Nghiên cứu được tiến hành với mục tiêu nhằm đánh giá tác dụng cải thiện sự suy giảm trí nhớ của Cao chiết toàn phần từ búp non lá trà xanh (TX) trên chuột nhắt. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết.
Trang 1KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CẢI THIỆN SỰ SUY GIẢM TRÍ NHỚ
CỦA CAO CHIẾT TRÀ XANH (CAMELLIA SINENSIS)
TRÊN CHUỘT NHẮT
Nguyễn Hải Hà*, Dương Phước An*, Trần Lê Tuyết Châu*, Trần Phi Hoàng Yến*
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: EGCG, một trong những hoạt chất polyphenol chính của Trà xanh (TX), đã được chứng
minh có khả năng bảo vệ tế bào não chống lại bệnh Alzheimer Đề tài này được thực hiện nhằm góp phần khẳng định khả năng cải thiện sự suy giảm trí nhớ của Cao chiết TX bằng mô hình gây suy giảm trí nhớ sử dụng trimethyltin, một tác nhân gây tổn thương tế bào vùng hải mã não chuột và làm rối loạn chức năng nhận thức và nhớ
Mục tiêu: Đánh giá tác dụng cải thiện sự suy giảm trí nhớ của Cao chiết toàn phần từ búp non lá trà
xanh (TX) trên chuột nhắt
Phương pháp: Áp dụng mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin (TMT) để đánh giá khả năng
cải thiện sự suy giảm trí nhớ của Cao chiết búp non lá trà xanh sử dụng mô hình Mê cung bơi (Morris Water Maze - MWM) và thông qua việc xác định các chỉ số sinh hóa (Acetylcholine và Acetylcholinesterase)
Kết quả: Hai liều cao chiết toàn phần từ TX (30 mg/kg, và 60 mg/kg, p.o x 14 ngày) đều thể hiện khả
năng chống lại tác dụng suy giảm học hỏi và ghi nhớ do TMT liều duy nhất (2,4 mg/kg, i.p) thông qua 3 thử nghiệm của mô hình MWM: Thử nghiệm ẩn chân đế (Hidden Platform Test, p < 0,01 khi so giữa nhóm TMT với TX60 + TMT); thử nghiệm thăm dò (Probe Test, p < 0,01 khi so giữa nhóm TMT và TX30 + TMT hoặc nhóm TX60 + TMT); và thử nghiệm trí nhớ hoạt động (Working Memory Test, p < 0,05 khi so giữa nhóm TMT với TX30 + TMT; p < 0,01 khi so giữa nhóm TMT với nhóm TX60 + TMT) Kết quả định lượng acetylcholine (Ach) và Acetylcholinesterase (AchE) trong vùng hải mã cũng tương ứng với kết quả đạt được
từ các thử nghiệm hành vi Cả hai liều thử nghiệm Cao chiết TX đều thể hiện khả năng phục hồi sự giảm nồng độ Ach (p < 0,01) và sự gia tăng AchE (p < 0,01) do TMT gây ra
Kết luận: Cao chiết toàn phần từ búp non lá trà xanh thể hiện khả năng cải thiện sự suy giảm học hỏi
và ghi nhớ qua mô hình MWM và hiệu quả này có liên quan đến hệ cholinergic, làm tăng Ach và giảm hoạt tính AchE trong vùng hải mã não chuột
Từ khóa: Trimethyltin, suy giảm khả năng học hỏi và ghi nhớ, acetylcholine, Trà xanh
ABSTRACT
STUDY ON AMELIORATE OF MEMORY IMPAIRMENTS
BY TRA XANH EXTRACT (CAMELLIA SINENSIS) IN MICE
Nguyen Hai Ha, Duong Phuoc An, Tran Le Tuyet Chau, Tran Phi Hoang Yen
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No 1 - 2011: 118 -123
Background: EGCG, one of polyphenol compound of Green tea (Camellia sinensis) (TX), was
demonstrated to neuroprotective effect in Alzheimer’ Disease This study is carried out to assert amelioration
of memory impairment of extracts from fresh bud of TX applying memory impairments model by trimethyltin, a reagent caused degeneration of hippocampus in brain and memory and cognition dysfunction
*Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: TS Trần Phi Hoàng Yến ĐT: 0937878365 Email: tranyen73@gmail.com
Trang 2Objective: Evaluate effect of extract from fresh bud of Green tea leaf in memory impairments caused by
trimethyltin in mice
Methods: Applying trimethyltin (TMT) model for memory impairments to evaluate the effect of TX
extract using Morris Water Maze (MWM) protocol and biochemical detection (acetylcholine and acetylcholinesterase)
Results: Two doses of TX (30 mg/kg, và 60 mg/kg, p.o x 14 days) show the protective role in
impairments of learning and memory caused by TMT one dose exposure (2.4 mg/kg, i.p) by evaluation of MWM: Hidden Platform Test (p < 0.01 as compared between TMT and TX60 + TMT group); Probe Test (p
< 0.01 as compared between TMT and TX30 + TMT or TX60 + TMT group); and Working Memory Test (p
< 0.05 as compared between TMT and TX30 + TMT; p < 0.01 as compared between TMT and TX60 + TMT) Results in acetylcholine (Ach) content and Acetylcholinesterase (AchE) activity in hippocampus are correlated to results in behavior study Two doses of TX ameliorate the decreases in Ach content (p < 0.01) and increases in AchE (p < 0.01) caused by TMT
Conclusion: Extracts from fresh bud of TX leaf ameliorate memory impairments using MWM test and
this result correlates to cholinergic response, by increases in Ach content and decreases in AchE activity in hippocampus of mice
Keywords: Trimethyltin, memory impairments, acetylcholine, Green tea
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trimethyltin (TMT)(1) là hợp chất hữu cơ
của thiếc, thường dùng TMT như là chất ổn
định plastic, diệt nấm mốc trong nông nghiệp
Độc tính của TMT chủ yếu trên hệ thần kinh
trung ương, tác động chủ yếu trên vùng
Hippocampus của não chuột nhắt, làm suy
giảm chức năng nhận thức và trí nhớ, gây ra
các triệu chứng ngộ độc: khiếm thính, bồn
chồn, dễ kích động, mất điều hòa, lú lẫn, mất
định hướng, rối loạn trí nhớ ngắn hạn và dài
hạn Hiện nay, TMT được ứng dụng như một
mô hình vừa gây tổn thương tế bào thần kinh
vừa gây suy giảm trí nhớ, nhằm khảo sát các
thuốc có khả năng bảo vệ tế bào thần kinh,
chống suy giảm trí nhớ Do vậy, TMT đã được
ứng dụng trong nghiên cứu này nhằm khảo
sát khả năng cải thiện sự suy giảm trí nhớ của
Cao chiết TX, và mối liên hệ với acetylcholine,
VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Cao chiết toàn phần trà xanh
Cao chiết ethanol toàn phần từ búp non lá trà xanh đã chuẩn hóa do ThS Trần Lê Tuyết Châu* cung cấp (Hàm lượng EGCG đạt 65,3%)
Chuột thử nghiệm
Chuột nhắt trắng (đực) giống Swiss albino, trọng lượng 22 - 24 gam (khoảng 5 - 6 tuần tuổi), do Viện Vắc Xin và Sinh phẩm Y Tế Nha Trang cung cấp
Nguyên liệu, hóa chất khảo sát
Trimethyltin hydrochlorid (Sigma),
Reminyl (Hoạt chất là galantamin, Janssen); Memantine (Sigma); Coomassie [Bradford]
(Thermo fisher Scientific); Amplex® Red Acetylcholine/ Acetylcholinesterase Assay Kit (A12217-InvitrogenTM/ Molecular Probe)
Máy đo phổ hấp thu UV
U-1900 UV/VIS Spectrophotometer 200V (HITACHI), máy Elisa (Thermo Electron) và
Trang 3Thử nghiệm Morris Water Maze
Là thử nghiệm dùng để đánh giá trí nhớ
dài hạn trên chuột nhắt trắng Hồ bơi có kích
thước 1500 x 80 (cm) (đường kính x chiều cao),
chân đế kích thước 10 x 25 (cm) (đường kính x
chiều cao) Hồ bơi được đặt ở một nơi có màn
che kín, trên tấm màn che này có đặt những hình vẽ với hình thù bất kỳ tại 4 góc hồ bơi Nhiệt độ của hồ bơi phải nằm trong khoảng 27
± 2 0C trong suốt thử nghiệm(3) Thử nghiệm
mê cung bơi gồm 8 ngày thử nghiệm như sau:
Hình 1 Sơ đồ bố trí thử nghiệm mô hình Morris Water Maze
- Chuột được chia làm 6 nhóm, mỗi nhóm
từ 8-10 con, thể tích tiêm hoặc uống thuốc là 0,1
µl/ 1 gam chuột):
+ Nhóm 1: Nước muối sinh lý (Sal.; n = 8)
+ Nhóm 2: TMT (2,4 mg/kg, i.p liều duy
nhất; n = 10)
+ Nhóm 3: TX (30mg/kg, p.o x 14 ngày; n =
10) + TMT (2,4 mg/kg, i.p)
+ Nhóm 4: TX (60mg/kg, p.o x 14 ngày; n =
10) + TMT(2,4 mg/kg, i.p)
+ Nhóm 5: Memantine (MEM 2 mg/kg, i.p
x 10 ngày; n = 10) + TMT (2,4 mg/kg, i.p)
+ Nhóm 6: Galantamin (Gal 10 mg/ kg x 10
ngày, n = 10) + TMT (2,4 mg/kg, i.p)
Định lượng Ach và AchE
Nguyên tắc
Sử dụng kit Amplex Red™ để định lượng
Ach và AchE thông qua trung gian enzyme
choline oxidase xúc tác các phản ứng Ach sẽ bị chuyển thành choline dưới xúc tác của enzyme AchE, sau đó nó bị choline oxidase oxy hóa thành betain và H2O2 Dưới sự xúc tác của horseradish peroxidase (HRP), H2O2 phản ứng với 10 – acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (Amplex Red reagent) tạo chất có màu hồng
Đo cường độ huỳnh quang ở 563 nm Cường độ huỳnh quang của Amplex Red™ tỷ lệ thuận với nồng độ Ach và AchE Kết quả được biểu diễn
là số nmol Ach/ mg protein và số mU AchE hoạt động/ mg protein
Xử lý và phân tích số liệu
Số liệu được biểu diễn dưới dạng Mean ± SEM Sử dụng phương pháp phân tích ANOVA 1 hoặc 2 yếu tố với Fisher’s PLST test
Ý nghĩa thống kê được xác định khi p < 0,05
MEM 2,0 mg/ kg, i.p Gal 10 mg/ kg, i.p
TX 30 mg/ kg, TX 60 mg/ kg, (p.o)
TMT 2,4 mg/ kg, ip
14 ngày uống cao
Bắt đầu các thử nghiệm hành vi
Ngày 14
Khảo sát Ach và AchE
Ngày 9
Trang 4KẾT QUẢ
Hình 2 Sự thay đổi thời gian chuột tìm thấy chân đế giữa các nhóm chứng (Sal n = 8), TMT (TMT 2,4
mg/kg i.p chờ 7 ngày, n = 8), MEM (MEM 2,0 mg/ kg, i.p x 10 ngày, bắt đầu 3 ngày trước khi tiêm TMT, n
= 8), các nhóm uống Cao TX (TX30 và TX60 tương ứng với 2 liều 30 và 60 mg/kg/ ngày x 14 ngày, bắt đầu trước khi tiêm TMT 7 ngày, n = 8) trong thử nghiệm ẩn chân đế (Hidden Platform Test) của mô hình MWM a p<0,001 khi so với nhóm chứng, b p<0,01 khi so với nhóm TMT (Sử dụng phương pháp phân tích phương sai 2 yếu tố với Fisher’s PLST test)
Hình 3 Sự thay đổi số lần chuột bơi qua chân đế (Hình 3A) và thời gian chuột tìm thấy chân đế (Hình 3B)
giữa các nhóm chứng (Sal n = 8), TMT (Nhóm gây suy giảm trí nhớ bằng TMT 2,4 mg/ kg i.p chờ 7 ngày,
n = 8), MEM (MEM 2,0 mg/ kg i.p x 10 ngày, bắt đầu 3 ngày trước khi tiêm TMT, n = 8), các nhóm uống
0 10
20
30
40
50
60
Sal TMT MEM
TX 30
TX 60
a
b
b
0
1
1
2
2
3
Sal TMT MEM TX 30 TX 60
A Thử nghiệm thăm dò
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Sal TMT MEM TX 30 TX 60
B Thử nghiệm trí nhớ hoạt động
a
a
b
bb bb
b
Thử nghiệm ẩn chân đế
Trang 5Nhận xét
Sử dụng mô hình MWM để đánh giá tác
dụng của Cao chiết TX đối với sự suy giảm việc
học hỏi và ghi nhớ do TMT gây ra, một số kết
quả đã được ghi nhận:
Khi so với nhóm Sal., nhóm TMT làm suy
giảm khả năng học và nhớ của chuột thông qua
sự gia tăng thời gian tìm thấy chân đế trong thử
nghiệm ẩn chân đế, thử nghiệm thăm dò và thử
nghiệm trí nhớ hoạt động
Đối với thử nghiệm ẩn chân đế, chỉ liều TX
60 mg/kg làm giảm thời gian tìm thấy platform
so với nhóm TMT Cả hai liều 30 mg/kg và 60
mg/kg Cao chiết TX đều thể hiện khả năng làm
tăng số lần bơi qua chân đế (Thử nghiệm thăm dò) và làm giảm thời gian chuột tìm thấy chân
đế (Thử nghiệm trí nhớ hoạt động) Điều này chứng tỏ liều thấp TX chỉ thể hiện tác dụng bảo
vệ sự tổn thương khả năng học hỏi và ghi nhớ ở giai đoạn sau (trong thử nghiệm thăm dò và thử nghiệm trí nhớ hoạt động), trong khi liều cao hơn (60 mg/kg) thể hiện khả hiệu quả ở giai đoạn sớm của quá trình học tập thông tin mới Hiệu quả của các nhóm Cao TX kém hơn nhóm đối chứng dương MEM, một chất đã được sử dụng trong điều trị bệnh alzheimer từ mức độ nhẹ tới nặng
Hình 4 Ảnh hưởng của Cao chiết TX trên sự thay đổi nồng độ Ach (hình 4A) và nồng độ AchE (hình 4B),
sử dụng mô hình TMT a p<0,001 khi so với nhóm chứng b p < 0,001 khi so với nhóm TMT, c p < 0,05, cc p < 0,01 khi so với nhóm Gal (Sử dụng phương pháp phân tích phương sai 1 yếu tố với Fisher’s PLST test).
Nhận xét
Nồng độ Ach giảm và AchE tăng (trong
vùng hippocampus) ở thời điểm 2 ngày sau khi
tiêm TMT 2,4 mg/ kg
Điều trị bằng chất đối chứng dương Gal.,
chất ức chế cholinesterase, hoặc Cao TX 30 và
60 mg/ kg/ ngàyx 14 ngày đều thể hiện tác
dụng làm tăng Ach và giảm AchE so với
nhóm chỉ tiêm TMT Điều này chứng tỏ Gal.,
Cao TX đều có khả năng bảo vệ sự tổn thương
hệ cholinergic do TMT trong vùng hải mã
não chuột
Khả năng bảo vệ sự tổn thương hệ cholinergic (làm tăng nồng độ Ach và giảm AchE) của nhóm điều trị bằng Gal tốt hơn so với các nhóm điều trị với Cao TX với 2 liều thử nghiệm, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê
BÀN LUẬN
Cao chiết búp non lá trà xanh (60 mg/kg, p.o x 14 ngày) đã thể hiện vai trò cải thiện sự suy giảm việc học hỏi và ghi nhớ do TMT gây
ra trên chuột thực nghiệm qua mô hình đánh giá hoạt động học và nhớ vị trí không gian
0 5 10 15 20 25
Sal TMT Gal TX30 TX60
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Sal TMT Gal HNT1 HNT2
A Acetylcholine B Acetylcholinesterase
a
a
b b,cc b,cc
b b,c b,c
TX30 TX60
Trang 6Morris Water Maze (MWM), kết quả này phù
hợp với khả năng bảo vệ sự tổn thương hệ
cholinergic thông qua việc xác định nồng độ
Ach và hoạt tính enzyme AchE Điều này
chứng tỏ khả năng cải thiện hoạt động nhận
thức và nhớ của Cao TX có liên quan đến việc
cải thiện sự tổn thương hệ cholinergic, kết quả
này giúp định hướng cho những nghiên cứu
tiếp theo về khả năng bảo vệ tế bào não chống
lại sự thoái hóa tế bào thần kinh dẫn đến các
bệnh liên quan đến thoái hóa thần kinh như:
Alzheimer, Parkinson, Hungtinton…
KẾT LUẬN
Cao chiết từ búp non lá trà xanh có vai trò
cải thiện sự suy giảm việc học hỏi và ghi nhớ áp
dụng mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng
trimethyltin Tác dụng này có liên quan đến
khả năng bảo vệ sự tổn thương hệ cholinergic
Cảm ơn: Đề tài này được tài trợ kinh phí từ quỹ nghiên cứu khoa học của Sở Khoa Học và Công Nghệ TP.HCM (Năm 2010)
TÀI LIỆU THAM KHẢO
damage in the rat brain: Comparative studies using silver degeneration stains, immunocytochemistry and immunoassay for neuronotypic and gliotypic proteins”,
Neuroscience, 26: 337-361
2 Kavon R.Z et al (2005), “Green Tea
Epigallocatechin-3-Gallate (EGCG) Modulates Amyloid Precursor Protein Cleavage and Reduces Cerebral Amyloidosis in Alzheimer
Transgenic Mice”, The Journal of Neuroscience, 25(38), 8807–
8814
3 Vorhees V.C & Williams T.M (2006) Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of
learning and memory Nature Protocols 1, - 848 – 858
4 Yan X (2009), “Green tea polyphenols inhibit cognitive impairment induced by chronic cerebral hypoperfusion
via modulating oxidative stress”, The Journal of Nutritional
Biochemistry, 21(8), 741-748