Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá cấu trúc siêu vi của tế bào gốc (TBG) trung mô não giữa chuột cống trắng trước và sau nuôi cấy. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 CẤU TRÚC SIÊU VI CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ NÃO GIỮA CHUỘT CỐNG TRẮNG NUÔI CẤY Nguyễn Thanh Hoa*; Nguyễn Thị Bình* Nguyễn Phúc Hồn*; Nguyễn Mạnh Hà* TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá cấu trúc siêu vi tế bào gốc (TBG) trung mô não chuột cống trắng trước sau nuôi cấy Đối tượng phương pháp: phẫu tích lấy mơ sàn não phôi chuột cống trắng 12,5 - 13,5 ngày tuổi, tạo thành dịch treo tế bào (TB) nuôi cấy mơi trường DMEM/F12 có bổ sung yếu tố tăng trưởng, kháng sinh kháng nấm tủ 37 C 5% CO2 Sau - ngày ni cấy, TB tăng sinh nhanh phủ kín phiến nuôi cấy Làm tiêu hiển vi điện tử quan sát kính hiển vi điện tử quét xuyên Kết quả: nơ ron có cấu trúc siêu vi điển hình với đầy đủ bào quan bào tương Các nhánh nơ ron dài tạo liên kết synap với nơ ron khác Kết luận: nuôi cấy làm tăng sinh trưởng thành TB mơ sàn não * Từ khóa: Sàn não giữa; Ni cấy tăng sinh; Biệt hố; Cấu trúc siêu vi Ultrastructure of Rat Embryonic Ventral Mesencephalic Precursor Cells in Culture Summary Objectives: To investigate ultrastructure of rat ventral mesencephalic precursor cells before and after culture Subjects and methods: Dissected the ventral mesencephalon of rat embryos on day 12.5 - 13.5, then created cell suspension and expansion cultured in DMEM/F12 medium supplemented with growth factors, antibiotics, antifungal After - days of culture, precursor cells proliferated quickly to completely cover culture disk Samples were prepared and observed under the scanning and transmission electronmicroscope Results: Neurons contained particular ultrastrutures with many organelles, elongated processes and synaptic contact with another neurons Conclusion: Ventral midbrain precursor cells cultures were proliferative and differentiated into neurons after - days * Keywords: Vetral mesencephalon; Proliferation; Differentiation; Ultrastruture ĐẶT VẤN ĐỀ Parkinson bệnh thối hóa thần kinh phổ biến thứ hai sau bệnh Alzheimer, đặc trưng thối hóa TB thần kinh tiết dopamin đường thể vân - liềm đen não Bệnh Parkinson có nhiều phương pháp điều trị Hiện nay, việc ứng dụng công nghệ TBG vào điều trị phương pháp mang lại nhiều triển vọng cho bệnh Parkinson Phương pháp có nhiều ưu điểm vượt trội khơng 213 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 * Trường Đại học Y Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Bình (nguyenthibinh_mp@yahoo.com.vn) Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 27/08/2017 Ngày báo đăng: 30/08/2017 cải thiện triệu chứng lâm sàng bệnh, mà làm ngừng tiến triển bệnh Các TBG ngoại bì thần kinh bào thai ghép vào thể vân biệt hóa thành TB sản xuất dopamin, tạo synap với TB thần kinh người bệnh [3] Các nơ ron tiết dopamin chiếm khoảng 1% tổng số nơ ron n o, đóng vai trò quan trọng nhiều chức não vận động tự chủ, giải phóng hormon thần kinh nội tiết, nhận thức, điều khiển hành vi cảm xúc, stress trí nhớ Khi số lượng TB thần kinh bị giảm sút dẫn đến nhiều rối loạn thần kinh nghiêm trọng, bật bệnh Parkinson [4] Ở người, số lượng TB thần kinh tiết dopamin ít, khoảng 400.000 Ở động vật có vú, TB tiết dopamin phân chia thành nhóm, nằm rải rác từ não tới hành khứu Theo Nguyễn Thanh Hoa CS (2015), sàn não phôi chuột cống trắng nơi tập trung nhiều TB tiết dopamin [2] Mỗi lần ghép để điều trị Parkinson cần tới 40.000 TBG ngoại bì thần kinh não để có số lượng TB cần tới não phôi [5, 6] Vì vậy, ni cấy để tăng sinh số lượng nơ ron nói chung số lượng nơ ron tiết dopamin cần thiết Các TB sàn não thay đổi sau nuôi cấy in vitro? Để trả lời câu hỏi này, tiến hành nghiên cứu nhằm: - Nghiên cứu cấu trúc siêu vi mô sàn não phôi chuột cống trắng - Nghiên cứu cấu trúc siêu vi TB sàn não phôi chuột cống trắng sau nuôi cấy in vitro 180 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu - 10 mẫu mô sàn não phôi chuột cống trắng 12,5 - 13,5 ngày tuổi - 10 mẫu TBG trung mô sàn não phôi chuột cống trắng sau nuôi cấy - ngày Phƣơng pháp nghiên cứu - Tạo phôi chuột 12,5 - 13,5 ngày tuổi (20 phơi) - Phẫu tích lấy sàn não (20 mảnh) - Dùng Dispase II , trypsin - EDTA lực học để tạo dịch treo TB (10 mẫu) - Nuôi cấy môi trường bản: DMEM/F12 có bổ sung thêm yếu tố tăng trưởng, kháng sinh, kháng nấm - Cấy TBG ngoại bì thần kinh não phôi chuột với mật độ 1,5 x 104 cm2 giếng nuôi cấy chai flask, tủ ấm 370C, 5% CO2 - Thay môi trường ngày/lần, đồng thời đánh giá phát triển TB kính hiển vi soi - Các mảnh mô sàn não mẫu TB nuôi cấy làm tiêu hiển vi điện tử: + Cố định glutarandehyt 2,5%/ cacodylate 0,1 M, pH 7,2 - 7,4 qua đêm 40C + Rửa mẫu dung dịch cacodylate 0,1 M (15 phút/lần x lần) + Cố định axít osmic 1%/cacodylate 0,1 M nhiệt độ phòng + Rửa mẫu cacodylate 0,1 M 15 phút x lần TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 + Kính hiển vi điện tử xuyên: khử nước, đúc block, cắt lát mỏng 30 - 40 nm, nhuộm uranyl acetate 10 phút citrate chì phút + Kính hiển vi điện tử quét: khử nước, phủ vàng - Chỉ tiêu nghiên cứu: hình thái siêu cấu trúc TB bào quan trước sau nuôi cấy KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Cấu trúc siêu vi sàn não phôi chuột 12,5 - 13,5 ngày tuổi A B C D Hình 1: Sàn não phôi chuột cống trắng 12,5 -13,5 ngày tuổi (Ty thể (Mi), lưới nội bào có hạt (RER), đám glycogen (Gl), golgi (Gol), nhân TB (Nu)) Các TB nằm sát dạng biểu mơ (hình 1A) Tỷ lệ nhân/bào tương TB cao Trong bào tương TB, số lượng bào quan chất vùi tăng r rệt: lưới nội bào có hạt dài, lòng rộng, mặt ngồi ribosom bám; ty thể nhiều đa dạng; golgi điển hình; glycogen tập trung thành đám lớn (hình 1B, C) Một số TB có hình thái TBG với nhân lớn, bào tương bào quan (hình 1D) 215 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QN SỰ SỐ CHUN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Hình 2: Các nhánh bào tương nơ ron sàn n o phôi chuột cống trắng 12,5 - 13,5 ngày tuổi (Ty thể (Mi), lưới nội bào có hạt (RER), nhánh bào tương (*)) Các TB biệt hóa thành nơ ron có nhánh bào tương Trong nhánh có nhiều tơ thần kinh số bào quan lưới nội bào có hạt ty thể Một số nhánh bào tương có phần tận phình to tiếp xúc với TB khác Tuy nhiên, chưa quan sát thấy hình ảnh tạo synap TB (hình 2A, B, C) Siêu cấu trúc TB sàn não chuột cống trắng sau nuôi cấy - ngày 216 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Hình 3: TB mơ sàn não nuôi cấy ngày (A: liên kết nơ ron; B: nhánh bào tương (*); C: nón tăng trưởng (*); D: synap nơ ron; E: bào tương nơ ron; F: nguyên bào thần kinh; Ty thể (Mi), lưới nội bào có hạt (RER), nhân TB (Nu)) Các nơ ron liên kết với chằng chịt nguyên bào thần kinh đệm nằm lớp áo (hình 3A) Nhánh bào tương nơ ron Các TBG ngoại bì thần kinh não nhiều dài (hình 3B) Đầu bắt đầu phát triển, tăng sinh biệt hóa nhánh phình to, tiếp xúc với nơ ron khác xuất TB thần kinh xuyên (hình 3C) Nhiều chỗ đ hình thành tâm Nhiều nghiên cứu cho thấy: synap với cấu trúc điển hình (hình 3D) TB biệt hóa thành nơ ron tiết dopamin sau [7, 8, 9] Ở thời điểm Trong bào tương, lưới nội bào có hạt phôi 12,5 - 13,5 ngày tuổi, sàn não phát triển, thành có nhiều ribosom bám TB đứng sát Trong bào (hình 3E) Một số TB giữ tính gốc với tương TB, bào quan lưới nội bào, biểu nhân to, bào tương bào quan ty thể, golgi phát triển Xen (hình 3F) TB có nhánh bào tương có xơ thần kinh Theo Sturrock R.R (1982), BÀN LUẬN nhánh bào tương TB thần kinh đệm Trong q trình phát triển phơi thai, giai đoạn phát triển sợi trục máng thần kinh khép thành ống thần nơ ron [10] Có nhánh bào kinh biểu mô gồm hàng TB gọi tương có đầu tận phình to tiếp biểu mô thần kinh Ở não giữa, thành não xúc với nhánh thân TB khác Đây dày lên tăng sinh mạnh TB biểu hình ảnh nón tăng trưởng mơ làm thành ống có dạng biểu mơ trụ Điều chứng tỏ, sàn não phôi giả tầng, gồm loại TB nguyên bào chuột 12,5 - 13,5 ngày tuổi TB đ xốp nguyên bào thần kinh Các nguyên di cư Tuy nhiên, quan sát kính bào thần kinh di cư vùng ngoại vi hiển vi điện tử, chưa thấy tạo thành ống thần kinh Sự di cư, biệt synap TB thành não giữa, hóa TB chia thành ống q trình biệt hóa thành nơ ron thành lớp: lớp nội tủy, lớp áo lớp chưa kết thúc rìa Những nguyên bào thần kinh 217 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Khi tiến hành nuôi cấy, dùng enzym tác động học để ly giải mô sàn não thành dịch treo TB Trong dịch treo gồm hỗn hợp loại TB dạng gốc phát triển giai đoạn khác Sau nuôi cấy - ngày, TB tăng sinh nhanh chóng Trong chai ni cấy, chúng tơi thấy có đám TB dạng biểu mơ, TB nhánh, TB nơ ron Theo thời gian, nơ ron xuất nhiều, nhánh dài liên kết với chằng chịt quan sát kính hiển điện tử quét Trên lát cắt siêu vi mẫu nuôi cấy, thấy nơ ron phát triển giai đoạn khác nhau: có nơ ron giữ ngun tính gốc, có nơ ron có nhánh ngắn, có nơ ron với nhánh tạo thành nón tăng trưởng Đặc biệt, chúng tơi đ quan sát thấy synap tạo thành nơ ron Như vậy, sau - ngày nuôi cấy đ xuất nơ ron biệt hóa hồn tồn Trong số nơ ron có nơ ron dương tính với marker TH, marker đặc hiệu cho TB thần kinh tiết dopamin Điều chứng tỏ số TBG đ biệt hoá thành nơ ron tiết dopamin sau nuôi cấy KẾT LUẬN Quan sát kính hiển vi điện tử, chúng tơi nhận thấy: - Các TB sàn não phôi chuột cống trắng 12,5 - 13,5 ngày tuổi đ bắt đầu di cư biệt hóa, biệt hóa nơ ron chưa hồn tồn - Ni cấy in vitro làm tăng sinh trưởng thành TB mô sàn não chuột cống trắng 218 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Văn Chương Bệnh học thần kinh NXB Y học Hà Nội 2011 Nguyễn Thanh Hoa, Nguyễn Thị Bình, Nguyễn Mạnh Hà Biến đổi siêu cấu trúc não phôi chuột cống trắng 10,5 - 13,5 ngày tuổi Tạp chí Y học Việt Nam 2015, (433), tr.35-39 Brundin P, Kordower J.H Neuropathology in transplants in Parkinson’s disease: Implications for disease pathogenesis and the future of cell therapy Prog Brain Res 2012, 200, pp.221-241 Chinta S.J, Andersen J.K Dopaminergic neurons The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 2005, 37 (5), pp.942-946 Olanow C.W, Goetz C.G, Kordower J.H, Stoessl A.J, Sossi V et al A double-blind controlled trial of bilateral fetal nigral transplantation in Parkinson’s disease Ann Neurol 2003, 54, pp.403-414 Lindvall O, Bjorklund A Cell Therapeutics in Parkinson’s Disease Neurotherapeutics 2011 Ono Y, Nakatani T, Sakamoto Y et al Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells Development 2007, 134 (17), pp.3213-3225 Shults C.W, Hashimoto R, Brady R.M et al Dopaminergic cells align along radial glia in the developing mesencephalon of the rat Neuroscience 1990, 38 (2), pp.427-436 Hebsgaard J.B, Nelander J, Sabelstrom H et al Dopamine neuron precursors within the developing human mesencephalon show radial glial characteristics Glia 2009, 57 (15), pp.1648-1658 10 Sturrock R.R A scanning and transmission electron microscopic study of the embryonic ... hành nghiên cứu nhằm: - Nghiên cứu cấu trúc siêu vi mô sàn não phôi chuột cống trắng - Nghiên cứu cấu trúc siêu vi TB sàn não phôi chuột cống trắng sau nuôi cấy in vitro 180 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP... cứu: hình thái siêu cấu trúc TB bào quan trước sau nuôi cấy KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Cấu trúc siêu vi sàn não phôi chuột 12,5 - 13,5 ngày tuổi A B C D Hình 1: Sàn não phôi chuột cống trắng 12,5 -13,5... nghiên cứu - 10 mẫu mô sàn não phôi chuột cống trắng 12,5 - 13,5 ngày tuổi - 10 mẫu TBG trung mô sàn não phôi chuột cống trắng sau nuôi cấy - ngày Phƣơng pháp nghiên cứu - Tạo phôi chuột 12,5 - 13,5