Bài viết Nghiên cứu tạo phức hợp của Artemisinin-2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin để hỗ trợ điều trị ung thư nghiên cứu việc xây dựng quy trình tách chiết kết hợp với việc tạo phức hệ với 2-hydroxypropyl-β-Cyclodextrin (HPbCD) để thu chế phẩm Art-HPbCD trực tiếp từ cây Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.). Phức hệ Art-HPbCD thu được có kích thước 162 nm chứa 36,496 µg/mL Art.
HỘI NGHỊ KHOA HỌC LẦN THỨ XXV CỦA HỘI HÓA SINH Y HỌC HÀ NỘI VÀ CÁC TỈNH PHÍA BẮC NGHIÊN CỨU TẠO PHỨC HỢP CỦA ARTEMISININ-2-HYDROXYPROPYLβ-CYCLODEXTRIN ĐỂ HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ Lê Quang Huấn1, Hà Thị Thanh Hương2,3, Vũ Dương Thanh2, Phạm Thị Quỳnh Trang2, Đái Ban1 TÓM TẮT Thuốc trị sốt rét Artemisinin (Art) dẫn xuất khám phá chất chống ung thư tiềm Các hợp chất Art khiến tế bào ung thư nhạy cảm với trình ferroptosis, dạng chết tế bào theo chương trình q trình peroxy hóa lipid phụ thuộc vào sắt Trong nghiên cứu này, xây dựng quy trình tách chiết kết hợp với việc tạo phức hệ với 2-hydroxypropyl-β-Cyclodextrin (HPbCD) để thu chế phẩm Art-HPbCD trực tiếp từ Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.) Phức hệ Art-HPbCD thu có kích thước 162 nm chứa 36,496 µg/mL Art Phức hệ Art-HPbCD xác định IC50 3,0 µg/mL thử nghiệm tế bào ung thư vú MCF7 2,4 µg/mL thử nghiệm tế bào ung thư gan HTCC116 Thử nghiệm độc tính chuột xác định LD50 4,2 g/kg theo đường uống theo đường tiêm 3,2 g/kg Phức hệ với liều 20 mg/mL sử dụng liên tục 28 ngày không gây tổn thương gan, thận, phổi động vật thí nghiệm Khối u nhân tạo chuột tiêu biến hoàn toàn sau 25 ngày với liều điều trị (một liều 20 mg/mL) Viện Công nghệ sinh học, VAST; AQP-Phenikaa; Viện hóa học hợp chất thiên nhiên, VAST; Chịu trách nhiệm chính: Lê Quang Huấn Email: huanlequang@gmail.com Ngày nhận bài: 31.8.2022 Ngày phản biện khoa học: 13.9.2022 Ngày duyệt bài: 24.9.2022 SUMMARY RESEARCH FOR CREATION OF ARTEMISININ-2-HYDROXYPROPYLβ-CYCLODEXTRIN COMPLEX TO SUPPORT CANCER TREATMENT The antimalarial drug Artemisinin (Art) and its derivatives have been explored as potential anticancer agents Art compounds can sensitize cancer cells to ferroptosis, a new form of programmed cell death caused by iron-dependent lipid peroxidation In this study, we developed an extraction procedure using a 10% solution of 2hydroxypropyl-β-Cyclodextrin to obtain the ArtHPbCD complex directly from Artemisia annua L The obtained Art-HPbCD complex having size 162 nm contains 36.496 µg/mL Art The ArtHPbCD complex have an IC50 of 3.0 µg/mL when test on MCF7 breast cancer cells and 2.4 µg/mL when test on HTCC116 liver cancer cells Toxicity testing in rats determined an LD50 of 4.2 g/kg orally and an injection of 3.2 g/kg Using the Art-HPbCD complex at a dose of 20 mg/mL continuously for 28 days there was no damage to the liver, kidneys, lungs of experiment animals and the artificial tumor was completely destroyed after 25 days with doses (one dose is 20 mg/mL) 12 I ĐẶT VẤN ĐỀ Theo ước tính tổ chức Y tế giới (WHO) đến năm 2032 có khoảng 22 triệu trường hợp ung thư 13 triệu người chết năm Trong số 172 quốc gia TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 519 - THÁNG 10 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2022 vùng lãnh thổ khảo sát (WHO công bố tháng 5/2014), Việt Nam đứng vị trí 78, cụ thể, tỷ lệ chết ung thư Việt Nam 110 ca/100.000 người Mỗi năm Việt Nam có khoảng 200.000 ca ung thư mới, có 75.000 ca tử vong Ferroptosis dạng chết tế bào phụ thuộc vào sắt phát hiện, khác với dạng chết khác Ferroptosis đóng vai trị quan trọng việc ức chế khối u, hội cho liệu pháp điều trị ung thư [Li et al., 2020] Art Tu Youyou phát tác dụng điều trị sốt rét [Kannan et al., 2005] Sau đó, Art chứng minh có tác dụng chống viêm, trị tiểu đường, gây hoại tử apoptosis nhiều tế bào ung thư [Zhou et al., 2012] Art hoạt động theo chế: Làm ngưng chu kỳ tế bào, ức chế hình thành mạch, ức chế di gây ferroptosis [Wang et al., 2015, Hu et al., 2022] Art không tan nước nên khả dụng sinh học thấp, nhiều nghiên cứu tăng hiệu điều trị Art tạo liposome, hệ dẫn nano Để tăng hiệu điều trị Art, Zhu cs, (2022) tạo phức hệ Art-HPbCD bọc chúng tinh bột xốp Tuy nhiên, quy trình phức tạp Trong nghiên cứu phức hệ ArtHPbCD tạo trực tiếp từ nguyên liệu trình tách chiết Phức hệ thu nguyên liệu để tạo chế phẩm an tồn có khả tiêu biến khối u động vật thí nghiệm II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu Artemisinin (Art) 2-Hydroxypropyl-βcyclodextrin (HPbCD) mua Hãng Sigma-Aldrich; Chuột nhắt trắng chủng Swiss tuần tuổi nặng 20-24g, trưởng thành khỏe mạnh cung cấp từ Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương Chuột ni điều kiện bình thường (12 sáng, 12 tối, nhiệt độ ni trì 25-30 oC) ngày để thích nghi với mơi trường thí nghiệm; Hóa chất gây khối u: methylcholanthrene; dầu Oliu; dung mơi hóa chất cần thiết khác có độ tinh cần thiết đáp ứng yêu cầu phịng thí nghiệm 2.2 Phương pháp 2.2.1 Tách chiết Art sử dụng HPbCD Cân 2g bột hao hoa vàng khơ để hồ dung dịch 10% HPbCD Hỗ hợp khuấy 20 phút 40 oC, sau siêu âm 30 phút với cường độ 20 kHz, 300 W, nhiệt độ 40-50 oC Lọc qua vải màng lọc 0,45 µm để thu dịch Loại dung môi máy cô quay chân không 60 oC (hoặc đông khô -50 oC) để thu mẫu nguyên liệu Phân tích kích thước hàm lượng Art mẫu Mẫu đối chứng sử dụng H2O thay cho dung dịch 10% HPbCD 2.2.2 Xác định hàm lượng Artemisinin và kích thước sản phẩm Hàm lượng Art mẫu xác định phương pháp HPLC (theo quy trình Mwangi et al., 2020) Xác định kích thước phức hệ theo phương pháp Peerzade et al., (2020) 2.2.3 Xác định độc tính cấp chế phẩm Art/HPbCD Khảo sát độc tính cấp Art/HPbCD theo phương pháp Litchfield–Wilcoxon 40 chuột nhịn đói 12h qua đêm chia ngẫu nhiên thành lô (N=10), lô chuột cho uống lần vòng 24 giờ, lần cách dung dịch Art/HPbCD khác với bước nhảy liều 25% Theo 13 HỘI NGHỊ KHOA HỌC LẦN THỨ XXV CỦA HỘI HÓA SINH Y HỌC HÀ NỘI VÀ CÁC TỈNH PHÍA BẮC dõi số chuột chết, sống vòng 72 sau thử nghiệm quan sát dấu hiệu sau vòng ngày về: Hành vi, cân nặng thể, hệ tiêu hóa, hệ tiết, hệ hơ hấp chuột mổ để quan sát đại thể động vật bị chết thời gian theo dõi Xác định liều LD50, liều an toàn liều dung nạp tối đa dung dịch Art/HPbCD chuột nhắt 2.2.4 Xác định độc tính bán trường diễn Art/HPbCD Từ liều an toàn dung dịch Art/HPbCD dùng nhiều lần không gây thay đổi đáng kể tới chức năng, quan hoạt động sinh lý chuột thí nghiệm Chuột thử nghiệm mức liều thấp, liều trung bình liều cao dung dịch Art/HPbCD với tuần, theo dõi hành vi, cân nặng, số huyết học sinh hóa, phân tích mơ bệnh học Các tiêu mô gan thận xét nghiệm phương pháp hóa mơ miễn dịch Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 20.0 để xử lý số liệu So sánh khác biệt thống kê nhóm t-test Anova-test với độ tin cậy 95% Các kết biểu diễn dạng giá trị trung bình ± SD 2.2.5 Gây khối u thực nghiệm chuột Các chuột bạch dòng Swiss (4-6 chuột) tiêm da với mL dung dịch hóa chất (methylcholanthrene pha dầu oliu với nồng độ 0,1 mg/mL) để tạo khôi u Mô khối u sinh thiết để kiểm tra tế bào ung thư Xác định tế bào ung thư khối u tạo động vật thí nghiệm Xác định tế bào ung thư mô khối u lấy từ khối u chuột thí nghiệm phương pháp nhuộm với hemotoxylink 14 2.2.6 Xác định tác dụng tiêu u phức hệ Art/HPbCD Sử dụng Art/HPbCD theo đường uống tiêm tiêm bắp với mL dung dịch phức hệ Art/HPbCD (nồng độ 20 mg/mL) cho 3-5 chuột Swiss có trọng lượng 18-20 gram có khối u xuất rõ Theo dõi tình trạng tiêu biến khối theo thời gian từ tiêm khối u tiêu biến hoàn toàn III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Tạo phức hệ Art-HPbCD Bột Thanh hao hoa vàng (500g) hòa 10% dung dịch HPbCD Khuấy đều, sau siêu âm 15 phút với cường độ 20 kHz, 300 w Kích thước phức hệ tạo xác định thiết bị Malvern 162 nm (Hình 1) hàm lượng Art xác định sắc ký lỏng hiệu cao (HPLCShimadzu với hệ dung môi pha động methanol-nước (MeCN:H2O tỉ lệ 45:55), bước sóng 205 nm; tốc độ dịng chảy: 1,2 mL/phút) 36,496 µg/mL Mẫu chiết tạo phức hệ sau đơng khơ để tiến hành thử nghiệm Hình Kích thước phức hệ Art-HPbCD được xác định thiết bị MALVERN Đánh giá độc tính dịng tế bào ung thư ung thư vú MCF7 ung thư gan TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 519 - THÁNG 10 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2022 HCT116 theo phương pháp MTT Kết dòng tế bào ung thư gan HTC116 với nồng độ 0,1µg/mL, phần trăm tế bào sống thấp so với đối chứng 12,5%, với nồng độ 25 µg/mL, phần trăm tế bào sống thấp so với đối chứng 90,1%, IC50 = 2,4µg/mL Với dòng tế bào ung thư vú: nồng độ 0,1 µg/mL thuốc có tác động lên sức sống dịng tế bào MCF7, phần trăm tế bào sống thấp đối chứng 10,9% Tại nồng độ 25 µg/mL, phần trăm tế bào sống thấp so với đối chứng 89,1%, IC50 = 3,0 µg/mL 3.2 Kết gây khối u chuột Các chuột bạch dòng Swiss tiêm da với 1mL dung dịch hóa chất (methylcholanthrene pha dầu oliu với nồng độ 0,1 mg/mL) để tạo khôi u Mô khối u sinh thiết để kiểm tra tế bào ung thư Kết tạo khối u biểu lộ hình Hình Kích thước khối u chuột tạo được tiêm methylcholanthrene pha dầu oliu với nồng độ 0,1 mg/mL 3.3 Kết xác định độc tính chế phẩm ArtHPbCD Kết cho thấy tất lô chuột thử nghiệm với liều Art/HPbCD khỏe mạnh, di chuyển ăn uống bình thường, da, lơng, mắt chức tiêu hóa, hơ hấp, vận động, thần kinh bình thường khơng có chuột chết vịng 72 hay có tiên lượng chết sau ngày Đồng thời, cân nặng chuột lơ thí nghiệm sau ngày tăng bình thường khơng có khác biệt có ý nghĩa cân nặng liều thử nghiệm (p>0,05) Kết thử nghiệm cho thấy Art có độc tính cấp thấp Kết thử nghiệm cho thấy theo đường uống LD50 lớn 4,2 g/kg theo đường tiêm lớn 3,2 g/kg Ở liều cao, thử nghiệm động vật, Art/HPbCD dẫn chất có độc tính thần kinh Tuy nhiên, độc tính xảy người dung mức liều 10-25 mg/kg/ngày 3.4 Kết xác định độc tính bán trường diễn phức hệ Art/HPbCD Thử nghiệm tiến hành chuột nhắt trắng trọng lượng 18 – 20 g/con Chuột chia ngẫu nhiên thành 10 lô, lô 10 Chuột cho uống dung dịch Art/HPbCD với liều suy diễn từ liều dự kiến sử dụng người 20 mg/kg/ngày, lô sử dụng làm đối chứng tiêm nước thể tích tương đương trọng lượng lơ điều trị liên tục 28 ngày Kết quả: Thể trạng tình trạng chung chuột theo dõi trước sau thử nghiệm tốt, khơng có biểu bất thường Sau thời gian 28 ngày sử dụng Art/HPbCD tế bào gan thận bình thường (hình 3) 15 HỘI NGHỊ KHOA HỌC LẦN THỨ XXV CỦA HỘI HÓA SINH Y HỌC HÀ NỘI VÀ CÁC TỈNH PHÍA BẮC Hình Hình ảnh giải phẫu mơ bệnh học gan, thận phổi (Hình ảnh nhuộm HE, Độ phóng đại 400 lần) 3.5 Kết xác định tế bào ung thư động vật thí nghiệm Xác định tế bào ung thư mô khối u lấy từ khối u chuột thí nghiệm phương pháp nhuộm với hemotoxylink Kết (được thể hình 4) cho thấy xuất tế bào nhân quái, nhân chia (tế bào ung thư) mơ Hình Ảnh chụp giải phẫu mơ khối u tạo được chuột: Nhiều tế bào ung thư dạng Fibrosarcoma với các kích thước to, nhỏ khác nhau, nhân kiềm tính, nằm tổ chức liên kết (Hình ảnh nhuộm HE, Độ phóng đại 400 lần) 3.6 Kết xác định tác dụng tiêu u phức hệ Art/HPbCD Xác định khả tiêu u phức hệ Art/HPbCD xác định qua hình ảnh giải phẫu bệnh lý tế bào nhân quái-nhân chia (tế bào ung thư) khơng cịn nữa, tế bào trở bình thường (hình 5) 16 Hình Ảnh chụp giải phẫu mô sau điều trị phức hệ Art/HPbCD Kết quả cho thấy khơng cịn tế bào nhân quái, nhân chia (tế bào ung thư) (Hình ảnh nhuộm HE, Độ phóng đại 400 lần) TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 519 - THÁNG 10 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2022 3.7 Kết quả gây tiêu biến khối u Về mặt hình thái khối u sau sử dụng phức hệ Art/HPbCD cho thấy khôi u thực nghiệm chuột tiêu biến sau thời gian 25 ngày (hình 6) Hình Ảnh chụp tiêu biến khối u sau sử dụng phức hệ Art/HPbCD sau 15 ngày (a), sau 20 ngày (b) sau 25 ngày (c) Đối với chuột gây khối u mà khơng sử dụng phức hệ Art/HPbCD khối u phát triển chuột chết sau 40 ngày VI BÀN LUẬN Artemisinin (Art) dùng điều trị sốt rét tác dụng diệt ký sinh trùng sốt rét thể vơ tính hồng cầu Gần đây, công dụng khác xác định, đặc biệt khả tiêu diệt tế bào ung thư nhanh hiệu Các chế chống ung thư Art bao gồm ức chế chu kỳ tế bào, ức chế hình thành mạch khối u, tổn thương DNA tao ferroptosis Ferroptosis loại chết tế bào theo chương trình khơng phổ biến, bao gồm điều hịa chuyển hóa sắt, tạo loại oxy phản ứng (ROS) kích hoạt căng thẳng lưới nội chất (ERS) Thí nghiệm Waseem et al., (2018) chứng minh việc bổ sung axit aminlevulinic (ALA) làm tăng đặc tính chống ung thư đại trực tràng Art Zhou et al., (2022) đưa giả thuyết chế tác động artemisinin: (I) Art tạo ROS (Reactive Oxygen Species), dẫn đến tăng biểu thụ thể chết, phân cắt caspase-3 caspase-8, đồng thời giảm biểu c-FLIP, dẫn đến kích thích đường apoptosis bên ngồi Trong đó, thân ROS kích hoạt đường apoptosis nội cách điều chỉnh biểu tBID, BAX/BAK, gây giải phóng Cytochrome C để kích hoạt caspase-9 (II) Sự tích tụ ROS từ loại thuốc loại Art dẫn đến q trình peroxy hóa lipid để tạo q trình ferroptosis Bên cạnh đó, phá vỡ hệ thống trì cân nội mơi oxy hóa loại thuốc loại Art dẫn đến điều hịa biểu GPX4 (III) Stress oxy hóa từ loại thuốc loại ART bắt đầu hình thành phagophore thơng qua việc kích hoạt đường AMPK tập hợp phức hợp VPS34, dẫn đến tượng autophagy Thuốc Art gây hoại tử (IV), gây pyroptosis (V) Các nghiên cứu chứng minh 80% liều dùng đường uống thải qua phân nước tiểu 24 giờ, 68% liều tiêm tĩnh mạch tìm thấy nước tiểu 24 đầu 95% tìm thấy 72 Thời gian bán thải Art ngắn, với đường uống gần tiêm bắp từ 3,85 – 5,38 Một sản phẩm sử dụng để hỗ trợ điều trị ung thư ARFeMAX 17 HỘI NGHỊ KHOA HỌC LẦN THỨ XXV CỦA HỘI HÓA SINH Y HỌC HÀ NỘI VÀ CÁC TỈNH PHÍA BẮC Hungary sản phẩm chứa Art kết hợp với viên sắt Kết sau tiếng ¾ tế bào ung thư bị tiêu diệt sau 16 tiếng tiêu diệt hồn tồn 100% tế bào ung thư cịn lại Trong tế bào lành khơng có nhiều sắt nên khơng bị ảnh hưởng [https://navita.hu/en/product/arfemax/] Kết nghiên cứu cho thấy phức hệ Art/HPbCD có mức độ độc tính thấp nên sau thời gian sử dụng liều 20 mg/kg/ngày chuột với thời gian 28 ngày không gây tổn thương quan nội tặng chuột, giải phẫu gan, thận phổi chuột cho thấy mơ khơng có khác biệt với mô tương ứng chuột lô đối chứng Điều quan trọng khối u chuột tiêu biến hoàn toàn sau 25 ngày sau sử dụng liều điều trị cách ngày (mỗi liều 20 mg/kg/ngày) theo đường uống tiêm Sự khác sử dụng theo đường uống đường tiêm không rõ ràng Hiệu tác động phức hệ Art/HPbCD việc tiêu biến khối u, theo chúng tơi, ngồi tác động Art cịn có cộng hưởng tác động HPbCD V KẾT LUẬN 1) Đã xây dựng quy trình tạo phức hệ Artemisinin -2 – Hydroxypropyl – β Cyclodextrin theo quy trình tách trực tiếp từ hao hoa vàng (Artemisia annua L.) với hàm lượng Art 36,496 µg/mL, kích thước phức hệ 162 nm 2) Thử nghiệm độc tính theo phương pháp MTT dòng tế bào ung thư vú MCF7 ung thư gan HTCC116 xác định IC50 tương ứng 3,0µg/mL 2,4 µg/mL Liều độc theo đường uống xác định theo LD50 lớn 4,2 g/kg theo đường tiêm lớn 3,2 g/kg 18 3) Sử dụng phức hệ Art-HPbCD sau 28 ngày với liều 20 mg/mL không gây tổn thương quan nội tạng gan, thận, phổi động vật thí nghiệm 4) Khối u nhân tạo chuột tiêu biến hoàn toàn sau 25 ngày với liều sử dụng (một liều 20 mg/mL) TÀI LIỆU THAM KHẢO Hu Y, Guo N, Yang T, Yan J, Wang W, Li X The Potential Mechanisms by which Artemisinin and Its Derivatives Induce Ferroptosis in the Treatment of Cancer Oxid Med Cell Longev 2022 Jan 4; 2022:1458143 Kannan R, Kumar K, Sahal D, Kukreti S, Chauhan VS Reaction of artemisinin with haemoglobin: implications for antimalarial activity Biochem J 2005 Jan 15; 385(Pt 2): 409-418 Li J, Cao F, Yin Hl, et al Ferroptosis: past, present and future Cell Death Dis 2020; 11: 88 Mwangi S, Abuga K, Mungai N, Mwangi J A High-Performance Liquid Chromatography Method for Determination of Artemisinin in Artemisia annua L Leaf Extracts East Cent Afr J Pharm Sci 2020; 23(2): 48-53 Peerzade SAMA, Makarova N, Sokolov I Ultrabright Fluorescent Silica Nanoparticles for Multiplexed Detection Nanomaterials (Basel) 2020 May 8; 10(5): 905 Wang B, Hou D, Liu Q, Wu T, et al Artesunate sensitizes ovarian cancer cells to cisplatin by downregulating RAD51 Cancer Biol Ther 2015; 16(10): 1548-56 Waseem Y, Hasan CA, Ahmed F Artemisinin: A Promising Adjunct for Cancer Therapy Cureus 2018 Nov 23; 10(11): e3628 Zhou C, Pan W, Xiao PW, and Tong SC Artesunate induces apoptosis via a Bakmediated caspase-independent intrinsic pathway in human lung adenocarcinoma cells J Cell Physiol 2012 Dec; 227(12): 3778-3786 ... hỗ trợ điều trị ung thư ARFeMAX 17 HỘI NGHỊ KHOA HỌC LẦN THỨ XXV CỦA HỘI HÓA SINH Y HỌC HÀ NỘI VÀ CÁC TỈNH PHÍA BẮC Hungary sản phẩm chứa Art kết hợp với viên sắt Kết sau tiếng ¾ tế bào ung thư. .. nghiên cứu tăng hiệu điều trị Art tạo liposome, hệ dẫn nano Để tăng hiệu điều trị Art, Zhu cs, (2022) tạo phức hệ Art-HPbCD bọc chúng tinh bột xốp Tuy nhiên, quy trình phức tạp Trong nghiên cứu. .. tiến hành thử nghiệm Hình Kích thư? ?́c phức hệ Art-HPbCD được xác định thiết bị MALVERN Đánh giá độc tính dịng tế bào ung thư ung thư vú MCF7 ung thư gan TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 519 -