Mục tiêu nghiên cứu bài viết nhằm xác định vật chủ sản xuất hợp chất tự nhiên onnamide từ Theonella swinhoei căn cứ trên kết quả phân tích gen ftsZ. Phương pháp: khuếch đại gen ftsZ từ ADN toàn phần của T. swinhoei bằng cặp mồi đặc hiệu, giải trình tự và phân tích bằng chương trình BLAST và BioEdit - ClustalW.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 PHÂN TÍCH GEN ftsZ - XÁC ĐỊNH VẬT CHỦ SẢN XUẤT HỢP CHẤT TỰ NHIÊN ONNAMIDE TỪ THEONELLA SWINHOEI Nguyễn Tú Anh* TÓM TẮT Mục tiêu: xác định v t chủ sản xuất hợp chất tự nhiên onnamide từ Theonella swinhoei kết phân tích gen ftsZ Phương pháp: khuếch đại gen ftsZ từ ADN toàn phần T swinhoei cặp mồi đặc hiệu, giải trình tự phân tích chương trình BLAST BioEdit - ClustalW Kết quả: phân tích trình tự nucleotid ftsZ từ ADN toàn phần T swinhoei cho thấy có độ tương đồng từ 56 - 58% với gen ftsZ lồi Dehalococcoides ethenogenes thuộc ngành Chloroflexi Trình tự gen ftsZ phân l p có độ tương đồng cao với ( 96%), không giống hoàn toàn Kết luận: kết đặt giả thuyết có nhi u biến thể gen ftsZ từ chủng vi khuẩn (VK) cộng sinh khác để giải thích tượng tìm thấy nhi u hợp chất thuộc họ onnamide từ T swinhoei * Từ khóa: Theonella swinhoei; Onnamide; Gen ftsZ, Chloroflexi; Vi sinh v t cộng sinh Determination of the Producer of Onnamides from the Theonella Swinhoei Based on the ftsZ Gene Summary Objectives: To determine the producer of onnamides from the Theonella swinhoei based on the ftsZ gene Methods: Amplify the ftsZ gene from the metagenomic DNA of T swinhoei using the specific primers These PCR products were sent for sequencing and analyzed applying BLAST and BioEdit - ClustalW Results: Nucleotide sequence analysis showed that the amplicons from the metagenomic DNA of T swinhoei had the identity ranging from 56 to 58% with the ftsZ of Dehalococcoides ethenogenes, a member of the phylum Chloroflexi These cloned FtsZ amplicons shared high but not complete identities ( 96%) Conclusion: These results demonstrate the existence of multiple closely related ftsZ variants inside the metagenomic DNA of T swinhoei This might explain the presence of closely related onnamide variants, which could belong to distinct, diversified strains * Key words: Theonella swinhoei; Onnamide; ftsZ gene; Chloroflexi; Symbiontic bacteria ĐẶT VẤN ĐỀ Sinh v t biển, có Theonella swinhoei, nguồn cung cấp phong phú hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao Mặc dù v y, v t chủ th t sản xuất hợp chất lại cho VK cộng sinh với chúng Giả thuyết cộng sinh đ xuất cơng thức hóa học chất từ sinh v t biển từ số VK tương tự [1, 2] * Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tú Anh (nguyentuanhvn@gmail.com) Ngày nhận bài: 01/02/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 08/03/2016 Ngày báo đăng: 21/03/2016 40 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 Do VK cộng sinh khó ni cấy khuẩn, kháng virut, đặc biệt có độc tính u kiện phòng thí nghiệm, nên kỹ thu t số dòng tế bào ung thư ngưỡng sinh học phân tử phân tích hệ gen tồn picomolar [4] Vì v y, để hiểu rõ đường phần, bao gồm ADN sinh v t biển sinh tổng hợp onnamide tự nhiên, ADN hệ VK cộng sinh áp d ng hệ gen toàn phần T swinhoei ~ 32 Gbp Một ví d điển hình, kỹ thu t này, chiết tách Khi phân l p gen PKS- v t chủ sản xuất hợp chất polyketid pederin NRPS (polyketide synthetase - nonribosomal xác định VK Pseudomonas peptide synthetase) chịu trách nhiệm sinh sống cộng sinh với loài kiến ba khoang tổng hợp onnamide bộc lộ Paederus fulcipes [3] gen onn - gen ftsZ nằm li n k Từ T swinhoei, 22 loại onnamide thuộc Phân tích trình tự nucleotid ftsZ nhóm hợp chất polyketide - nonribosomal giúp có nh n định v peptide (PK-NRP) họ pederin tìm thấy onnamide đa dạng (hình 1) Onnamide có hoạt tính kháng nhóm hợp chất onnamide từ T swinhoei Onnamide F Theopederin D v t chủ sản xuất Theopederin E Theopederin F Hình 1: Một số hợp chất nhóm onnamide từ Theonella swinhoei 41 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3’-T cách bổ sung dTTP theo * ADN toàn phần T swinhoei: cắt EcoRV; µl buffer 10 X T swinhoei (đảo Hachijo-jima, Nh t Bản) ThermoPol; 0,5 µl dTTP 100 mM; µl Taq dùng để chiết tách ADN tồn phần theo quy trình Piel CS mô tả [3] * Khuếch đại gen ftsZ: Dựa trình tự gen ftsZ phân l p ~ 883 bp, thiết kế cặp mồi đặc hiệu gồm mồi xuôi 5’ CGC TGC GAC GTA CCC AAC C 3’ mồi ngược 5’ CGT CAT CGG ACA TAG GCG TAA C 3’ Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen ftsZ gồm 2, µl buffer 10 X ThermoPol; 0,5 µl dNTPs 10 mM; 0,25 µl BSA 100 X; 0,25 µl mồi xi 50 µM; 0,25 µl mồi ngược 50 µM; 0,125 µl Hot-start polymerase; 0,5 µl ADN tồn phần; nước cất vừa đủ 25 µl Chương trình phản ứng PCR gồm 35 chu k : biến tính ADN 95oC/30 giây, bắt cặp mồi 62oC/60 giây, kéo dài 72oC/60 giây phản ứng: 15 µl vector pBluescript SK II (-) polymerase; ủ 72oC Các sản phẩm ADN tinh sau chạy điện gi gel agarose sử d ng kít QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) Ghép nối sản phẩm PCR có đầu 3’-A vector 3’-T enzym T4 ligase Sau đưa vào tế bào E coli XL1 blue phương pháp thẩm điện Chọn tế bào biến nạp sàng lọc khuẩn lạc VK trắng/xanh * Chiết tách ftsZ từ E coli: ftsZ từ tế bào E coli biến nạp chiết tách gửi giải trình tự Cơng ty GATC Biotech (giải trình tự máy giải trình tự tự động theo phương pháp Sanger) Để chuẩn bị tạo dòng sản phẩm PCR kỹ thu t TA cloning, chương trình KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ PCR, giai đoạn kéo dài cuối tiến hành BÀN LUẬN 10 phút Nhờ v y, nucleotide A tự dộng thêm vào đầu 3’ gen Phân tích trình tự ftsZ fosmid pTSSH2 ftsZ, tạo đầu t n 3’-A Phát sản Trong q trình tìm kiếm gen mã hóa phẩm PCR phương pháp điện di onnamide từ ADN toàn phần T swinhoei, gel agarose 1% phát đoạn gen ftsZ nằm li n k * Tạo dòng đoạn gen ftsZ kỹ thuật TA cloning: gen onnI fosmid pTSSH2 FtsZ protein thuộc họ tubulin - like có VK, Sử d ng vector tạo dòng pBluescript đóng vai trò q trình phân chia tế SK II (-), cắt enzym cắt giới hạn bào VK có tính bảo tồn cao (hình 2) EcoRV Tiếp theo, tạo T-vector có đầu t n [5] 42 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 onn genes ftsZ mã hóa protein tubulin-like cần thiết cho q trình phân chia vi khuẩn © 2011 E Fischer-Friedrich Hình 2: (a) Gen ftsZ pTSSH2 Đoạn liên t c: gen onn, đoạn có vạch chéo: gen khơng mã hóa cho onnamide, đoạn khơng màu: gen ftsZ (b) FtsZ (mũi tên) trình phân chia tế bào VK Phân tích trình tự ftsZ từ ADN toàn phần T swinhoei thuộc 03 ngành Firmicutes, Cyanobacteria Do có nhi u hợp chất onnamide thuộc ngành Chloroflexi Phân tích Chloroflexi; ftsZ phân l p diện T swinhoei, v y giả thuyết cung cấp chứng v chủ nhân th t m i v t chủ chịu trách nhiệm sản xuất hợp chất onnamide VK ngành loại onnamide đặt Với m c Chloroflexi Chloroflexi gồm VK khơng đích tìm hiểu đa dạng trình tự lưu hu nh màu l c, có khả tự dưỡng - gen ftsZ tồn hệ ADN toàn phần, nghĩa sản xuất chất hữu từ CO2 ftsZ sau khuếch đại biến nạp vào chất vơ có môi trường E coli, chọn ngẫu nhiên tế bào E coli xúc tác ánh sáng Vì v y, Chloroflexi biến nạp để thu ftsZ Đặt tên trình tự xếp vào nhóm VK quang hợp thu nh n: pTA1-1 - pTA1-5 Phân tích [6] Nhóm VK thấy nhi u động v t BLAST cho thấy trình tự sống cạn, sinh v t biển đặc biệt nucleotide đ u mã hóa cho protein FtsZ hệ VK cộng sinh với bọt biển với tỷ lệ Dehalococcoides ethenogenes, thuộc 22% [7] Nh n định phù hợp với ngành Chloroflexi với tỷ lệ tương đồng nghiên cứu Bewley CS cho 56 - 58% Tiếp t c so sánh trình tự ftsZ từ chất chuyển hóa T swinhoei khơng nghiên cứu với 23 trình tự ftsZ VK khác có nguồn gốc từ Cyanobacteria hay tế bào có độ tương đồng cao Những VK bọt biển [8] 43 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 Tiếp t c so sánh trình tự nucleotid với trình tự ftsZ tìm thấy fosmid pTSSH2 chương trình BioEdit - ClustalW Kết cho thấy trình tự tương đồng tương đồng với trình tự ftsZ pTSSH2 với tỷ lệ cao (≥ 96%), nhiên khơng có trình tự giống hồn tồn (bảng 1) Kết chứng minh tồn biến thể ftsZ hệ gen toàn phần T swinhoei Đi u giúp giải thích tượng từ T swinhoei có nhi u hợp chất onnamide m i hợp chất VK khác sản xuất Bảng 4: So sánh trình tự ftsZ Trình tự Tên Trình tự Tên Tỷ lệ tƣơng đồng (%) pTA1-1 pTA1-2 96 pTA1-1 pTA1-3 97 pTA1-1 pTA1-4 96 pTA1-1 pTA1-5 96 pTA1-1 FtsZ pTSSH2 98 pTA1-2 pTA1-3 97 pTA1-2 pTA1-4 97 pTA1-2 pTA1-5 96 pTA1-2 FtsZ pTSSH2 97 pTA1-3 pTA1-4 97 pTA1-3 pTA1-5 97 pTA1-3 FtsZ pTSSH2 97 pTA1-4 pTA1-5 96 pTA1-4 FtsZ pTSSH2 96 pTA1-5 FtsZ củapTSSH2 96 Kết phân tích tiếp t c cho thấy thêm khác biệt, VK Pseudomonas sp sản xuất pederin từ kiến ba khoang P fulcipes VK Chloroflexi sản xuất onnamide từ bọt biển T swinhoei 44 Mặc dù pederin onnamide có cơng thức hóa học tương tự nhau, VK sản xuất chúng lại thuộc hai ngành hoàn toàn khác nhau, Chloroflexi Proteobacteria Đây tượng chuyển gen ngang (Horizontal gene transfer - HGT) Trong tự nhiên, HGT thường xảy để truy n v t liệu di truy n VK, VK không thuộc chi Nhờ v y, VK tăng khả thích nghi với u kiện mơi trường sống thay đổi di truy n tính trạng qua hệ KẾT LUẬN Ngoài gen onn mã hóa onnamide, nhi u gen khơng mã hóa cho PKS phân l p từ hệ gen tồn phần T swinhoe Trong số đó, ftsZ mã hóa protein tubulin - like gen ứng viên ti m để nghiên cứu v v t chủ sản xuất onnamide chúng có trình tự bảo tồn cao VK Theo phân tích này, v t chủ ftsZ, v t chủ sản xuất onnamide, thuộc ngành Chloroflexi Hơn nữa, việc phát nhi u biến thể gen ftsZ từ VK khác thuộc ngành Chloroflexi từ hệ gen toàn phần T swinhoei chứng củng cố cho giả thuyết có nhi u chủng VK khác chịu trách nhiệm sản xuất onnamide So sánh hai hệ thống sản xuất PKS có cấu trúc tương tự nhóm gen mã hóa pederin nhóm gen mã hóa onnamide cho thấy chúng có nguồn gốc từ hai ngành VK hồn toàn khác nhau, Proteobacteria cộng sinh với loài kiến ba khoang P fuscipes Chloroflexi cộng sinh với loài bọt biển T swinhoei TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 TÀI LIỆU THAM KHẢO Haygood MG, Schmidt EW, Davidson SK, Faulkner DJ Microbial symbionts of marine invertebrates: Opportunities for microbial biotechnology J Mol Microbiol Biotechnol 1999, (1), pp.33-43 Taylor MW, Radax R, Steger D, Wagner M Sponge-associated microorganisms: Evolution, ecology, and biotechnological potential Microbiol Mol Biol Rev 2007, 71 (2), pp.295-347 Piel J, Hui D, Wen G, Butzke D, Platzer M, Fusetani N et al Antitumor polyketide biosynthesis by anuncultivatedbacterial symbiont of the marine sponge Theonella swinhoei Proc Natl Acad Sci USA 2004, 101, pp.16222-16227 Lee KH, Nishimura S, Matsunaga S, Fusetani N, Horinouchi S, Yoshida M Inhibition of protein synthesis and activation of stress-activated protein kinases by onnamide A and theopederin B, antitumor marine natural products Cancer Sci 2005, 96 (6), pp.357-364 Corton JC, Ward JE Jr Lutkenhaus J Analysis of cell division gene ftsZ (sulB) from Gram-negative and Gram-positive bacteria J Bacteriol 1987, 169, p.1-7 Bacteriologists: Webster's Quotations, Facts and Phrases, ed I.G International 2008: ICON Group International, Inc Proksch P, Muller WE G Frontier in marine biotechnology Horizonbioscience 2006 Bewley CA, Holland ND, Faulkner DJ Two classes of metabolites from Theonella swinhoei are localized in distinct populations of bacterial symbionts Experientia 1996, 52 (7), pp.716-722 45 ... 97 pTA 1-2 pTA 1-4 97 pTA 1-2 pTA 1-5 96 pTA 1-2 FtsZ pTSSH2 97 pTA 1-3 pTA 1-4 97 pTA 1-3 pTA 1-5 97 pTA 1-3 FtsZ pTSSH2 97 pTA 1-4 pTA 1-5 96 pTA 1-4 FtsZ pTSSH2 96 pTA 1-5 FtsZ củapTSSH2 96 Kết phân tích. .. khác sản xuất Bảng 4: So sánh trình tự ftsZ Trình tự Tên Trình tự Tên Tỷ lệ tƣơng đồng (%) pTA 1-1 pTA 1-2 96 pTA 1-1 pTA 1-3 97 pTA 1-1 pTA 1-4 96 pTA 1-1 pTA 1-5 96 pTA 1-1 FtsZ pTSSH2 98 pTA 1-2 pTA 1-3 ... khoang tổng hợp onnamide bộc lộ Paederus fulcipes [3] gen onn - gen ftsZ nằm li n k Từ T swinhoei, 22 loại onnamide thuộc Phân tích trình tự nucleotid ftsZ nhóm hợp chất polyketide - nonribosomal