Đang tải... (xem toàn văn)
Nội dung bài viết trình bày nội dung về xây dựng quy trình tổng hợp dẫn chất 1-(2,6-diclorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on (tạp chất A) của diclofenac dùng trong kiểm nghiệm. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học TỔNG HỢP 1-(2,6-DICHLOROPHENYL)-1,3-DIHYDRO-2HINDOL-2-ON (TẠP CHẤT A) CỦA DICLOFENAC NATRI ĐỂ LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU Nguyễn Thị Thanh Trà*, Hà Di u Ly**, Nguyễn Hữu Lạc Thủy*, Trần Thành Đạo* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Sự có mặt tạp chất liên quan lượng nhỏ nguyên liệu hay chế phẩm thuốc ảnh hưởng đến hiệu mức độ an toàn dược phẩm Do vậy, x{c định giới hạn tạp chất liên quan yêu cầu thiếu tiêu chuẩn kiểm nghiệm thuốc Mục tiêu: Xây dựng quy trình tổng hợp dẫn chất 1-(2,6-diclorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on (Tạp chất A) Diclofenac dùng kiểm nghiệm Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Tạp A diclofenac tổng hợp từ natri diclofenac phản ứng oxi hóa đóng vòng mơi trường acid, xúc tác ánh sáng hỗ trợ vi sóng Sản phẩm tinh chế sắc ký cột (Si-60) v| x{c định cấu trúc sản phẩm phương ph{p phổ nghiệm UV, IR, MS 1H-NMR 13C-NMR Kết quả: Tổng hợp tạp A diclofenac độ tinh khiết cao h|m lượng 98,21% so với tạp chuẩn A (USP) Kết luận: Quy trình điều chế tạp A diclorofenac đơn giản áp dụng điều kiện phòng thí nghiệm với hiệu suất khoảng 53% Sản phẩm có độ tinh khiết cao đạt yêu cầu chất lượng nguyên liệu đối chiếu Từ khóa: Tạp A diclofenac, tổng hợp, tạp đối chiếu ABSTRACT SYNTHESIS OF 1- (2,6-DICHLOROPHENYL)-1,3-DIHYDRO-2H-INDOL-2-ONE (IMPURITY A) OF DICLOFENAC SODIUM AS REFERENCE MATERIAL Nguyen Thi Thanh Tra, Ha Dieu Ly, Nguyen Huu Lac Thuy, Tran Thanh Dao * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018: 521 - 527 Background: The presence of very small amounts of impurities in the active ingredients or in the dosage forms may affect the effectiveness and safety to the patients Therefore, determining the level of related impurities is an indispensable requirement in the specifications of substances and products Objectives: Setting up a prosedure for synthesis of 1-(2,6-dichlorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2-one used as reference impurity for testing quality of diclofenac medicines Methods: A impurity of diclofenac was synthesized from sodium diclofenac by oxidation in acide medium under accelerated by microwave and sunlight The product was purified by column chromatography (Si-60) and the structure of final product was determined by UV, IR, MS and 1H-NMR and 13C-NMR spectroscopy Results:A impurity of diclofenac was obtained with a high purity of 98.21% compared to standard A impurity (USP) Conclusions: A simple procedure for synthesis of diclofenac A impurity was developted successfully in laboratory conditions with an overall yield of 53% The product has a high purity of 98.21% which satisfies requirements for establishment of reference materials * Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh ** Viện Kiểm nghiệmThuốc, Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS TS Trần Th|nh Đạo ĐT: 0903716482 Chuyên Đề Dƣợc Email: daott@ump.edu.vn 521 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Keywords: Diclofenac A impurity, synthesis, reference impurity báo chúng tơi trình bày kết tổng hợp 1ĐẶT VẤN ĐỀ (2,6-dichlorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on Hiện nay, c{c nh| m{y dược phẩm (Tạp chất A diclofenac natri) hướng đến thiết nước sản xuất thuốc với nguồn nguyên liệu lập chất tạp đối chiếu chủ yếu nhập Do đó, kiểm nghiệm chất ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU lượng nguyên liệu l| điều cấp thiết, đặc biệt tạp chất liên quan Yêu cầu nghiêm ngặt Dẫn chất 1-(2,6-diclorophenyl)-1,3-dihydrovề tạp chất tổ chức quốc tế đưa v| 2H-indol-2-on gọi tạp A diclofenac chủ đề hội Hóa chất nghị quốc tế để thống nguyên tắt Nguyên liệu diclofenac natri, Số lô: DA006; Q3A (R), Q3B (R) Q3C ICH hạn dùng: 2/2017; nơi sản xuất: Ấn Độ Tạp A Sựcó mặt tạp chất liên quan lượng diclofenac natri chuẩn USP, Số lơ: USP/LOM 175, nhỏ ảnh hưởng đến hiệu lực mức h|m lượng 99%, nguyên trạng Methanol độan toàn dược phẩm Các tạp chất chuẩn (HPLC), ethyl acetat (PA)của JT Baker, acid dùng kiểm nghiệm nguyên liệu phosphoric 85%, acid hydrocloric 37%, acid chưa tổng hợp sản xuất nhiều Việt sulfuric 98%, natri dihydro phosphat PA, Nam, phải mua đắt phụ thuộc mỏng silica gel F254 (Merck), silica gel cỡ hạt 60nhiều từ bên thời gian đặt mua, 200mm dùng cho sắc ký cột đó, đ}y l| vấn đề nhiều xí nghiệp dược Thiết bị Việt Nam quan tâm Lò vi sóng Hitoshi G-475AW, máy hồng Diclofenac, thuộc nhóm kháng viêm, giảm ngoại Thermo-Science, máy sắc ký lỏng đau khơng steroid l| nhóm Shimadzu LC-20A với detector PDA, máy DSCthuốc sử dụng nhiều Theo BP 2014, Q20, m{y đo khối phổ tứ cực LC-MS/MS Agilent diclofenac có tạp chất li n quan, tạp A 1200 nguồn ESI, cột Inersil C18 (250 mm x 4,6 vừa sản phẩm trung gian vừa sản phẩm mm, m), m{y đo cộng hưởng từ hạt nhân phân hủy trình sản xuất(2) Vì vậy, Bruker 500 MHz (Viện Hóa học, viện Hàn lâm dược điển USP, BP EP hành, qui KH&CN Việt Nam) định phảikiểm soát tạp Atrong nguyên liệu Phƣơng pháp nghiên cứu thành phẩm Tạp diclofenac tổng hợp theo sơ đồ Với mong muốn tạo chất chuẩn tạp phục vụ cho cơng tác kiểm nghiệm để giảm chi phí sản xuất gi{ th|nh sản phẩm, Sơ đồ 1: Phản ứng tổng hợp tạp A diclofenac 522 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Giai đoạn Chuyển hoàn toàn diclofenac natri thành diclofenac để hạn chế tối đa tạp hình thành phẩn ứng tổng hợp tiếp theo(2,3) Cân khoảng 12 g diclofenac natri, thêm khoảng 500 ml dung dịch HCl 10% vào bình Bucher 1L, khuấy mạnh liên tục Kết tủa dạng acid diclofenac xuất Lọc lấy tủa Kết tinh diclofenac 300 ml methanol, sấy sản phẩm 60oC 12 Sản phẩm thu đem đo phổ IR v| DSC để định tính v| x{c định độ tinh khiết (điểm chảy diclofenac 178,8oC)(5) Giai đoạn 2: Tổng hợp tạp A từ diclofenac Dựa theo tài liệu nghi n cứu, diclofenac môi trường acid, t{c động vi sóng xảy phản ứng đóng vòng hình thành tạp A(2,3,4) Cố định tỷ lệ (g/ml) chất diclofenac thể tích acid sulfuric 1: 10 Tiến hành khảo sát công suất lò từ 50W, 150W, 250W, với nồng độ acid sulfuric 20%, 30%, 40% 50% thời gian phản ứng khoảng thời gian 2, 4, 6, 10 phút để chọn điều kiện tổng hợp thích hợp Tinh chế: Sản phẩm tổng hợp tinh chế qua sắc kí cột tr n pha tĩnh hấp phụ (silica gel Si60), dung môi rửa giải ethyl acetat 100% X{c định cấu trúc: X{c định c{c phương pháp phổ nghiệm 1H-NMR, 13C-NMR, IR so s{nh c{c số liệu phổ có với tài liệu tham khảo(3) Xác định độ tinh khiết: Độ tinh khiết sản phẩm tổng hợp x{c định HPLCvới điều kiện sắc ký tu}n theo điều kiện kiểm nghiệm tạp A nguyên liệu diclofenac natri USP 35(6) Dung dịch đệm phosphat pH 2.5: Trộn thể tích tương đương acid phosphoric 0.01 M v| natri hydrophosphat 0.01 M Pha động: Hỗn hợp methanol v| đệm phosphat pH 2.5 (700:300) Chuyên Đề Dƣợc Nghiên cứu Y học Dung môi: Methanol:Nước (70:30) Cột: d|i 0.25 m, đường kính 4.6 mm Pha tĩnh: octylsilyl silica gel (5 µm) Pha động: Hỗn hợp methanol v| đệm phosphat pH 2.5 (700:300) Tốc độ dòng:1 ml/phút ước sóng phát hiện: 254 nm Thể tích tiêm mẫu: 10 µl Sử dụng chế độ Max plot giúp phát pic tạp chất tồn thang sóng 190 – 800 nm Sử dụng chức kiểm tra độ tinh khiết pic để x{c định độ tinh khiết pic KẾT QUẢ Gi i đoạn 1: Chuyển hoàn toàn diclofenac natri thành diclofenac dạng acid Thu 9,8 g kết tinh trắng, xốp Phổ IR cho c{c dao động đặc trưng tương ứng với diclofenac, điểm chảy 178,8oC phù hợp với điểm chảy diclofenac Tiến hành đo DSC để x{c định độ tinh khiết sản phẩm 99,5 % Gi i đoạn 2: Tổng hợp tạp A diclofenac Khảo sát yếu tố cơng suất lò vi sóng Cân khoảng 1,0 g diclofenac thu vào bình nón 100 ml, thêm vào bình 10 ml H2SO4 20%, tiến hành phản ứng với công suất 50W, 150W, 250W phút Mỗi phản ứng thực lần, trích lấy mẫu phản ứng để tiến hành HPLC, sử dụng tạp chuẩn A diclofenac làm chất đối chiếu x{c định hiệu suất phản ứng dựa vào % diện tích pic tạp A sắc ký đồ Lấy khoảng ml dung dịch phản ứng chiết ml x lần cloroform, l|m bay dịch cloroform cắn hòa tan pha động theo điều kiện HPLC (Hình 1) Tạp hình thành nhiều công suất 150W, công suất 250W sau 10 giây ngun liệu bị carbon hóa hồn tồn Chọn công suất 150W công suất để thực phản ứng 523 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học 50W 150W Hình 1: Kết khảo sát công suất phản ứng Khảo sát yếu tố nồng độ dung dịch H2SO4 Cân khoảng 1,0 g diclofenac vào bình nón 100 ml, thêm vào bình 10 ml dung dịch H2SO4 nồng độ khác (20%, 30%, 40% 50%) Tiến hành phản ứng công suất 150W phút Mỗi phản ứng thực lần, trích lấy mẫu phản ứng để tiến hành HPLC để x{c định hiệu suất phản ứng Tạp hình thành nhiều với dung dịch H2SO4 40%, dung dịch H2SO4 50%, sau 20 giây ngun liệu bị carbon hóa hồn tồn Chọn dung dịch H2SO4 40% để thực phản ứng tổng hợp Hình 2: Kết khảo sát nồng độ acid sulfuric phản ứng 524 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Khảo sát yếu tố thời gian phản ứng Hình 3: Kết khảo sát thời gian phản ứng Cân khoảng g diclofenac vào bình nón 100 ml, thêm vào bình 10 ml H2SO4 40% tiến hành phản ứng công suất 150W khoảng thời gian 2, 4, 6, 10 phút Mỗi phản ứng thực lần, trích lấy mẫu phản ứng tiến h|nh HPLC để x{c định hiệu suất phản ứng Tạp diclofenac tạo thành nhiều với thời gian phút Ở thời gian sau 10 phút tạp khác bắt đầu xuất nhiều Qui trình tổng hợp tạp A diclofenac Cân khoảng 6g diclofenac vào bình nón 200ml, thêm vào 60 ml dung dịch H2SO4 40%, đặt vào lò vi sóng cơng suất 150W phút, hỗn hợp phản ứng tạo th|nh thu khối dẻo màu vàng (5,4 g) Hiệu suất khoảng 90% Tinh chế Sắc ký cột (50 x 10 cm), silica gel (60-200 µm), dung môi rửa giải ethyl acetat, kiểm tra phân đoạn SKLM với hệ dung môi ethyl acetat - Chuyên Đề Dƣợc methanol (8:2), phát vết đèn UV 254 nm, đối chiếu với vết chuẩn tạp A diclofenac USP, thu ph}n đoạn có chứa tạp A (3,2 g) ký hiệu DFA Hiệu suất tồn q trình tổng hợp tinh chế 53,3% Xác định cấu trúc Tính chất Tinh thể màu trắng, điểm chảy: 251 oC(6) Phổ IR cho c{c dao động 1731cm-1 (nhóm C= O vòng lactam), 1612 cm-1 (C-N), 782, 749 cm-1 (C-Cl), ứng với phổ IR tạp A diclofenac USP Phổ ESI-MS sản phẩm tổng hợp có m/z = 299,9958 [M+Na]+; M phù hợp với công thức phân tử tạp A: C14H9Cl2NO (M = 278,1338) Phổ 1H-NMR DFA cho tín hiệu cộng hưởng vòng 2,6 diclorophenyl: [H = 7,51ppm (d; 2H; J = 8,0 Hz), H-3’; H-5’+, *H = 7,34 ppm (t; 1H; J = 6,5 Hz J = 7,0 Hz), H-4’+; Vòng 1,3 dihydro - 2H -indol - on: [H = 7,38 ppm (d; 1H; J = 8,0 Hz), H-9], [H = 7,20 ppm (t; 1H; J = 7,5 Hz J = 7,5 Hz), H-8], [H = 7,09 ppm (t; 1H; J = 525 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 7,5 Hz J = 7,5 Hz), H-7], [H = 6,40 ppm (d; 1H; J = 7,5 Hz), H-6] proton methylen -CH2 C-3 có H = 3,78 Phổ 13C-NMR DFA cho tín hiệu cộng hưởng:173,6 (C-2); 35,73 (C-3); 124,3 (C-4); 143,3 (C-5); 109,2 (C-6); 129,03 (C-7); 123,05 (C-8); 124,8 (C-9); 135,5 (C-1’); 130,5 (C-2’, C-6’); 130,8 (C-3’, C-5’); 127,9 (C-4’).Từ kết phổ MS, IR, NMR, khẳng định DF điều chế tạp A (1-(2,6-diclorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2on) diclofenac natri Pha dung dịch tạp A có nồng độ 500 µg/ml Tiến hành sắc ký lặp lại lần kết RSD thông số sắc ký nhỏ 2%, As khoảng 0,8 – 1,5; Rs ≥ 1,5 Như qui trình x{c định độ tinh khiết tạp đạt tính phù hợp hệ thống Hàm lượng tạp A Theo điều kiện triển khai HPLC, h|m lượng tạp A tổng hợp l| 98,21% nối từ chuẩn USP số lô LOM 175, hàm lượng 99%, nguyên trạng Xác định độ tinh khiết tạp A Tính phù hợp h thống Hình 4: Sắc ký đồ DFA BÀN LUẬN Tạp A diclofenac natri sản phẩm đóng vòng diclofenac tác dụng nhiệt độ môi trường acid, tác dụng siêu âm vi sóng tạp A xuât nhiều Qui trình tổng hợp tìm điều kiện tối ưu để có hiệu suất tối đa, đồng thời phương pháp tách tinh chế chất tổng hợp khác với tài liệu, nhanh gọn Các tác nhân cho phản ứng đóng vòng chất dễ tìm, rẻ tiền, máy móc đơn giản Tạp A chất tan nước tan tốt dung môi hữu cloroform, ethyl acetat, methanol Vì thử kết tinh tạp A 526 methanol môi trường nước Nhưng kết tinh thu không nên phải tinh chế săc ký cột cổ điển Pha động để rửa giải tạp A sắc lý cột cổ điển sau lựa chọn dung môi khác ethyl acetat 100%, dung môi an toàn Đối với tạp E, thử nghiệm phản ứng tổng hợp dựa theo nguồn gốc phát sinh tài liệu tổng hợp, phản ứng hiệu suất thấp Hơn nữa, tạp E thị trường rẻ nên lựa chọn cách mua tạp E để tinh chế Tạp E tan cloroform, methanol, ethyl acetat, tan chậm nước thử tinh chế tạp E phương pháp kết tinh không thành cơng Chun Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 nên lựa chọn phương pháp tinh chế sắc ký cột cổ điển Pha động để rửa giải tạp A sắc lý cột cổ điển sau lựa chọn dung môi khác cloroform: methanol (99:1) KẾT LUẬN Từ nguyên liệu đầu natri diclofenac, qua bước tổng hợp 1-(2,6-diclorophenyl)1,3-dihydro-2H-indol-2-on gọi tạp A diclofenac Sản phẩm cuối chứng minh cấu trúc phương ph{p phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR H|m lượng tạp đạt 98,21% so sánh với chất chuẩn tạp A USP diclofenac HPLC TÀI LIỆU THAM KHẢO Nghiên cứu Y học Görög S, (2000), “Identification and Determination of Impurities in Drugs” Elsevier Science, e ook IS N: 9780080534404 Pages 772 Palomo ME, allesteros MP, Frutos P (1999), “ nalysis of diclofenac sodium and derivatives”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 21, 83 – 94 Somashekar PL, Sanjay Pai PN, Rao G (2013), “Synthesis and Characterization of Specified Impurities of ceclofenac”, Chem Sci Trans, 2(3),813-820 Tudja P, Khan MI, Mestrovic E, Horvat M, Golja P (2001), “Thermal ehaviour of Diclofenac Sodium: Decomposition and Melting Characteristics”, Chem Pharm Bull, 49(10) 1245— 1250 United States Pharmacopoeia 37 (2014) Electronic Edition, Diclorofenac sodium Ngày nhận báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o đăng: 15/03/2018 British Pharmacopoeia 2014, Diclofenac sodium Electronic Edition Chuyên Đề Dƣợc 527 ... phẩm Tạp diclofenac tổng hợp theo sơ đồ Với mong muốn tạo chất chuẩn tạp phục vụ cho công tác kiểm nghiệm để giảm chi phí sản xuất gi{ th|nh sản phẩm, Sơ đồ 1: Phản ứng tổng hợp tạp A diclofenac. .. 2018 Giai đoạn Chuyển hoàn toàn diclofenac natri thành diclofenac để hạn chế tối đa tạp hình thành phẩn ứng tổng hợp tiếp theo(2,3) Cân khoảng 12 g diclofenac natri, thêm khoảng 500 ml dung dịch... nh| m{y dược phẩm (Tạp chất A diclofenac natri) hướng đến thiết nước sản xuất thuốc với nguồn nguyên liệu lập chất tạp đối chiếu chủ yếu nhập Do đó, kiểm nghiệm chất ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU