Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của phức hợp nanochitosan/PLA mang nifedipine (viết tắt là tổ hợp nifedipin-PLA) trên động vật thực nghiệm. Mời các bạn cùng tham khảo.
Tạp chí y - dợc học quân số 4-2017 NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA PHỨC HỢP NANOCHITOSAN/PLA MANG NIFEDIPINE TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM Cấn Văn Mão*; Nguyễn Minh Núi** TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá độc tính cấp bán trường diễn phức hợp nanochitosan/PLA mang nifedipine (viết tắt tổ hợp nifedipin-PLA) động vật thực nghiệm Đối tượng phương pháp: cho chuột uống thuốc đánh giá ảnh hưởng thuốc lên tỷ lệ chết, số huyết học sinh hóa chức gan, thận hình ảnh mô bệnh học chức gan, thận Kết quả: với độc tính bán cấp, liều LD50 xác định có giá trị 700 mg/kg (613,94 ± 786,06) Với độc tính bán trường diễn, khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê số thể trạng chung, chức tạo máu, chức gan thận hình ảnh mơ bệnh học nhóm khơng uống thuốc nhóm uống tổ hợp nifedipine-PLA (p > 0,05) Kết luận: tổ hợp nifedipinePLA an toàn thể sống Đây tiền đề để tiếp tục nghiên cứu sử dụng tổ hợp nifedipinePLA điều trị tăng huyết áp người * Từ khóa: Nifedipine-PLA; Độc tính cấp, bán trường diễn; Động vật thực nghiệm Study of Acute and Subchronic Toxicities of Nifedipine-Embedded Nanochitosan/PLA’s in Experimental Animals Summary Objectives: To assess acute and subchronic toxicities of a drug, named nifedipine-embeded nanochitosan/PLA in experimental animals Subjects and methods: After animals were administrated the drug, we asssed effects of the drug to rates of animal deaths, gerenal conditions of animals, the complete blood count, liver and kidney functions as well as histological images of livers and kindeys in experimental aimals Results: In study of the acute toxicity, LD was 700 mg/kg (613.94 ± 786.06) In study of the subchronic toxicity, there were no significant differences in gerenal conditions of animals, the complete blood count, liver and kidney functions as well as histological images of livers and kindeys between one saline treated group and two nifedipine-PLA treated groups (p > 0.05) Conclusion: Nifedipine-PLA is safe in experimental animals This is basis for us to conduct further studies to apply nifedipine-PLA for treatment hypertensions in humans * Key word: Nifedipine-PLA; Acute, subchronic toxicities; Experimental animals ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tăng huyết áp (THA) có xu hướng tăng nước ta nguyên nhân nhiều bệnh lý biến chứng khác Một nghiên cứu cho thấy, THA chiếm tới chiếm tới 59,3% nguyên nhân gây tai biến mạch máu não [1] Những biến chứng làm tăng chi phí điều trị * Học viện Quân y ** Bệnh viện Quân y 103 Người phản hồi (Corresponding): Cấn Văn Mão (canvanmao2001@gmail.com) Ngày nhận bài: 07/01/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 20/03/2017 Ngày báo đăng: 27/03/2017 39 Tạp chí y - dợc học quân số 4-2017 gánh nặng kính tế cho gia đình xã hội Do đó, điều trị THA có ý nghĩa quan trọng việc hạn chế biến chứng gây Thuốc điều trị hiệu vấn đề quan tâm Ngành Y tế Có nhiều thuốc điều trị THA với chế tác động gây giảm huyết áp khác Trong đó, thuốc nifedipin (chẹn kênh canxi) thuốc hay dùng lâm sàng Ưu điểm nifedipine tác dụng nhanh, sau vài phút có tác dụng hạ áp ngay, nên hay sử dụng cấp cứu THA kịch phát Tuy nhiên, thời gian tác dụng nifedipine khoảng - giờ, nên sử dụng nifedipine điều trị THA thường phải sử dụng nhiều lần ngày [2] Điều dễ dẫn đến tượng tích lũy thuốc gây nhiều tác dụng không mong muốn BN bị tụt huyết áp mức (khi huyết áp khó kiểm sốt, cấp cứu tụt huyết áp trường hợp khó khăn) Để hạn chế tác dụng không mong muốn này, nhiều nghiên cứu gợi ý sử dụng loại nanoparticle chất mang, giúp kiểm soát hấp thu giải phóng nifedepine tốt [6] Dựa nguyên lý này, tổng hợp loại nanoparticle có tên chitosan/PLA gắn chitosan/PLA với nifedipine Để đảm bảo an toàn làm sở nghiên cứu sử dụng tổ hợp nifedipine-PLA người, cần đánh giá độc tính phức hợp thể sống Xuất phát từ vấn đề này, nghiên cứu đề tài nhằm mục đích: Đánh giá độc tính cấp bán trường diễn tổ hợp nifedipin-PLA động vật thực nghiệm 40 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Đánh giá độc tính cấp 48 chuột nhắt trắng (trọng lượng 18 - 22 g) đánh giá độc tính bán trường diễn 30 chuột cống trắng (trọng lượng 150 - 200 g) chủng Swiss Cả giống, khoẻ mạnh Ban Cung cấp Động vật thí nghiệm, Học viện Quân y cung cấp Chuột ni phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh lý học - ngày trước nghiên cứu, suốt thời gian nghiên cứu cho ăn thức ăn dành riêng cho chuột, uống nước tự Quy trình nghiên cứu tuân thủ nghiêm ngặt hướng dẫn chăm sóc sử dụng động vật Học viện Quân y Nguyên liệu thiết bị nghiên cứu - Tổ hợp nifedipine-PLA dạng bột Viện Kỹ thuật Nhiệt đới (Viện Khoa học Việt Nam) cung cấp, hòa tan nước muối sinh lý cho uống qua đường miệng - Dung dịch NaCl 0,9% Euro-Med (Philippine) sản xuất - Các hóa chất xét nghiệm làm tiêu mô bệnh học - Cân điện tử (Nhật Bản), độ xác 0,001 gam - Cốc chia vạch, kim cho chuột uống thuốc đầu tù - Máy sinh hóa bán tự động BTS 350 (Hãng Biosystem, Tây Ban Nha) - Máy phân tích huyết học Swelab Alpha (Hãng Swelab, Thụy Điển) Phương pháp nghiên cứu * Độc tính cấp: 48 chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành lô khác nhau, lô T Tạp chí y - dợc học quân số 4-2017 - Tình trạng chung, thể trọng chuột hợp nifedipine-PLA uống với liều tăng dần thể tích để xác định liều thấp gây chết 100% chuột liều cao không gây chết chuột (gây chết 0% chuột) Theo dõi tình trạng chung chuột, q trình diễn biến bắt đầu có dấu hiệu nhiễm độc (như nơn, co giật, kích động, tiết…) số lượng chuột chết vòng 72 sau uống thuốc Tất chuột chết mổ để đánh giá tổn thương đại thể Từ xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định LD50 thuốc thử - Đánh giá chức phận tạo máu thông qua số lượng hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu - Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan thông qua định lượng hoạt độ enzym máu: ALT, AST - Đánh giá chức thận thông qua định lượng nồng độ ure, creatinin huyết * Độc tính bán trường diễn: Các thơng số theo dõi kiểm tra vào trước lúc tiêm thuốc, sau tuần tiêm thuốc Chuột cống trắng chia làm lô, lô 10 con: - Lô chứng (n = 10): uống nước muối sinh lý ml/100 g/ngày * Mô bệnh học: Sau tuần tiêm thuốc, mổ chuột quan sát đại thể toàn quan Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, thận 30% số chuột lô Các xét nghiệm vi thể c thực Bộ môn Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Quân y 103 - Lô trị (n = 10): uống dung dịch tổ hợp nifedipine-PLA liều mg/kg - Lô trị (n = 10): uống dung dịch tổ hợp nifedipine-PLA liều 15 mg/kg (gấp lần lô 1) Chuột uống nước muối thuốc thử tuần liền, ngày lần vào buổi sáng * Phương pháp phân tích số liệu: Các số liệu xử lý thống kê theo thuật toán thống kê t-test student phần mềm Microsoft Excel, phần mềm SPSS * Các tiêu theo dõi trước trình nghiên cứu: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Độc tính cấp Chuột nhắt trắng uống dung dịch chứa tổ hợp nifedipine-PLA từ liều thấp đến liều cao Lô chuột uống đến liều 1.150 mg/kg thể trọng chuột bị chết 100%, liều 400 mg/kg thể trọng chuột bị chết 0% sau 72 uống thuốc Bảng 1: Độc tính cấp nifedipine-PLA Lơ Liều dùng (mg/kg) Số chuột thử (ni) Số chuột chết (ri) Số chuột sống (si) Tích số risi zi = 2k - - 2i Tích số rizi 400 10 - - - 550 10 21 147 700 10 24 120 41 Tạp chí y - dợc học quân số 4-2017 850 10 21 63 1.000 10 9 1.150 10 10 - - - Tính LD50 theo phương pháp cải tiến Livschitz P.Z (1986) Theo phương pháp này, xác định được: LD50 = 700 mg/kg (613,94 ± 786,06) Kết nghiên cứu tương đối phù hợp với nghiên cứu trước cho thấy LD50 nifedipine chuột nhắt từ 700 - 1.000 mg/kg [4] Tuy nhiên, có khác biệt với số tài liệu khác cho thấy LD50 chuột nhắt khoảng 200 - 300 mg/kg, khác biệt giống, chủng loại động vật thực nghiệm [7] Khác biệt LD50 chuột nhắt uống nifedipine với chuột uống tổ hợp nifedipine ảnh hưởng nanochitosan/PLA sử dụng Độc tính bán trường diễn * Ảnh hưởng thuốc thể trạng chung động vật: Trong thời gian thí nghiệm, chuột lơ hoạt động bình thường, ăn uống tốt, nhanh nhẹn, lông mượt, mắt sáng, phân khô Bảng 2: Ảnh hưởng nifedipine-PLA đến thể trọng chuột Lơ chứng Thời gian Trọng lượng (g) Trước thí nghiệm 180,26 ± 7,83 Sau tuần thí nghiệm 195,13 ± 8,02 p trước - sau > 0,05 Sau tuần thí nghiệm 208,49 ± 7,85 p trước - sau < 0,05 Lô trị % tăng trọng Trọng lượng lượng (g) Lô trị % tăng trọng lượng Trọng lượng (g) 177,68 ± 9,81 ↑8,25 190,40 ± 8,52 182,65 ± 10,86 ↑7,15 195,59 ± 11,09 > 0,05 ↑15,66 202,97 ± 9,96 % tăng trọng lượng ↑ 7,08 > 0,05 ↑14,23 206,63 ± 9,11 < 0,05 ↑13,13 < 0,05 Sau tuần thí nghiệm, trọng lượng chuột lơ tăng so với trước nghiên cứu có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Trọng lượng chuột lô uống dung dịch chứa tổ hợp nifedipine-PLA tăng so với lô chứng sinh học, nhiên khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) * Ảnh hưởng thuốc đến chức tạo máu: Bảng 3: Thay đổi chức tạo máu trước sau uống thuốc Chỉ số Số lượng hồng cầu (T/L) 42 Ngày thứ Kết p Lô chứng Lô trị Lô trị Trước uống 6,03 ± 0,22 5,74 ± 0,35 5,93 ± 0,25 > 0,05 Sau uống tuần 5,95 ± 0,40 5,80 ± 0,31 5,49 0,33 > 0,05 Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 4-2017 Hàm lượng huyết sắc tố (g/dl ) Số lượng bạch cầu (G/l) Trước uống 12,72 ± 0,55 11,90 ± 0,63 12,40 ± 0,61 > 0,05 Sau uống tuần 12,51 ± 0,67 11,84 ± 0,96 11,61 ± 0,84 > 0,05 Trước uống 5,14 ± 0,81 4,68 ± 0,63 4,98 ± 1,05 > 0,05 Sau uống tuần 5,09 ± 0,78 4,58 ± 0,60 4,76 ± 0,70 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 ptrước-sau Sau tuần thí nghiệm, xét nghiệm đánh giá chức tạo máu (số lượng hồng cầu, hàm lượng huyết sắc tố, số lượng bạch cầu lô trị (uống nifedipine-PLA liều mg/kg/ngày) lô trị (uống tổ hợp nifedipine-PLA liều 15 mg/kg/ngày) khác biệt ý nghĩa so với lơ chứng so sánh thời điểm trước sau uống thuốc thử (p > 0,05) Điều chứng tỏ tổ hợp nifedipine-PLA liều từ - 15 mg/kg không làm ảnh hưởng đến chức tạo máu [2, 3, 4] * Ảnh hưởng thuốc đến chức gan, thận: Bảng 4: Thay đổi số đánh giá chức gan thận Chỉ số Hoạt độ AST (UI/L) Hoạt độ ALT (UI/L) Ure (mg/dl) Creatinin (mg/dl) p trước-sau Ngày thứ Kết p Lô chứng Lô trị Lô trị Trước uống 101,20 ± 21,10 122,00 ± 14,47 130,12 ± 14,38 > 0,05 Sau uống tuần 93,81 ± 9,66 113,39 ± 17,80 121,10 ± 19,73 > 0,05 Trước uống 35,57 ± 10,13 38,57 ± 19,99 20,46 ± 8,65 > 0,05 Sau uống tuần 36,69 ± 10,19 39,44 ± 20,05 21,13 ± 8,97 > 0,05 Trước uống 7,74 ± 0,87 8,64 ± 3,12 7,90 ± 3,69 > 0,05 Sau uống tuần 7,41 ± 1,06 7,50 ± 1,51 7,11 ± 1,78 > 0,05 Trước uống 55,17 ± 7,50 64,39 ± 3,86 67,40 ± 5,14 > 0,05 Sau uống tuần 61,54 ± 8,84 70,99 ± 9,92 65,20 ± 7,06 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 - Về chức gan: sau tuần thí nghiệm, xét nghiệm đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan (hoạt độ AST, ALT máu chuột) lô trị (uống nifedipine-PLA liều mg/kg/ngày) lô trị (uống nifedipine-PLA liều 15 mg/kg/ngày) không khác biệt có ý nghĩa so với lơ chứng so sánh hai thời điểm trước sau uống thuốc thử (p > 0,05) Điều chứng tỏ tổ hợp nifedipine-PLA liều - 15 mg/kg thời gian tuần không gây tổn thương tế bào gan không ảnh hưởng đến chức tạo mật gan chuột [3, 4, 9] - Về chức thận: sau tuần thí nghiệm, lơ trị (uống nifedipine-PLA liều mg/kg/ngày) lô trị (uống nifedipine-PLA liều 15 mg/kg/ngày), nồng độ ure creatinin máu chuột khơng thay đổi khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng Tương tự, số không khác biệt lô hai thời điểm trước sau tuần thí nghiệm (p > 0,05) Điều chứng tỏ tổ hợp nifedipine-PLA liều - 15 mg/kg tuần không gây tổn thương thận ảnh hưởng lên chức thn trờn chut [10] 43 Tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 4-2017 * Thay đổi mơ bệnh học gan thận trước sau uống thuốc : - Quan sát đại thể: tất chuột thực nghiệm (cả lô chứng lô trị), không quan sát thấy có thay đổi bệnh lý Lơ chứng mặt đại thể quan tim, phổi, gan, lách, tuỵ, thận hệ thống tiêu hoá chuột - Quan sát vi thể: + Hình ảnh vi thể gan: Lơ trị Lơ trị Hình 1: Hình ảnh vi thể gan trước sau uống thuốc Ở lô chứng: tiểu thùy gan rõ cấu trúc khoảng cửa với ống mật, động mạch tĩnh mạch; bè gan xếp hướng mao mạch trung tâm tiểu thùy Các tế bào gan có nhân tròn, đều, chất màu mịn, hạt nhân nhỏ, bào tương bị thối hóa hốc Các tế bào Kuffer tăng sinh Ở lô uống thuốc (lô trị lô trị 2): tiểu thùy gan rõ cấu trúc khoảng cửa với ống mật, động mạch tĩnh mạch; bè gan xếp hướng mao mạch trung tâm tiểu thùy Các tế bào gan có nhân tròn, đều, chất màu mịn, hạt nhân nhỏ, bào tương bị thối hóa hốc Các tế bào Kuffer tăng sinh Trong tiểu thùy có số ổ xâm nhiễm tế bào viêm lympho Tĩnh mạch gan xung huyết + Hình ảnh vi thể thận Lô chứng Lô trị Lô trị Hình 2: Hình ảnh vi thể thận trước sau uống thuốc Lô chứng: cấu trúc thận rõ vùng vỏ vùng tủy Cầu thận rõ cấu trúc cuộn mạch với mao mạch chứa hồng cầu, khoang Bowman khơng chứa dịch Một số nơi thấy cấu trúc máy cận cầu thận Các ống lượn gần với tế bào biểu 44 mơ có nhân tròn mịn, bào tương màu hồng Các ống lượn xa lòng tự Các mạch máu khe thận xung huyết Lô uống thuốc (lô trị lô trị 2): cấu trúc thận rõ vùng vỏ vùng tủy Cầu thận rõ cấu trúc cuộn mạch với mao T¹p chí y - dợc học quân số 4-2017 mch chứa hồng cầu, khoang Bowman không chứa dịch Một số nơi thấy cấu trúc máy cận cầu thận Các ống lượn gần với tế bào biểu mô có nhân tròn mịn, bào tương màu hồng Ống lượn xa lòng tự do, mạch máu khe thận xung huyết Như vậy, nifedipine-PLA liều mg/kg/ngày liều 15 mg/kg/ngày (liều cao gấp lần) cho chuột uống tuần liên tục không gây ảnh hưởng đến mơ bệnh học gan, thận chuột (hình ảnh mơ bệnh học chuột dùng nifedipine-PLA nằm giới hạn bình thường, khơng có khác biệt rõ rệt so với lô chứng) [4, 11] KẾT LUẬN Nghiên cứu độc tính cấp tính bán trường diễn tổ hợp nifedipine-PLA động vật thực nghiệm, kết cho thấy: - Với độc tính cấp tính: liều LD50 700 mg/kg/24 (613,94 ± 786,06) chuột nhắt trắng - Với độc tính bán cấp: thuốc thử nifedipine-PLA liều mg/kg/ngày liều 15 mg/kg/ngày khơng gây độc tính bán trường diễn chuột cống, cho chuột uống tuần liên tục Cân nặng, chức tạo máu, mức độ hủy hoại tế bào gan, chức thận mô bệnh học gan, thận nằm giới hạn bình thường, khơng có khác biệt rõ rệt so với lô chứng TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Văn Đăng Điều tra dịch tễ học tai biến mạch máu não cộng đồng bệnh viện Công trình cấp (1989 1994) 1994 Nguyễn Thế Khánh, Phạm Tử Dương Xét nghiệm sử dụng lâm sàng Nhà xuất Y học 2001 Vũ Đình Vinh Hướng dẫn sử dụng xét nghiệm sinh hoá Nhà xuất Y học 2001, tr.115-287 Đinh Thị Lam, Nguyễn Trần Thị Giáng Hương, Đỗ Thị Phương, Phạm Thị Vân Anh, Mai Phương Thanh Độc tính bán trường diễn cao xoa Bách xà động vật thực nghiệm TCNCYH 2016, 99 (1), tr.32-39 Cohan J.A, Checcio L.M Nifedipine in the management of hypertensive emergencies: report of two cases and review of the literature Am J Emerg Med 1985, (6), pp.524-530 Lim L.T, Auras R, Rubino M Processing technologies for poly (lactic acid) Prog Polym Sci 2008, 33 (8), pp.820-885 AA PHARMA INC Product monograp nifedipine, toxicology, acute toxicity studies 2010, p.22 Cayman Chemical Company Safety datasheet nifedipine Toxicological Information 2012, section 11 Ragunath M.P Sasmal D Comparative evaluation of hematology and biochemistry before and after administration of nifedipine and isoxsuprine in the treatment of preterm labor International Journal of Pharmaceutical and Clinical Research 2015, (3), pp.212-215 10 Guido Bel linghier, Giampiero Mazzaglia, Vincenzo Savica, Domenico Santoro Effects of manidipine and nifedipine on blood pressure and renal function in patients with chronic renal failure: A multicenter randomized controlled trial Renal Failure 2003, 25 (5), pp.681-689 11 World Health Organization Working group on the safety and efficacy of herbal medicine, Report of regional office for the western pacific of the World Health Organization 2000 45 ... này, nghiên cứu đề tài nhằm mục đích: Đánh giá độc tính cấp bán trường diễn tổ hợp nifedipin-PLA động vật thực nghiệm 40 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Đánh giá độc tính. .. so với lơ chứng) [4, 11] KẾT LUẬN Nghiên cứu độc tính cấp tính bán trường diễn tổ hợp nifedipine- PLA động vật thực nghiệm, kết cho thấy: - Với độc tính cấp tính: liều LD50 700 mg/kg/24 (613,94... nifedipine với chuột uống tổ hợp nifedipine ảnh hưởng nanochitosan/PLA sử dụng Độc tính bán trường diễn * Ảnh hưởng thuốc thể trạng chung động vật: Trong thời gian thí nghiệm, chuột lơ hoạt động