Đang tải... (xem toàn văn)
Những bệnh lý thần kinh xảy ra từ sự suy thoái tế bào thần kinh tùy thuộc vị trí não và chức năng của nhóm tế bào đặc biệt. Trimethyltin gây độc có chọn lọc lên tế bào thần kinh ở một số vùng não và gây suy giảm trí nhớ. Việc xác định sự suy thoái tế bào thần kinh do trimethyltin trên chuột nhắt là cần thiết để nghiên cứu những yếu tố tổn thương liên quan.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 KHẢO SÁT TẾ BÀO THẦN KINH Ở MỘT SỐ VÙNG NÃO SUY THOÁI VÀ SỰ THAY ĐỔI YẾU TỐ HỖ TRỢ DINH DƯỠNG THẦN KINH BDNF DO TRIMETHYLTIN (TMT) TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG Nguyễn Quỳnh Hương**, Nguyễn Phương Dung*, Kiyokazu Ogita** TÓM TẮT Mục tiêu: Những bệnh lý thần kinh xảy từ suy thóai tế bào thần kinh (TBTK) tùy thuộc vị trí não chức nhóm tế bào đặc biệt Trimethyltin (TMT) gây độc có chọn lọc lên TBTK số vùng não gây suy giảm trí nhớ Việc xác định suy thóai TBTK TMT chuột nhắt cần thiết để nghiên cứu yếu tố tổn thương liên quan Phương pháp: Đối tựơng: Chuột nhắt trắng (đực), giống Std-ddY, trọng lượng 30-35g, tuần tuổi (Osaka, Nhật Bản).Nguyên vật liệu: Trimethyltin clorid (TMT) – Wako Pure Chemical Industries Ltd (Nhật) Fluoro Jade B – Millipore, Mỹ Kháng thể đa dòng vơ tính anti-BDNF (brain-derived neurotrophic-factor) (AB1779SP) từ Chemicon (Millipore), kháng thể anti-rabbit biotin hóa (Vector Laboratories, USA) Diaminobenzidin (DAB)/ Hydrogen peroxid Histofine, Ninirei Co (Nhật) Kết quả: Từ kết nhuộm Fluoro Jade B: TBTK suy thối biểu Fluoro Jade B tìm thấy chủ yếu vùng hồi răng; bên cạnh vùng hành khứu giác, vùng hạch khứu giác trước lớp tế bào vùng vỏ não sau tiêm TMT.Từ kết nhuộm BDNF: TMT gây nên giảm biểu BDNF số tế bào vùng vỏ não vùng hành khứu giác gây tăng biểu vùng hồi Kết luận: TMT gây diện TBTK suy thoái nhận biết với Fluoro Jade B đặc hiệu vùng hồi răng, vùng hành khứu giác, hạch khứu giác trước, lớp vùng vỏ não theo thời gian sau tiêm TMT Cơ chế suy thoái tế bào thần kinh vùng chưa xác định chi tiết.Ngồi ra, vai trò BDNF mơ hình gây độc thần kinh với TMT ghi nhận tùy thuộc vào vùng não.Đây phần kết nghiên cứu, nội dung lại đề cập tiếp báo khác Từ khóa: suy thối tế bào thần kinh, trimethyltin ABSTRACT PARTIAL STUDY ABOUT NEURODEGENERATIVE REGIONS AND THE CHANGE IN BNDF EXPRESSION INDUCED BY TRIMETHYLTIN (TMT) IN MICE Nguyen Quynh Hương, Nguyen Phuong Dung, Kiyokazu Ogita * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No - 2014: 162 - 168 Objective: Mental diseases occur as the result of neurodegeneration depending on brain parts and the function of specific neurons.Trimethyltin (TMT) induces neuro-toxicity selectively in several brain parts; therefore it induces memory deficit Determining neurodegenerative regions induced by TMT in mice is necessary to study more about the involved harmful factors Method: Male mice of week old age, Std-ddY strain, weigh from 30 – 35g from Osaka, Japan Trimethyltin chloride (TMT) – Wako Pure Chemical Industries Ltd (Osaka, Japan) Fluoro Jade B – Millipore, Temecula, CA, USA Rabbit polyclonal antibody against BDNF (brain-derived neurotrophic-factor) (AB1779SP) from Chemicon ∗ Khoa Y Học Cổ Truyền, Đại học Y Dược TP HCM *+ Bộ môn Dược lý, Đại học Setsunan Osaka, Nhật Bản Tác giả liên lạc: DS Nguyễn Quỳnh Hương ĐT: 0933192602 Email: qhbeta@gmail.com 162 Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học (Millipore), biotinylated secondary antibody against rabbit IgG (Vector Laboratories, CA, USA) Diaminobenzidine (DAB)/ Hydrogen peroxide Histofine, Ninirei Co (Tokyo, Japan).Drug administration: Adult male Std-ddY mice, weighing 30 – 35 g and weeks of age, were breed with free access to food and water for at least days before use.Animals were intraperitoneally injected with TMT (2.8 mg/kg) dissolved in phosphatebuffered saline, and then returned to their home cages until the time of decapitation Histological assessment and immunohistochemical procedure: Mice were deeply anesthetized with pentobarbital (250 mg/kg, i.p.) and intracardially perfused with saline and then 4% (wt/v) paraformaldehyde Post-fixed brains were embedded in paraffin, a cut as sagittal sections of 1- to 3-μm thickness with a microtome, and placed on MAS-coated slide glasses The paraffin-embedded brain sections were deparafinized with xylene, ethanol of 100% to 50% (v/v), and water.Sections so obtained were subjected to specific desired antibody following protocols of their manufacturers Stained sections were viewed with an Olympus U-LH100HG microscope Results: Result of Fluoro Jade B staining: Fluoro Jade B (+) neuronal cells was present predominantly in the dentate gyrus; positively in the olfactory bulb, in the anterior olfactory nucleus and in the cortical superficial layers after TMT injection.Result of BDNF immunostaining: TMT induced a decrease of BDNF expression in cortical and olfactory neurons Meanwhile, BDNF (+) neurons were enhanced in the dentate gyrus by TMT Conclusion: Here we showed that TMT produced an expression of Fluoro Jade B in the dentate gyrus, olfactory bulb, anterior olfactory nucleus and partial cerebral cortex of the mice The mechanism of neurodegeneration was still defined poorly Moreover, the role of BDNF in TMT neurotoxicity was suggested probably region-specific Keywords: neurodegeneration, trimethyltin, BDNF ĐẶT VẤN ĐỀ factor) (AB1779SP) từ Chemicon (Millipore) Những bệnh lý thần kinh xảy từ suy thoái tế bào thần kinh (TBTK) tùy thuộc vị trí não chức nhóm tế bào đặc Diaminobenzidine (DAB)/ Hydrogen peroxide Histofine, Ninirei Co (Nhật) Phương pháp nghiên cứu biệt.Trimethyltin (TMT) gây độc có chọn lọc lên Mơ hình gây suy thối thần kinh TMT: TBTK số vùng não gây suy giảm trí Chuột nhắt tuần tuổi, giống Std-ddY từ 30-35g nhớ Việc xác định suy thoái TBTK TMT (Osaka, Nhật Bản) nuôi chuồng kim chuột nhắt cần thiết để nghiên cứu lọai phòng có chu kỳ sáng/ tối 12h/ 12h, độ yếu tố tổn thương liên quan ẩm 55%, nhiệt độ 23˚C Chuột ăn uống tự ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU để ổn định thể chất ngày trước thí nghiệm Chuột tiêm phúc mô với TMT liều 2.8 mg/kg thả chuồng Đối tựơng lúc mổ chuột lấy não theo số thời điểm tính Chuột nhắt trắng (đực), giống Std-ddY, trọng lượng 30-35g, tuần tuổi (Osaka, Nhật) Nguyên vật liệu từ lúc tiêm Những thí nghiệm tiến hành lặp lại tối thiểu lần (n = 4) Khảo sát mô học: Mẫu não cố định Trimethyltin chloride (TMT) – Wako Pure paraffin cắt theo phương đối xứng dọc Chemical Industries Ltd (Nhật) Fluoro Jade B lớp có độ dày 1-3 μm Lớp não cắt dán – Millipore, Mỹ Kháng thể đa dòng vơ tính phiến kính phủ MAS (Kyoto, Nhật) Quy anti-BDNF trình (brain-derived Chuyên Đề Dược Học neurotrophic- nhuộm mơ theo hóa miễn dịch 163 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 xử lý loại bỏ paraffin ngâm qua xylen-cồn từ Sự suy thoái TBTK TMT nhận biết FJB vùng vỏ não(cerebral cortex) 100% - 50%-nước cất Phiến kính ngâm 10 Vỏ não chi phối chức thần kinh cao cấp mM hệ natri phosphate (pH = 7,0) ủ tủ ấm nhận thức, cảm giác, trí nhớ.TBTK vùng vỏ 10 phút đến 100˚C, rửa với TBST (Tris-buffered não có hình dạng phong phú ví dụ hình saline Tween), ngâm với H2O2 0,03% (stellate), hạt (granular), tháp (pyramidal) TMT methanol phút Sau ủ với huyết tương dê gây suy thối khơng vùng hồi mà 5% TBST, mẫu ủ với kháng thể lớp vùng vỏ não (hình 2) kháng BDNF qua đêm nhiệt độ 4˚C.Ngày hơm Sự suy thối TBTK TMT nhận biết FJB vùng hành khứu giác - HKG (olfactory bulb, OB) hạch khứu giác trước HKGT (anterior olfactory nucleus, AON) (immunohistochemistry) BDNF: Mẫu não sau tiếp tục ủ với kháng thể tương thích anti-rabbit biotin-hóa Cuối cùng, mẫu quan sát chụp hình kính hiển vi sau xử lý với DAB/ hydrogen peroxidase Phương pháp nhuộm Fluoro Jade B: Fluoro Tương tự kết báo cáo(4), TMT đồng thời Jade B (FJB) thuốc nhuộm đặc hiệu cho TBTK gây suy thoái TBTK hành khứu giác bị suy thối Quy trình lọai bỏ lớp paraffin cố vùng lân cận hạch khứu giác trước định mẫu tiến hành tương tự qua dung mơi phóng to hình xylen-cồn Theo hướng dẫn nhà FJB 0,0004%, sau rửa nước cất lần BDNF (brain-derived neurotrophic factor) số vùng não chuột thử nghiệm tiêm TMT phút/ lần Sau để khô, mẫu ngâm BDNF biểu khác vùng não xylen phút Mẫu quan sát chụp chuột khơng tiêm TMT TMT gây giảm biểu hình lại kính hiển vi huỳnh quang Hình BDNF vùng có suy thối ảnh từ chuột chứng làm để phân vỏ não (4a) HKG (4c) vùng hồi biệt vùng não khác ngược lại (4b) cung cấp, vòng 20 phút mẫu ủ với KẾT QUẢ Ở chuột chứng, BDNF biểu dày tế Sự suy thoái TBTK TMT nhận biết FJB vùng hồi (dentate gyrus) bào vỏ não hành khứu giác Trong 1-3 ngày sau tiêm TMT, TBTK hạt chuột tiêm TMT, BDNF bị số tế vùng hồi biểu FJB thân (soma) tế bào vỏ não (đánh dấu mũi tên màu đen), bào, sợi trục (axon) TBTK hạt vùng hồi tăng số tế bào (granular) biểu thị FJB tăng dần đến ngày thứ BDNF (+) ngày thứ 10 Ở HKG, BDNF giảm dần sau (Hình 1) giảm biểu ngày dần phục hồi biểu vài tế bào vùng hồi Ở ngày thứ 10 164 Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học TMT (2,8 mg/kg, tiêm phúc mơ) Hình 1: FJB TBTK vùng hồi chuột chứng tiêm TMT Ô viền trắng xanh định hình ảnh phóng to tương ứng TBTK suy thoái biểu FJB số ngày sau tiêm TMT.Tỉ lệ hình 200 μm Chuyên Đề Dược Học 165 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Hình 2: FJB vỏ não chuột chứng tiêm TMT Phần thân TBTK hạt, hay tháp biểu FJB phóng to viền vàng.Đôi FJB biểu phần trục (axon) TBTK vỏ não biểu FJB tìm thấy sau thời điểm TBTK vùng hồi suy thối Hình 3: TBTK suy thoái biểu FJB hành khứu giác (OB) xuất trước, sau thể vùng lân cận (AON) chuột thử nghiệm tiêm phúc mô TMT 2,8 mg/kg 166 Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học Hình 4: BDNF chuột chứng (ngày 0) sau tiêm TMT sâu vùng tìm thấy biểu FJB BÀN LUẬN BDNF thuộc nhóm neurotrophin ghi Mơ hình nghiên cứu thần kinh với nhận hỗ trợ dinh dưỡng cho TBTK thời kỳ trimethyltin (TMT) ứng dụng rộng rãi đầu trình phát triển(7,3) BDNF biểu nước(5) Căn độc tố khác vỏ não, vùng hồi răng, thần kinh gây nên tổn thương dạng suy HKG chuột không tiêm tiêm TMT có thối khó xác định(2,1) Trong báo cáo này, thể thấy vai trò BDNF phụ thuộc vào chúng tơi cung cấp hình ảnh cụ thể việc áp khu vực não riêng dụng FJB thành công tiên lợi để phát KẾT LUẬN suy thối đặc biệt TBTK (chứ khơng phải tế bào thần kinh đệm -neuroglia) Cho đến Mơ hình gây tổn thương TBTK suy giảm ngày thứ 3, FJB biểu đặc biệt TBTK trí nhớ TMT áp dụng điều vùng hồi HKG HKGT tương tự kiện nghiên cứu Việt Nam hữu hiệu(Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.) Fluoro kết báo cáo trước đây(4) Sau ngày thứ 3, FJB tìm thấy TBTK tháp lẫn TBTK không Jade B marker đặc hiệu q trình suy thối phải tháp vùng vỏ não Như vậy, TMT gây TBTK (neurodegeneration) tìm thấy nên tổn thương TBTK số vùng não chuột nhắt tiêm TMT(0) TMT – gây – suy bộ.TBTK biểu FJB khơng tìm thấy thối TBTK số vùng chọn lọc vùng vùng khác não tủy (pons and hồi răng, lớp vùng vỏ não medulla), tiểu não (cerebellum) Những yếu tố hành khứu giác hạch khứu giác trước chuột suy thối thần kinh cần nghiên cứu thử nghiệm Cơ chế suy thoái nằm TBTK nhận Chuyên Đề Dược Học 167 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 biết FJB vai trò BDNF vùng não cần nghiên cứu sâu hơn.Đây phần kết nghiên cứu, nội dung lại đề cập tiếp báo khác TÀI LIỆU THAM KHẢO 168 Chang LW (1986), “Neuropathology of trimethyltin: a proposed pathogenetic mechanism” Fundamental Applied Toxicology 6:217-232 Geloso MC, Corvino V, Michetti F (2011), “Trimethyltininduced hippocampal degeneration as a tool to investigate neurodegenerative processes” Neurochem Int (Epub ahead of print) PMID: 21414367 Han BH, Holtzman DM (2000), “BDNF protects the neonatal brain from hypoxic-ischemic injury in vivo via the ERK pathway” Journal of Neuroscience 20:5775-5781 Kawada K, Yoneyama M, Nagashima R, Ogita K(2008), “In vivo acute treatment with trimethyltin chloride causes neuronal degeneration in the murine olfactory bulb and anterior olfactory nucleus by different cascades in each region” J Neurosci Res 86:1635–1646 Ogita K, Nitta Y, Watanabe M, Nakatani Y, Nishiyama N, Sugiyama C, Yoneda Y (2004), “In vivo activation of c-Jun Nterminal kinase signaling cascade prior to granule cell death induced by trimethyltin in the dentate gyrus of mice” Neuropharmacology 47(4):619-630 Schmued LC, Hopkins KJ (2000), “Fluoro-Jade B: a high affinity fluorescent marker for the localization of neuronal degeneration” Brain Research 874(2):123-130 Yamada K, Nabeshima T (April 2003) "Brain-derived neurotrophic factor/TrkB signaling in memory processes" J Pharmacol Sci 91(4):267–270 Ngày nhận báo: 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo: 24.12.2013 Ngày báo đăng: 10.03.2014 Chuyên Đề Dược Học ... thối TBTK số vùng chọn lọc vùng vùng khác não tủy (pons and hồi răng, lớp vùng vỏ não medulla), tiểu não (cerebellum) Những yếu tố hành khứu giác hạch khứu giác trước chuột suy thối thần kinh cần... BDNF vùng có suy thối ảnh từ chuột chứng làm để phân vỏ não (4a) HKG (4c) vùng hồi biệt vùng não khác ngược lại (4b) cung cấp, vòng 20 phút mẫu ủ với KẾT QUẢ Ở chuột chứng, BDNF biểu dày tế Sự. .. hình gây suy thối thần kinh TMT: TBTK số vùng não gây suy giảm trí Chuột nhắt tuần tuổi, giống Std-ddY từ 30-35g nhớ Việc xác định suy thoái TBTK TMT (Osaka, Nhật Bản) nuôi chuồng kim chuột nhắt