Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xác định đặc điểm siêu vi thể của màng ối và quần thể tế bào màng ối. Phương pháp: màng ối sau khi thu thập, xử lý và làm sạch được đánh giá về mặt cấu trúc bằng kính hiển vi điện tử.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC SIÊU VI THỂ CỦA MÀNG ỐI NGƢỜI Nguyễn Bảo Trân*; Đỗ Minh Trung**; Nguyễn Duy Bắc** Nguyễn Viết Trung***; Trần Hải Anh**; Phạm Văn Trân***; Trần Ngọc Anh** TÓM TẮT Mục tiêu: xác định đặc điểm siêu vi thể màng ối quần thể tế bào màng ối Phương pháp: màng ối sau thu thập, xử lý làm đánh giá mặt cấu trúc kính hiển vi điện tử Kết quả: tế bào biểu mô màng ối thường tế bào biểu mô đơn liên kết với màng đáy theo dạng bán liên kết không hồn tồn, dễ phân tách trypsin * Từ khóa: Màng ối; Tế bào gốc; Tế bào biểu mô màng ối Ultrastructural Characteristics of the Human Amniotic Membrane Summary Objectives: To study the ultrastructural characteristics of the human amnion membrane Methods: After collecting and cleaning in phosphate buffered saline (PBS) and then fixed in 5% glutaraldehyde fixative for electron microscopy, amniotic membrane was assessed the ultrastructural Results: The epithelium is formed of one layer of cuboidal cells which are attached with the underlying basal by hemidesmosomes These cells are isolated by trypsine easily * Keywords: Amniotic membrane; Ultrastructure; Amniotic Epithelia cells ĐẶT VẤN ĐỀ Màng ối hình thành từ phơi ngồi có nguồn gốc từ khối nội bào vào ngày thứ sau thụ tinh Màng ối cấu tạo màng chính: màng biểu mơ đơn (single epithelial layer), màng dày (basement membrane) màng vơ mạch (avascular mesenchyme) Màng ối khơng có thần kinh, mạch máu hay bạch huyết, nằm sát khoang ối (amniotic cavity) tế bào phôi (trophoblast cell), dễ dàng phân tách khỏi màng đệm (chorion), nằm Màng ối ni dưỡng dinh dưỡng oxy từ dịch ối bao xung quanh mạch máu thai Màng ối sản phẩm thường bỏ trình sinh nở, nguồn cung cấp màng sinh học cung cấp nguồn tế bào gốc lý tưởng Sử dụng màng tế bào gốc màng ối không gặp phải vấn đề đạo đức, x hội Các tế bào gốc phân lập từ màng ối có tính sinh miễn dịch thấp, khơng có khả ung thư hóa, có khả biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác Ðặc biệt, màng ối xem nguồn cung cấp mô hay tế bào phù hợp cấy ghép dựa hiệu chống viêm tính sinh miễn dịch thấp [2] * Đại học Y Dược Hải Phòng ** Học viện Quân y *** Bệnh viện Quân y 103 Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Bảo Trân (nbtran@hpmu.edu.vn) Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 20/08/2017 Ngày báo đăng: 28/08/2017 115 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Ghép màng ối đ sử dụng thành công bệnh nhân (BN) bị dị tật biểu mô khó lành, BN khơng đáp ứng với điều trị y khoa Màng ối có khả làm liền vết thương, sử dụng giá thể cho nuôi cấy tế bào Chúng nghiên cứu đề tài nhằm: Xác định số đặc điểm siêu vi thể màng ối quần thể tế bào màng ối ÐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Màng ối thu nhận từ sản phụ mổ đẻ, bảo đảm tiêu chuẩn xét nghiệm sàng lọc, âm tính với HIV, HBV, HCV giang mai Màng ối thu thập đặt vào bình bảo quản đảm bảo vô trùng chuyển trung tâm nghiên cứu Phƣơng pháp nghiên cứu * Chuẩn bị màng ối: Nhau thai thu nhận sau ca mổ đẻ đặt vào bình bảo quản vơ trùng có chứa PBS môi trường RPMI-1640 lạnh, vận chuyển trung tâm nghiên cứu điều kiện nhiệt độ lạnh khoảng 4ºC Tiến hành bóc tách màng ối trong phòng khơng kể từ thu thập Cắt lọc, rửa nhiều lần dung dịch PBS 1X màng ối trở nên suốt cồn ethanol Tiến hành làm khô mẫu: làm khô điểm tới với bước sau: - Ngâm mẫu isoamyl acetate; thay isoamyl acetate CO2 lỏng; làm bay CO2 lỏng điểm tới hạn - Mạ phủ mẫu: mạ phủ mẫu vàng máy JFC-1200, JEOL (Nhật Bản) với thời gian 45 - 60 giây để soi SEM * Nghiên cứu đặc điểm giải phẫu vi thể màng ối kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM): Pha mẫu mô thành mảnh nhỏ có kích thước x x mm Cố định mẫu glutaraldehyde 2,5% Rửa mẫu đệm cacodylat 0,3M lần x 10 phút/lần Cố định mẫu axít osmic 1% đệm cocadylat Rửa lại mẫu đệm cacodylat 0,3M lần x 10 phút/lần Khử nước mẫu cồn ethanol; khử cồn ethanol propylen oxide Đúc mẫu chất đúc epoxy, để tủ ấm 35 oC 24 giờ, sau 45 oC 24 60oC 24 Sử dụng lưới đồng loại 200 mắt lưới Tạo màng đỡ lưới màng formvar Cắt tiêu siêu mỏng sau gọt tinh máy utramicrotom Nhuộm tiêu siêu mỏng thuốc nhuộm uranyl acetat 15 phút, chì citrate 15 phút quan sát TEM * Nghiên cứu đặc điểm giải phẫu vi thể màng ối kính hiển vi điện tử quét (SEM): KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Cố định mẫu glutaraldehyd 2,5% 12 (để qua đêm), 40C Sau đó, rửa mẫu đệm cacodylat, lần x 10 phút/lần Cố định bổ sung axít osmic 1% - giờ, 40oC Rửa lại mẫu đệm cacodylat 0,3M, lần x 10 phút/lần Khử nước mẫu theo quy trình Đặc điểm hình thái siêu vi thể màng ối quan sát dƣới SEM 116 Quan sát kính hiển vi điện tử, nhận thấy tế bào biểu mơ màng ối có hình dạng khác nhau, từ dạng trụ, đa diện đến hình cầu, đa số xếp tạo thành lớp tế bào màng đáy TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Bờ tự tế bào biểu mơ có nhiều vi nhung mao, bờ bên vi nhung mao phân nhánh kết hợp với tạo thành kênh gian bào Sự đa dạng hình thái tế bào biểu mơ màng ối ảnh hưởng bước cố định trình chuẩn bị mẫu, tương tự nhận định Benirschke [1] Trên màng đáy, tế bào biểu mơ xếp theo bốn dạng mơ hình dạng chuyển tiếp mơ hình: Mơ hình 1: Tế bào biểu mơ màng ối có hình Mơ hình 2: Phần lớn tế bào xếp đa giác xếp mặt phẳng mơ hình Tuy nhiên có nhiều kênh gian bào Thỉnh thoảng nhìn thấy kênh mơ hình, đồng thời rải rác có gian bào góc tế bào biểu mơ tế bào hình bầu dục, lớn ngăn cách với tế bào xung quanh kênh tạo sợi tế bào chất mỏng Mơ hình 3: Mơ hình hay gặp nhất, gồm mảng tế bào hình đa giác dài, có xu hướng nằm song song với Rải rác có tế bào lớn phẳng, đơn độc tập trung thành nhóm Trong mơ hình này, khó nhìn thấy kênh gian bào Mơ hình 4: Xuất bất thường mảng tế bào hình tròn, ngăn cách với tế bào xung quanh khe sâu, đáy khe có sợi lưới Ở số vị trí nhóm tế bào hình đa giác, khơng phải hình tròn Ngồi quan sát thấy số vị trí khơng có tế bào, màng đáy đơn Hình 1: Các mơ hình xếp tế bào màng ối 117 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QN SỰ SỐ CHUN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Hình 2: Một số hình thái tế bào (SEM x3.000) Quan sát TEM thấy tế bào biểu mô màng ối có đặc điểm chung: tế bào biểu mơ màng ối thường tế bào biểu mơ đơn, có hình khối hình tròn với nhiều vi nhung mao đỉnh Nhân tế bào có kích thước tương đối định Tuy nhiên, màng nhân khơng đều, hình dáng thay đổi: múi, khía cuộn lại Chất nhân có đậm độ điện tử không Ở đỉnh tế bào biểu mơ màng ối, nhiều vi nhung mao hình thành từ bờ tự hướng dịch ối tế bào biểu mô Trong nghiên cứu chúng tôi, quan sát SEM, quan sát số tế bào có hình thái khác thường: (A) tế bào có bề mặt phẳng (B) tế bào có hình bầu dục, nằm ngăn cách với xung quanh khoảng trống nối với tế bào xung quanh sợi tế bào chất Đặc điểm giải phẫu vi thể màng ối quan sát TEM Hình 4: Liên kết tế bào biểu mơ với màng đáy (TEM x10.000) Cực đáy tế bào liên kết với màng đáy liên kết dạng bán liên kết không liên tục, mối liên kết có hình ảnh tăng đậm độ điện tử phía tế bào biểu mô Màng đáy theo đường viền bề mặt tế bào biểu mơ màng ối hình dạng Hình 3: Tế bào biểu mơ màng ối (TEM x2.000) 118 mỏm chêm Với kiểu liên kết nên tế bào dễ bị phân hủy trypsin TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 có cấu trúc phù hợp với chuyển giao nhiều chất tan qua đường cạnh bào (paracelluar) - qua kênh gian bào đường xuyên bào Hình 5: Liên kết hai tế bào biểu mô màng ối (TEM x10.000) Cạnh bên tế bào tương đối phức tạp với liên kết dạng cầu nối gian bào vị trí liên kết có tăng đậm độ điện tử, khơng có tơ trương lực liên kết desmosom khơng có liên kết dính Đặc biệt, chúng tơi quan sát có hai loại tế bào với tế bào chất có đậm độ điện tử khác nhau: đậm nhạt hai tế bào (1) (2) Tuy nhiên, nghiên cứu mặt hình thái học chưa thể xác định khác biệt mặt đậm độ điện tử có nguyên nhân từ đâu, tồn loại tế bào biểu mơ màng ối Sự khác biệt tế bào màng ối vị trí tồn tại, mức độ thối hóa hay tác nhân tác động từ bên Quan sát màng ối TEM, chúng tơi nhận thấy màng dày có cấu trúc từ sợi collagen Theo Al-Yahya CS, màng màng dày mơ người [1] Hình 6: Hai tế bào biểu mơ màng ối có đậm độ điện tử khác (TEM x1.500) Hình 7: Lớp trung mơ tế bào trung mô màng ối (TEM x2.000) Quan sát qua SEM xuyên TEM thấy hai bề mặt đỉnh đáy tế bào biểu mô màng ối hoạt động vận chuyển chất hòa tan nước theo dạng tế bào lưỡng cực Như vậy, màng ối Lớp trung mô vô mạch màng ối tạo từ sợi collagen có tế bào trung mô Theo Hu Jingfwei CS, Pasquinelli CS, tế bào trung mơ màng ối người có đặc điểm cấu hình siêu 119 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 cấu trúc lai trung - biểu mơ: biểu biểu mơ có vi nhung mao đặc bề mặt, khoang tế bào chất lót vi nhung mao có liên kết gian bào Biểu tế bào trung mơ có lưới nội chất phát triển, ổ sợi co thắt phát triển [4, 5] Nghiên cứu Mendez Savagner cho thấy trình chuyển dạng tế bào biểu mô thành tế bào trung mô ngược lại Q trình chuyển dạng tế bào biểu mơ thành tế bào trung mơ q trình thay đổi đáng kể hình dạng khả di động tế bào Tế bào tính phân cực đỉnh - đáy, liên kết với tế bào xung quanh màng đáy Ngược lại, tượng chuyển dạng tế bào trung mô thành tế bào biểu mô ghi nhận với tượng giảm di động biểu với đặc điểm tế bào biểu mô Hiện tượng chuyển dạng gắn liền với thay đổi vimentin Mendez CS đ mơ tả [6] có liên quan đến CK-5 [7] Tuy nhiên, điều kiện nghiên cứu, chúng tơi khơng đánh giá q trình chuyển dạng tế bào Lớp trung mơ vơ mạch chia nhỏ thành lớp: lớp đặc, lớp nguyên bào sợi lớp xốp Lớp đặc: chứa bó sợi collagen, sợi đàn hồi nằm rải rác Lớp nguyên bào sợi mạng lưới nguyên bào sợi Ranh giới hai lớp tương đối không rõ ràng Nằm lớp xốp, thành phần gồm bó sợi lưới mucin Chính vậy, khó bắt màu nhuộm HE KẾT LUẬN Xác định cấu trúc với thành phần màng ối Màng ối có lớp tế bào biểu mô trung mô Tế bào biểu mô 120 màng ối thường tế bào biểu mơ đơn Nhân tế bào có kích thước tương đối định, nhiên màng nhân khơng đều, hình dáng thay đổi: múi, khía cuộn lại Chất nhân có đậm độ điện tử khơng Trên màng đáy, tế bào biểu mô xếp theo bốn dạng mô hình liên kết với màng đáy theo dạng bán liên kết khơng hồn tồn nên dễ bị phân tách trypsin TÀI LIỆU THAM KHẢO AL-Yahya A.A, Makhlouf M.M Characterization of the human amniotic membrane: histological, immunohistochemical and ultrastructural studies Life Science Journal 2013, 4, p.10 Benirschke K, Burton J.G, Baergen N.R Pathology of the human placenta Sixth edition ed Springer 2012 Hao Y, Ma D.H, Hwang D.G et al Identification of antiangiogenic and antiinflammatory proteins in human amniotic membrane Cornea 2000, 19 (3), pp.348-352 Hu J, Cai Z, Zhou Z.W Progress in studies on the characteristics of human amnion mesenchymal cells Progress in Natural Science 2009, 19 (9), pp.1047-1052 Pasquinelli G, Tazzari P, Ricci F et al Ultrastructural characteristics of human mesenchymal stromal (stem) cells derived from bone marrow and term placent., Ultrastructural pathology 2007, 31 (1), pp.23-31 Mendez M.G, Kojima S, Goldman R.D Vimentin induces changes in cell shape, motility, and adhesion during the epithelial to mesenchymal transition The FASEB Journal 2010, 24 (6), pp.1838-1851 Savagner P The epithelial-mesenchymal transition (EMT) phenomenon Annals of Oncology 2010, 21 (suppl 7), pp.vii89-vii92 ... Chúng nghiên cứu đề tài nhằm: Xác định số đặc điểm siêu vi thể màng ối quần thể tế bào màng ối ỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ối tƣợng nghiên cứu Màng ối thu nhận từ sản phụ mổ đẻ, bảo đảm... phút/lần Khử nước mẫu theo quy trình Đặc điểm hình thái siêu vi thể màng ối quan sát dƣới SEM 116 Quan sát kính hiển vi điện tử, chúng tơi nhận thấy tế bào biểu mơ màng ối có hình dạng khác nhau, từ... biểu mơ màng ối có đặc điểm chung: tế bào biểu mô màng ối thường tế bào biểu mơ đơn, có hình khối hình tròn với nhiều vi nhung mao đỉnh Nhân tế bào có kích thước tương ối định Tuy nhiên, màng nhân