Khảo sát tính chất chế phẩm đối chiếu Thu thập mẫu đối chiếu Khảo sát tính chất lý hố, độ pha lỗng, tính ổn định sau pha loãng Định lượng PTX dung dịch pha loãng theo quy trình thẩm định Nghiên cứu xây dựng cơng thức quy trình điều chế dung dịch đậm đặc chứa PTX dựa tạo phức với HPβCD Do PTX tan nước nên phương pháp tạo phức môi trường dung môi hữu nước sử dụng Dung môi hữu lựa chọn ethanol khan PTX tan tốt ethanol khan (đạt nồng độ tối đa 46 mM/ml)(3) ethanol có liên kết yếu với khoang HPβCD, dễ thay hoạt chất Khảo sát ảnh hưởng HPβCD lên khả cải thiện độ tan PTX Tiến hành khảo sát với tỉ lệ mol HPβCD : PTX 1, 2, 3, 100, 200, 300, 360 400 dung môi nước ethanol theo tỉ lệ thể tích : 1, đánh giá lượng PTX hồ tan thông qua cảm quan (độ trong), chọn lựa tỉ lệ thích hợp tiến hành xác định hàm lượng PTX từ rút tỷ lệ có khả tốt Chuẩn bị mẫu : PTX cân xác Chuyên Đề Dược Học lượng thể tích 1/3 lượng nước dùng hòa tan tỉ lệ mol HPβCD : PTX hòa tan từ từ vào hỗn hợp nước (theo tỉ lệ ml nước cho g HPβCD) 2/3 lượng ethanol lại đến thu dung dịch suốt Khảo sát ảnh hưởng chất trợ tan Dựa số tài liệu(1,2), để ổn định phức tạo thành theo thời gian đạt yêu cầu trị liệu, số polymer sử dụng Polyoxyethylensorbitan 20-monooleat (Polysorbat-80), Hydroxypropyl Methylcellulose (HPMC) Polyvinylpyrrolidon K30 (PVP K30) Polysorbat 80 lựa chọn phương pháp nghiên cứu Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cho phép sử dụng dung dịch pha tiêm Theo FDA, nồng độ Polysorbat 80 sử dụng dịch truyền cho phép nồng độ tối đa 8% theo thể tích Khảo sát ảnh hưởng chất trợ tan tính chất cảm quan chế phẩm Công thức lựa chọn (tương ứng tỉ lệ HPβCD : PTX tiềm năng) khảo sát độ ổn định có mặt polysorbat 80 từ nồng độ 1% đến 8% Tiến hành : Phức tạo thành Dung dịch phức cho thêm vào polysorbat 80 pha lỗng dung mơi pha tiêm NaCl 0,9% theo bảng Bảng Tỉ lệ pha loãng sử dụng polysorbat 80 làm chất ổn định Nồng độ 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8% Polysorbat 80 Dung dịch phức Tương ứng với 10 mg PTX Polysorbat 80 (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,2 1,4 1,6 Dung dịch NaCl Vừa đủ 20 ml 0,9% 361 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học Dung dịch sau pha loãng đánh giá độ trong thời điểm sau pha loãng, 24 48 sau pha lỗng Tiêu chí lựa chọn cơng thức dung dịch phải đến thời điểm quan sát 48 Khảo sát ảnh hưởng chất trợ tan nồng độ chế phẩm Từ phần (a) rút nồng độ polysorbat 80 có khả trì dung dịch Các mẫu đạt tiêu chí cảm quan từ phần (a) định lượng hàm lượng PTX thời điểm sau pha, 24 48 sau pha Tiến hành: Chuẩn bị mẫu thu dung dịch PTX 0,6 mg/ml Các mẫu lọc qua màng 0,45 µm tiến hành định lượng PTX phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Tiêu chí lựa chọn: Mẫu xem đạt tiêu chí nồng độ PTX hàm lượng PTX trì 90% thời gian 24 so với nồng độ pha loãng lúc đầu Khảo sát số nồng độ pha loãng khác dãy nồng độ trị liệu Theo hướng dẫn sử dụng chế phẩm gốc Intaxel®, PTX phải đạt nồng độ trị liệu từ 0,3 mg/ml đến 1,2 mg/ml Công thức lựa chọn đánh giá khả pha loãng nồng độ PTX 0,3 mg/ml, 0,6 mg/ml 1,2 mg/ml Tiến hành: Dung dịch đậm đặc chuẩn bị trên, sau pha lỗng dung dịch NaCl 0,9% nồng độ 0,3 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,9 mg/ml 1,2 mg/ml Tỉ lệ pha loãng thể bảng Bảng Tỉ lệ pha loãng đạt nồng độ trị liệu khảo sát Nồng độ PTX (mg/ml) Dung dịch đậm đặc ứng với lượng mg PTX NaCl 0,9% vừa đủ 0,3 0,6 0,9 1,2 12 18 24 20 ml Dung dịch đạt pha loãng trì độ trong 12 Khảo sát độ ổn định hàm lượng 24 Công thức đánh giá hàm lượng PTX, đo pH thời điểm sau pha theo dõi hàm lượng thời gian 24 Mục tiêu đánh giá để xác định độ ổn định khả trì hàm lượng PTX đáp ứng trị liệu dung dịch pha loãng Tiến hành: Mẫu chuẩn bị tương ứng với tỉ lệ mol PTX : HPβCD : 360 Dung dịch pha loãng nồng độ rút bảng Mỗi nồng độ pha mẫu Dung dịch thu được lọc qua màng 0,45 µm Mẫu định lượng PTX thời điểm sau pha, giờ, giờ, 12 giờ, 16 24 phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Tiêu chí lựa chọn: dung dịch phải có nồng độ PTX sau 24 đạt 90% so với lúc đầu Đánh giá ảnh hưởng ethanol lên độ tan phức PTX với HPβCD Do dung dịch tạo phức sử dụng lượng HPβCD lớn, cần dùng lượng nước hòa tan lớn nên dung dịch đậm đặc ban đầu tích lớn Ngồi lượng ethanol từ giai đoạn tạo phức ảnh hưởng đến độ tan phức tạo thành Để đánh giá ảnh hưởng ethanol lên phức tạo thành đánh giá khả áp dụng dạng bào chế đông khô cho chế phẩm, dung dịch phức sau khuấy trộn loại dung môi trước pha lỗng dung mơi pha tiêm NaCl 0,9% Tiến hành khảo sát với số mẫu nồng độ pha loãng Tiến hành: Dung dịch phức tạo trên, sau loại dung mơi phương pháp sấy áp suất giảm sử dụng tủ sấy chân khơng Nhiệt độ sấy trì mức 45 oC để tránh phá cấu trúc phức Cắn thu được hòa tan dung mơi pha tiêm NaCl 0,9% Dung dịch sau pha loãng đánh giá cảm quan lọc qua màng 0,45 µm tiến hành sắc ký xác định nồng độ PTX So sánh với chế phẩm đối chiếu Tiến hành lặp lại công thức lựa chọn với 362 Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 lượng pha chế lớn so sánh tiêu độ trong, nồng độ PTX với chế phẩm đối chiếu Nhận xét đánh giá công thức lựa chọn Nghiên cứu xây dựng quy trình bào chế dung dịch đậm đặc PTX dùng pha tiêm Dựa vào tính chất lý hóa cơng thức lựa chọn, tiến hành xây dựng quy trình bào chế quy mơ sản xuất nhỏ dung dịch đậm đặc chứa PTX KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Thẩm định quy trình định lượng PTX sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò PDA Khảo sát điều kiện phân tích PTX định lượng phương pháp Nghiên cứu Y học HPLC sử dụng đầu dò PDA bước sóng phát 227 nm, cột sắc ký pha đảo Pentaflurophenyl-propyl (250 mm x mm, µm), pha động hỗn hợp nước:acetonitril chạy theo chương trình gradient, tốc độ dòng 1,2 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl nhiệt độ cột 25 oC Bảng Chương trình gradient pha động Thời gian (phút) Tỉ lệ acetonitrile (%) 0→13 45 13→20 45→65 20→23 65 23→30 65→45 Tỉ lệ nước (%) 55 55→35 45 35→55 Đánh giá quy trình phân tích Quy trình phân tích thẩm định đạt u cầu quy trình phân tích Kết thẩm định dược trình bày bảng Bảng Kết thẩm định quy trình định lượng PTX HPLC Tiêu chí thẩm định Tính đặc hiệu Tính phù hợp hệ thống Tính tuyến tính Độ Độ xác Yêu cầu Kết Đúng Trên sắc ký đồ, mẫu chuẩn mẫu thử phải có đỉnh PTX thời gian lưu Mẫu trắng khơng có đỉnh PTX Các thông số sắc ký mẫu chuẩn mẫu thử sau Đạt lần tiêm mẫu có RSD ≤ 2% Hệ số bất đối 0,8-1,5 Sự tương quan diện tích đỉnh nồng độ PTX Phương trình hồi qui tuyến tính phân tích (dùng cơng cụ Regression MS y = 5941192x + 85098 (R = 0,9999) Excel để kiểm tra) Đánh giá hệ số tương quan r Kết luận có tương quan nồng độ Mức độ tương quan tốt |r| > 0,9 độ hấp thu PTX khoảng tuyến tính 0,1 – 1,3 mg/ml Tỉ lệ phục hồi 98%-102% Đạt (100,57%) RSD mẫu thử nhỏ 2% Đạt (RSD% = 1,512%) Khảo sát tính chất chế phẩm đối chiếu loãng, đạt yêu cầu trị liệu Chế phẩm đối chiếu Intaxel® pha lỗng dịch pha tiêm đến nồng độ trị liệu 0,3 – 1,2 mg/ml Kết nồng độ PTX trì sau pha loãng theo thời gian thể qua bảng Nghiên cứu xây dựng cơng thức quy trình điều chế dung dịch đậm đặc chứa PTX dựa tạo phức với HPβCD Bảng Nồng độ khảo sát theo thời gian Intaxel® Nồng độ PTX (mg/ml) 0,3 0,6 1,2 100% 100% 100% Thời gian định lượng 27 48 99,60% 98,86% 98,87% 98,14% 98,12% 98,08% 72 98,13% 97,30% 98,03% Nhận xét: cảm quan chế phẩm Intaxel® sau pha lỗng dung dịch trì đến 72 giờ, nồng độ PTX trì 90% sau 72 pha Chuyên Đề Dược Học Khảo sát ảnh hưởng HPβCD lên khả cải thiện độ tan PTX Kết khảo sát trình bày bảng Với lượng HPβCD thấp (tỉ lệ mol PTX : HPβCD từ : đến : 300) dung dịch sau pha lỗng tủa Với tỉ lệ PTX : HPβCD : 360 : 400, dịch pha loãng thời điểm lúc đầu trong, chứng tỏ lượng HPβCD sử dụng đủ để tạo phức bao với PTX Tuy nhiên quan sát thêm giờ, dung dịch tủa chứng tỏ 363 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 phức tạo thành không ổn định cần phải sử dụng thêm tá dược để ổn định phức Tỉ lệ PTX: HPβCD phù hợp : 360 (kl/kl) Bảng Tính chất cảm quan mẫu sau pha loãng Tỉ lệ PTX : HPβCD 1:1 1:2 1:3 : 100 : 200 : 300 : 360 : 400 Quan sát dịch Quan sát dịch pha loãng đậm đặc giờ + + + + + + + + + + - * Với (+) biểu thị dung dịch trong, (-) biểu thị dung dịch có tủa Khảo sát ảnh hưởng chất trợ tan polysorbat80 Trên tính chất cảm quan Kết khảo sát trình bày bảng Dung dịch pha loãng quan sát thời điểm trong, chứng tỏ polysorbat 80 từ 1% đến 8% có tác động giúp ổn định phức Thời gian trì độ ổn định phức tỉ lệ thuận với nồng độ polysorbat 80 sử dụng Cụ thể để trì độ đến 24 sau, polysorbat 80 tối thiểu phải 5% Để trì độ đến 48 sau, polysorbat 80 phải 8% Tại nồng độ polysorbat 80 6% 7% sau 48 có xuất tủa nhẹ Bảng Kết đánh giá cảm quan dung dịch pha loãng Thời gian quan sát 24 48 Nồng độ polysorbat 80 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8% + + + + + + + + ↓ ↓ ↓ ↓ + + + + ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ + Với (+) biểu thị dung dịch trong, (-) biểu thị dung dịch tủa nhẹ, (↓) biểu thị dung dịch tủa nhiều Trên nồng độ paclitaxel Kết khảo sát nồng độ PTX trình bày bảng Tại thời điểm 24 giờ, với lượng polysorbat 80 từ đến 8%, PTX trì hàm 364 lượng 90%, đạt yêu cầu hàm lượng Tuy nhiên để trì hàm lượng 90% sau 48 giờ, nồng độ polysorbat 80 phải từ 6% trở lên Kết khảo sát ảnh hưởng polysorbat 80 tính cảm quan nồng độ có tương đồng với Tại nồng độ polysorbat 80 5%, dung dịch sau 48 tủa nhiều hàm lượng không trì (còn lại 79,47% so với lúc đầu) Tại nồng độ polysorbat 80 6%, dung dịch sau 48 tủa nhẹ hàm lượng đạt yêu cầu (còn lại 90,17%) Kết luận nồng độ polysorbat 80 thích hợp 6% để dịch pha loãng đạt yêu cầu trị liệu sau gần 48 Bảng Kết định lượng PTX với nồng độ polysorbat 80 từ đến 8% Thời gian 5% (giờ) C% %PTX 0,599 100 24 0,552 92,15 48 0,476 79,47 Nồng độ Polysorbat 80 6% 7% C% %PTX C% %PTX 0,600 100 0,603 100 0,568 94,66 0,577 95,69 0,547 90,17 0,558 92,53 8% C% %PTX 0,605 100 0,571 94,38 0,567 93,72 Với C% nồng độ PTX (mg/ml), %PTX hàm lượng PTX tính theo thời gian Khảo sát số nồng độ pha loãng khác dãy nồng độ trị liệu Với nồng độ 1,2 mg/ml ; thể tích pha lỗng cuối 10 ml (ứng với lượng PTX 12 mg) khơng đủ để hòa tan 7,1 g HPβCD Kết đánh giá cảm quan mẫu trình bày bảng Bảng Kết đánh giá cảm quan với polysorbat 80 6% Thời gian quan sát 24 48 0,3 + + + Nồng độ pha lỗng (mg/ml) 0,6 0,9 1,2 + ↓ Khơng khảo + ↓ sát ↓ Với (+) biểu thị dung dịch trong, (-) biểu thị dung dịch tủa nhẹ, (↓) biểu thị dung dịch tủa nhiều Nhận xét : dung dịch đậm đặc pha lỗng đạt nồng độ PTX từ 0,3 mg/ml đến 0,6 mg/ml Khi pha loãng đến nồng độ PTX 0,3 mg/ml, polysorbat 80 bị pha loãng đến 3% Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 giúp ổn định phức Điều cho thấy với nồng độ PTX thấp, nồng độ polysorbat 80 cần để trì phức ổn định thấp Tại nồng độ PTX 0,9 mg/ml 1,2 mg/ml, dung dịch sau pha lỗng tủa khơng đạt yêu cầu cảm quan Khảo sát độ ổn định hàm lượng 24 Về mặt cảm quan, mẫu cuối thời điểm quan sát (24 giờ) Kết khảo sát nồng độ trình bày bảng 10 hình Bảng 10 Kết khảo sát hàm lượng thời gian 24 giờ C%PTX 0,301 % PTX 100 C%PTX 0,590 % PTX 100 % PTX Nồng độ 0,3 mg/ml giờ 12 16 0,298 0,300 0,299 0,298 99,00 99,67 99,34 99,00 Nồng độ 0,6 mg/ml giờ 12 16 0,584 0,589 0,585 0,584 98,98 99,83 99,15 98,98 20 24 0,295 0,293 98,01 97,34 20 24 0,568 0,562 96,27 95,25 100 PTX 0.3 mg/ml PTX 0.6 mg/ml 99 98 97 Nghiên cứu Y học Đánh giá ảnh hưởng ethanol lên độ tan phức PTX với HPβCD Sau loại dung môi, thu khối bột xốp tan tốt hòa tan với dung dịch NaCl 0,9% Kết khảo sát hàm lượng PTX mẫu trình bày bảng 11 Bảng 11 Hàm lượng PTX 24 Nồng độ Nồng độ Polysorbat 80 PTX mg/ml (%) 0,3 0,6 Nồng độ PTX (mg/ml) 0,307 0,583 % lại sau 24 0,298 95,44 0,534 91,60 24 Nhận xét: Cắn thu sau q trình loại dung mơi có khả hòa tan tốt dung dịch NaCl 0,9% Tại nồng độ PTX 0,3 mg/ml, nồng độ trì sau 24 90%, nhiên hàm lượng PTX lại thấp so với việc pha lỗng khơng loại dung môi Tại nồng độ PTX 0,6 mg/ml, hàm lượng PTX trì 90% sau 24 giờ, nhiên hàm lượng PTX thấp so với phương pháp không loại dung môi nghiên cứu So sánh với chế phẩm đối chiếu 96 95 12 16 20 24 Th?i gian (gi?) Hình Đồ thị biểu diễn nồng độ thời gian 24 Kết đo pH thời gian 24 cho kết khoảng 4-6 cho hai nồng độ Nhận xét: Với tỉ lệ HPβCD : PTX 360 : 1, sử dụng polysorbat 80 6%, thời gian 24 giờ, dung dịch đậm đặc sau pha lỗng thành 0,3 mg/ml 0,6 mg/ml có nồng độ PTX ln trì 95% pH khoảng cho phép thuốc tiêm chứa PTX (USP 34)6 Cuối thời điểm quan sát hai dung dịch Cơng thức lựa chọn đạt tiêu chí cảm quan yêu cầu hàm lượng PTX trị liệu Chuyên Đề Dược Học Công thức lựa chọn sử dụng tỉ lệ tạo phức PTX:HPβCD 1:360, sử dụng polysorbate-80 nồng độ 6% làm chất ổn định Pha chế công thức với lượng lớn gấp 30 lần công thức gốc, tiến hành pha lỗng với dung mơi pha tiêm NaCl 0,9% Định lượng dung dịch pha loãng, đánh giá hàm lượng PTX trì thời điểm giờ, 27 48 sau pha So sánh đồng thời với chế phẩm đối chiếu Intaxel® Kết so sánh hàm lượng cảm quan thể bảng 12 bảng 13 - Chế phẩm Intaxel® cho dung dịch pha loãng ổn định 72 giờ, hàm lượng PTX trì ln trì 98% - Cơng thức lựa chọn pha lỗng nồng độ 0,3 mg/ml ổn định 72 giờ, lượng PTX trì 90% đạt yêu cầu trị liệu Tuy nhiên cơng thức pha lỗng nồng độ 0,6 mg/ml 365 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học polysorbat 80 6% có thời gian ổn định trì hàm lượng so với chế phẩm đối chiếu Thời gian tối ưu sử dụng 27 sau pha loãng đạt ổn định đến 27 giờ, hàm lượng PTX trì 90% thời gian 48 Bảng 12 So sánh hàm lượng cơng thức lựa chọn Intaxel® Bảng 13 So sánh cảm quan công thức lựa chọn Intaxel® Hàm lượng PTX trì (%) Mẫu quan sát 27 48 72 T1 100 96,85 94,77 92,04 0,3 mg/ml ® Intaxel 100 99,60 98,86 98,13 T2 100 94,42 90,91 83,26 0,6 mg/ml ® Intaxel 100 98,87 98,14 98,03 Nồng độ Nồng độ Mẫu quan sát 0,3 mg/ml T1: cơng thức lựa chọn pha lỗng nồng độ PTX 0,3 mg/ml T2: công thức lựa chọn pha loãng nồng độ PTX 0,6 mg/ml 0,6 mg/ml T1 ® Intaxel T2 ® Intaxel Thời gian quan sát 27 48 27 + + + + + + + + + + + + + + Với (+) biểu thị dung dịch trong, (-) biểu thị dung dịch tủa - Kết khảo sát cho thấy công thức lựa chọn sử dụng tỉ lệ tạo phức PTX:HPβCD 1:360 Nghiên cứu xây dựng quy trình bào chế dung dịch đậm đặc PTX dùng pha tiêm 750 mg PTX 443 g HPβCD Hòa tan 150 ml ethanol tuyệt đối (siêu Hòa tan từ từ vào hỗn hợp 450 ml nước 300 ml ethanol âm đến tan) Dung dịch chứa PTX ethanol tuyệt đối Dung dịch chứa HPβCD nước ethanol Phối hợp dung dịch, khuấy trộn (không gia nhiệt) 75 ml polysorbat 80 975 ml dung dịch đậm đặc chứa 750 mg PTX Lọc qua màng 0,22 µm Lọ thủy tinh, nắp cao su tiệt trùng Đóng lọ Dung dịch đậm đặc chứa 30 mg PTX lọ Sơ đồ Quy trình điều chế dung dịch đậm đặc chứa Paclitaxel - Dung dịch đậm đặc lọc qua màng 0,22 µm sau đóng vào lọ tiệt trùng có dung tích 20 ml bịt kín nút cao su tiệt trùng Tiến hành đánh giá cảm quan, pH, nồng độ PTX đánh giá độ vô trùng chế phẩm 366 - Quy trình điều chế dung dịch đậm đặc chứa PTX hòa tan đơn giản trình bày sơ đồ KẾT QUẢ - Cảm quan: Dung dịch thu có màu Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 vàng nhạt, suốt, nhớt pH từ đến Kết đánh giá hàm lượng trình bày bảng 14 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bảng 14 Kết định lượng (n=6) Nồng độ 0,3 mg/ml 0,6 mg/ml Hàm lượng trì (%) 27 100 96,15 100 93,97 KẾT LUẬN Quy trình định lượng PTX chế phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao sử dụng đầu dò PDA đề thẩm định đạt yêu cầu quy trình phân tích Việc áp dụng chương trình gradient nồng độ pha động giúp rút ngắn thời gian phân tích đáng kể đảm bảo độ xác kết phân tích Phương pháp tạo phức PTX với HPβCD sử dụng polysorbat 80 làm chất ổn định cải thiện độ tan PTX Dung dịch pha loãng từ dung dịch đậm đặc ban đầu có khả trì nồng độ PTX giới hạn trị liệu cho phép Chuyên Đề Dược Học Nghiên cứu Y học Brewster ME, Loftsson T (2007), “Cyclodextrins as pharmaceutical solubilizers”, Advanced Drug Delivery Reviews, 59(7), 645-666 Hamada H, Ishihara K, Masuoka N, Mikuni K, Nakajima N (2006), “Enhancement of water-solubility and bioactivity of paclitaxel using modified cyclodextrins”, Journal of Bioschience and Bioenginerring, 102(4), 369-371 Singla AK, Garg A, Aggarwal D (2002), “Paclitaxel and its formulations”, International Journal of Pharmaceutics, 235(1-2), 179192 Stella VJ, Mathew AE (1990), “Derivatives of taxol, pharmaceutical compositions thereof and methods for the preparation thereof”, United States Patent, US 960 790 Straubinger RM, Sharma US, Balasubbramanian SV (1995), “Pharmaceutical and Physical Properties of Paclitaxel (Toxol®) Complexes with Cyclodextrin”, Journal of Pharmaceutical Sciences, 84(10), 1223-1230 Strickley RG (2004), “Solubilizing excipients in oral and injectable formulations”, Pharmaceutical Research, 21(2), 201- 230 United State Pharmacopoeia (USP34-NF29) (2012), CD-ROM Ngày nhận báo: 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo: 21.12.2012 Ngày báo đăng: 10.03.2014 367 ... truyền tĩnh mạch Tuy nhiên, PTX có độ tan hầu hết dung mơi pha tiêm nên nghiên cứu tâp trung cải thiện độ tan PTX Các kết nghiên cứu cho thấy việc tạo phức bao PTX với dẫn chất β-cyclodextrin có... gradient nồng độ pha động giúp rút ngắn thời gian phân tích đáng kể đảm bảo độ xác kết phân tích Phương pháp tạo phức PTX với HPβCD sử dụng polysorbat 80 làm chất ổn định cải thiện độ tan PTX Dung... truyền ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Đối tượng Nghiên cứu xây dựng công thức quy trình bào chế dung dịch đậm đặc chứa paclitaxel sử dụng hydroxypropyl-β-cyclodextrin tạo phức trợ tan Dung dịch