Đánh giá sự thay đổi tăng sinh và cấu trúc khung xương tế bào gốc trung mô cuống rốn người trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Hồ Nguyễn Quỳnh Chi ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI TĂNG SINH VÀ CẤU TRÚC KHUNG XƯƠNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ CUỐNG RỐN NGƯỜI TRONG ĐIỀU KIỆN VI TRỌNG LỰC MÔ PHỎNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Tp Hồ Chí Minh – Năm 2021 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: GS TS Hoàng Nghĩa Sơn Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … …, ngày … tháng … năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Trong lĩnh vực sinh học trọng lực, nghiên cứu vi trọng lực khơng gian tìm nhiều tác động điều kiện trọng lực lên trình sinh học, chế nhạy cảm với trọng lực, hay định hướng dựa vào trọng lực sinh vật Tuy nhiên, việc nghiên cứu không gian gặp phải số khó khăn định, bao gồm chi phí đắt đỏ cho phương tiện nghiên cứu ảnh hưởng tiêu cực từ môi trường vi trọng lực lên thể phi hành gia Để khắc phục khó khăn trên, nhà khoa học cố gắng tạo mơ hình hệ thống sinh học mô điều kiện tương tự trạng thái vi trọng lực mặt đất nhằm nghiên cứu sâu tác động điều kiện vi trọng lực hay siêu trọng lực sinh vật sống hay đối tượng sống Trái Đất Nhiều nghiên cứu loại tế bào sinh vật khác hoạt động khác khơng gian so với Trái đất Do có đa dạng lớn loại tế bào tự nhiên, ảnh hưởng vi trọng lực lên tế bào vơ đa dạng thường phức tạp Một số nghiên cứu vai trò vi trọng lực tăng sinh biệt hóa tế bào chứng minh tế bào phát triển môi trường vi trọng lực phát triển khác với điều kiện bình thường dẫn đến thay đổi trình phân chia tế bào Khung xương tế bào đối tượng chịu ảnh hưởng lớn tác động vi trọng lực Bộ khung xương tế bào hình thành cấu trúc tế bào bao gồm tương tác vi ống, vi sợi actin, vi sợi trung gian protein liên quan Do đó, khung xương tế bào có liên quan lớn đến hình dạng tế bào Sự bất thường hoạt động vi ống vi sợi khung xương tế bào có ảnh hưởng bất lợi lên thân tế bào, chí gây hậu lớn tế bào giai đoạn phôi Các chế thay đổi tăng sinh cấu trúc khung xương tế bào tác động vi trọng lực chưa chứng minh rõ ràng Tế bào gốc trung mơ cuống rốn dịng tế bào tiềm việc thu nhận chúng không vấp phải nhiều vấn đề đạo đức dòng tế bào gốc trung mơ từ nguồn khác Hiện nay, chưa có nhiều báo cáo tác động vi trọng lực lên tế bào gốc trung mơ cuống rốn, nghiên cứu sử dụng dòng tế bào làm đối tượng để đánh giá ảnh hưởng vi trọng lực Từ lý trên, nghiên cứu sử dụng hệ thống clinostat 3D để tạo môi trường vi trọng lực mô nhằm mục tiêu đánh giá tác động điều kiện vi trọng lực mô lên tăng sinh cấu trúc khung xương tế bào gốc trung mô cuống rốn người (human mesenchymal stem cells, viết tắt hucMSC Mục tiêu nghiên cứu luận án Mục tiêu nghiên cứu tìm phương thức tác động điều kiện vi trọng lực mô lên phát triển hucMSC, thông qua việc xác định thay đổi hình thái tế bào, tăng sinh cấu trúc khung xương tế bào hucMSC điều kiện in vitro Các nội dung nghiên cứu luận án ‒ Đánh giá ảnh hưởng vi trọng lực mô lên tăng sinh tế bào hucMSC ‒ Đánh giá ảnh hưởng vi trọng lực mơ lên q trình apoptosis tế bào hucMSC ‒ Đánh giá ảnh hưởng vi trọng lực mô lên thay đổi hình thái nhân tế bào chất tế bào hucMSC ‒ Đánh giá ảnh hưởng vi trọng lực mô lên khung xương tế bào tế bào hucMSC CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vai trị nghiên cứu sinh học khơng gian Phần nêu tầm quan trọng liệt kê hướng nghiên cứu sinh học không gian 1.2 Giới thiệu vi trọng lực vi trọng lực mô Phần giới thiệu tổng quan nêu khái niệm vi trọng lực vi trọng lực mô 1.3 Các hệ thống mô vi trọng lực Phần giới thiệu số hệ thống vi trọng lực mô nghiên cứu thực hệ thống 1.4 Tế bào gốc trung mơ cuống rốn Phần trình bày đặc tính sinh học tế bào gốc trung mô cuống rốn lợi ích chúng nghiên cứu 1.5 Sự tăng sinh tế bào Trình bày khái niệm tăng sinh tế bào, chu kỳ tế bào yếu tố điều hòa chu kỳ tế bào nghiên cứu ảnh hưởng vi trọng lực lên tăng sinh tế bào 1.6 Quá trình apoptosis Phần trình bày khái niệm, yếu tố ảnh hưởng đến trình apoptosis phương pháp đánh giá apoptosis 1.7 Nhân tế bào chất Phần trình bày khái niệm yếu tố ảnh hưởng đến hình thái nhân tế bào chất tế bào 1.8 Bộ khung xương tế bào Phần trình bày thành phần cấu trúc nên khung xương tế bào nghiên cứu ảnh hưởng vi trọng lực lên khung xương tế bào CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu ‒ Tế bào gốc trung mô cuống rốn người (hucMSC) cung cấp Viện Sinh học Nhiệt đới ‒ Hệ thống máy clinostat 3D tạo môi trường vi trọng lực mô thiết kế chế tạo đề tài: “Nghiên cứu đánh giá thay đổi cấu trúc khung tế bào thể sống điều kiện mô trạng thái vi trọng lực (simulated microgravity)”, thuộc Chương trình Khoa học cơng nghệ vũ trụ, mã số: VTCB.15/18-20 2.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nuôi cấy tế bào 2.2.1.1 Phương pháp giải đông hucMSC huyền phù hóa mơi trường ni cấy DMEM/Ham’s F-12 with L-Glutamine (DMEM-12-A, Capricorn Scientific, Đức) bổ sung 15% FBS (FBS-HI-22B, Capricorn Scientific, Đức) 1% Pen/Strep (15140-122, Gibco, Mỹ), sau ly tâm 1500 vịng/phút phút nhiệt độ phòng để thu tủa tế bào Tủa tế bào tái huyền phù môi trường nuôi cấy nuôi điều kiện 37°C, 5% CO2 2.2.1.2 Phương pháp cấy chuyền Tế bào hucMSC xử lý với Trypsin 0,25% (TRY-2B, Capricorn Scientific, Đức) ly tâm với tốc độ 1500 vòng/phút phút nhiệt độ phòng để thu tủa tế bào Tủa tế bào tái huyền phù hóa ni nhiệt độ 37°C, 5% CO2 2.2.1.3 Phương pháp đông lạnh Tủa hucMSC sau thu hoạch huyền phù hóa với 500 μl DMEM/Ham’s F-12 with L-Glutamine (DMEM-12-A, Capricorn Scientific, Đức) 500 μl môi trường đông lạnh HyCryo-STEM (SR30002.02, GE Healthcare Life Sciences, Mỹ) Huyền phù tế bào chuyển vào ống đông lạnh (430663, Corning, Mỹ) trữ 20°C giờ, sau trữ -80°C qua đêm cuối chuyển vào nitơ lỏng để lưu trữ 2.2.2 Đánh giá thị marker tế bào gốc trung mô hucMSC sau giải đông cấy chuyền thu hoạch đánh giá tính gốc phương pháp Flow cytometry sử dụng kit Human MSC analysis kit (562245, BD Biosciences, Mỹ) Mẫu tế bào phân tích hệ thống máy BD Accuri C6 flow cytometer (BD Biosciences, Mỹ) 2.2.3 Thử nghiệm vi trọng lực hucMSC ni bình ni T-25 (160430, Thermo Scientific, Mỹ) đĩa 96 giếng (161093, Thermo Scientific, Mỹ) với mật độ 105 tế bào/bình ni × 103 tế bào/giếng Đĩa bình nuôi tế bào đổ đầy môi trường nuôi cấy Tế bào sau chia làm nhóm: nhóm vi trọng lực (SMG-Clinostat) nhóm đối chứng (Control) Đối với nhóm vi trọng lực, tế bào ni hệ thống máy 3D-Clinostat quay chế độ 1,3×10-3G Tế bào nhóm đối chứng ni điều kiện trọng lực bình thường (1G) Thử nghiệm vi trọng lực tiến hành vòng 72 2.2.4 Đánh giá tăng sinh tế bào 2.2.4.1 Đánh giá mật độ tế bào hucMSC xử lý với dung dịch WST-1 (11644807001, Roche, Thụy Sĩ) 3,5 37ºC, 5% CO2 Giá trị OD giếng đo máy quang phổ GloMax® Explorer Multimode Microplate Reader (Promega, Mỹ) bước sóng 450 nm 2.2.4.2 Đánh giá chu kỳ tế bào Đánh giá tỉ lệ tế bào vào pha chu kỳ: Hệ thống máy BD Accuri C6 flow cytometer (BD Biosciences, Mỹ) sử dụng để phân tích thay đổi chu kỳ hucMSC Đánh giá biểu mức phiên mã gene điều hòa chu kỳ tế bào: RNA tổng hucMSC tách kit ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Z6011, Promega, Mỹ) Biểu mức độ phiên mã gene CDK2, CDK6, Cyclin A đánh giá phương pháp Realtime qRT-PCR sử dụng kit 2x qPCR SyGreen 1Step Go Hi-ROX kit (PB25.32.03, PCRBiosystem, Anh) Chu trình nhiệt tiến hành sau: 45°C 15 phút, 95°C phút, 40 chu kỳ gồm 95°C 10 giây 62°C 15 giây, 71 chu kỳ 60°C 30 giây, 4°C 30 phút Trình tự mồi bao gồm: CDK2 F: 5’-CCAGGAGTTACTTCTATGCCTGA-3’, TTCATCCAGGGGAGGTACAAC-3’; CDK6 GCCATTAGTTTACCTGGACCCAGA-3’, CACTGACATGGAAGACAGGAACCT-3’; CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’, 5’- F: 5’- R: TCTTCATTCACACCGAGTAGTGC-3’, TGAGGTTAGAGCCATCTGGAAA-3’; R: Cyclin A 5’F: R: GAPDH 5’5’- F: R: 5’5’- AGTCCTTTCCACGATACCAAAGT-3’ Phương pháp 2-∆∆Ct (Livak) (Real-time PCR Applications Guide – Biorads) áp dụng để đánh giá mức độ biểu tương đối biểu gene Đánh giá biểu mức dịch mã gene điều hòa chu kỳ tế bào: Mức độ biểu protein Cyclin A1+A2, CDK4, CDK6 đánh giá phương pháp Western Blot Protein GAPDH sử dụng làm đối chứng Các kháng thể sử dụng bao gồm: Anti-Cyclin A1 + Cyclin A2 antibody (ab185619, Abcam, Mỹ), Anti-CDK4 antibody (ab137675, Abcam, Mỹ), Anti-CDK6 antibody (ab124821, Abcam, Mỹ), Anti-GAPDH antibody (ab181602, Abcam, Mỹ) Phần mềm ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Mỹ) dùng để đo cường độ vạch protein kết phim 2.2.5 Đánh giá trình apoptosis 2.2.5.1 Thu hoạch tế bào Tủa tế bào hucMSC thu hoạch Mục 2.2.1.2 2.2.5.2 Đánh giá tỉ lệ apoptosis hucMSC sau thu hoạch xử lý với FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, Mỹ) phân tích hệ thống máy BD Accuri C6 flow cytomete (BD Biosciences, Mỹ) 2.2.5.3 Đánh giá biểu mức phiên mã gene liên quan đến apoptosis Các gene Bax Bcl-2 đánh giá biểu mức phiên mã phương pháp Realtime qRT-PCR Quy trình thu nhận RNA tổng phản ứng Realtime qRT-PCR thực Mục 2.2.4.2 Chu trình nhiệt tiến hành sau: 45°C 15 phút, 95°C phút, 40 chu kỳ gồm 95°C 10 giây 52,2°C 15 giây, 71 chu kỳ 60°C 15 giây, 4°C 30 phút Các cặp mồi đặc trưng cho gene khảo sát bao gồm: Bax F: 5’R: CCAGGAGTTACTTCTATGCCTGA-3’, TTCATCCAGGGGAGGTACAAC-3’; 5’F: Bcl-2 TCTTCATTCACACCGAGTAGTGC-3’, R: TGAGGTTAGAGCCATCTGGAAA-3’; GAPDH 5’5’- F: 5’- CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’, 5’- R: AGTCCTTTCCACGATACCAAAGT-3’ 2.2.6 Đánh giá thay đổi hình thái nhân tế bào chất hucMSC nhuộm nhân Hoechst 33342 (14533, SigmaAldrich, Mỹ) quan sát hệ thống kính hiển vi huỳnh quang Cytell (GE Healthcare, Mỹ) Ứng dụng Cell Cycle App sử dụng để đánh giá hình thái nhân, bao gồm diện tích, cường độ giá trị hình dạng nhân (nuclear shape value) Phần mềm ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Mỹ) dùng để đánh giá diện tích tế bào Kích thước hucMSC đánh giá phương pháp flow cytometry thông qua kết đo số FSC (Forward Scatter) 2.2.7 Đánh giá thay đổi cấu trúc khung xương tế bào 2.2.7.1 Thu hoạch tế bào Tủa tế bào hucMSC thu hoạch Mục 2.2.1.2 2.2.7.2 Đánh giá biểu mức phiên mã gene mã hóa vi ống, vi sợi Các gene gồm α-tubulin β-actin đánh giá biểu mức phiên mã phương pháp Realtime qRT-PCR Mục 2.2.4.2 Chu trình nhiệt tiến hành sau: 45°C 15 phút, 95°C phút, 40 chu kỳ gồm 95°C 10 giây 60°C 15 giây, 71 chu kỳ 60°C 15 giây, 4°C 30 phút Các cặp mồi đặc trưng cho gene khảo sát bao gồm: α-tubulin F: 5’R: CATTGAAAAGTTGTGGTCTGATCA-3’, GCTTGGGTCTGTAACAAAGCAT-3’; GAGCACAGAGCCTCGCCTTT-3’, AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3’; β-actin 5’F: R: GAPDH 5’5’- F: 5’- 11 hucMSC sử dụng nghiên cứu giữ đặc tính tế bào gốc trung mô 3.2 Đánh giá tăng sinh tế bào 3.2.1 Sự thay đổi mật độ tế bào Mật độ quang hucMSC hai nhóm thí nghiệm tính tốn thể Hình 3.2 Theo đó, mật độ quang trung bình nhóm thử nghiệm vi trọng lực (SMG) 0,97 ± 0,05, thấp đáng kể so với nhóm đối chứng 1,09 ± 0,13 (p ≤ 0,001) Điều cho thấy mức độ tăng sinh hucMSC giảm nuôi cấy mơi trường vi trọng lực mơ Hình 3.2 Mật độ quang hucMSC qua đánh giá phương pháp WST-1 A: Biểu đồ mật độ quang B: hucMSC điều kiện bình thường C: hucMSC điều kiện vi trọng lực mô (SMG) ***: p ≤ 0,001 Thước đo: 111,82 μm 3.2.2 Sự thay đổi chu kỳ tế bào 3.2.2.1 Tỉ lệ pha chu kỳ tế bào Kết phân tích chu kỳ tế bào Hình 3.3 cho tỷ lệ tế bào hucMSC bước vào pha nghỉ G0/G1 nhóm ni cấy điều kiện vi trọng lực mô (SMG) 85,65 ± 0,65% cao rõ rệt so với nhóm đối chứng 72,27 ± 1,28% Đồng thời, tỉ lệ hucMSC vào pha phân chia G2/M nhóm SMG giảm so với nhóm đối chứng (5.65 ± 0.05% nhóm SMG 22,10 ± 1,27% nhóm đối chứng) 12 Những khác biệt có ý nghĩa thống kê phân tích One- way ANOVA với p ≤ 0,01 Dữ liệu cho thấy vi trọng lực mơ làm giảm q trình phân chia có xu hướng tạo giai đoạn bắt giữ chu kỳ tế bào Hình 3.3 Chu kì tế bào hucMSC qua phân tích flow cytometry 3.2.2.2 Biểu mức độ phiên mã gene điều hịa chu kì tế bào Biểu mRNA gene CDK2, CDK6, Cyclin A hucMSC nuôi cấy môi trường vi trọng lực mơ có giảm xuống mang ý nghĩa thống kê (Hình 3.4) CDK2 nhóm SMG có biểu giảm mạnh cịn 0,59 ± 0,07 so với nhóm đối chứng 1,01 ± 0,13 (p ≤ 0,001) CDK6 giảm biểu nhẹ mức độ biểu nhóm SMG 0,68 ± 0,05 so với đối chứng 1,00 ± 0,14 (p ≤ 0,01) Cyclin A có mức độ hiểu giảm nhẹ ba gene với mức độ biểu nhóm SMG 0,83 ± 0,09 nhóm đối chứng 1,00 ± 0,09 (p ≤ 0,05) Hình 3.4 Biểu mức phiên mã gene điều hòa chu kỳ tế bào ***: p ≤ 0,001; *: p ≤ 0,05 13 3.2.2.3 Biểu mức độ dịch mã gene điều hịa chu kì tế bào Biểu protein Cyclin A1+A2, CDK4 CDK6 hucMSC có xu hướng giảm nuôi cấy môi trường vi trọng lực mơ (Hình 3.5) Cyclin A1+A2 có mức độ biểu giảm rõ nét tỉ lệ biểu nhóm vi trọng lực (SMG) 0,34 ± 0,04, phần ba tỉ lệ biểu nhóm đối chứng 1,00 ± 0,07 (p ≤ 0,001) Mức độ Hình 3.5 Biểu mức dịch biểu CDK4 CDK6 nhóm mã gene điều hòa chu kỳ SMG 0,79 ± 0,01 tế bào ***: p ≤ 0,001; 0,82 ± 0,01, giảm nhẹ so với **: p ≤ 0,01; *: p ≤ 0,05 nhóm đối chứng (1,00 ± 0,06 CDK4 1,00 ± 0,10 CDK6) 3.3 Đánh giá trình apoptosis 3.3.1 Tỉ lệ apoptosis Phân tích flow cytometry khơng có khác biệt mang ý nghĩa thống kê tỷ lệ sống tế bào hucMSC từ nhóm đối chứng (93,20 ± 0,35%) nhóm vi trọng lực (SMG) (92,85 ± Hình 3.6 Tỉ lệ tế bào sống 1,15%) (Hình 3.6) Tổng tỷ apoptosis hucMSC qua phân lệ apoptosis (apoptosis sớm tích flow cytometry 14 apoptosis muộn) tế bào hucMSC từ nhóm SMG tương tự đối chứng 3.3.2 Biểu mức phiên mã gene liên quan đến apoptosis Kết từ Hình 3.7 khơng có khác biệt mang ý nghĩa thống kê biểu mRNA Bcl2 Bax hucMSC nhóm đối chứng nhóm vi trọng lực (SMG) Điều cho thấy chết Hình 3.7 Biểu mức tế bào không dẫn đến giảm phiên mã gene liên tăng sinh tế bào hucMSC quan đến apoptosis 3.4 Đánh giá thay đổi hình thái tế bào 3.4.1 Sự thay đổi hình thái nhân Hình thái nhân hucMSC có số thay đổi tế bào nuôi môi trường vi trọng lực mơ Ở Hình 3.8, cường độ nhân hucMSC có biểu giảm mơi trường vi trọng lực mơ phỏng, nhóm SMG 5629317 ± 39469 so với nhóm đối chứng 5957254 ± Hình 3.8 Cường độ nhân hucMSC ***: p ≤ 0,001 65063 (p ≤ 0,001) Trong đó, diện tích nhân hucMSC khơng có thay đổi đáng kể khơng tìm thấy khác biệt mang ý nghĩa thống kê hai nhóm SMG (314,04 ± 2,55 µm2) đối chứng (318,07 ± 1,73 µm2) (Hình 3.9) Giá trị hình Hình 3.9 Diện tích nhân hucMSC 15 dạng nhân biểu thị mức đối xứng nhân tế bào, nhân đối xứng giá trị tiệm cận đến 1,0 Hình 3.10 cho thấy giá trị hình dạng nhân hucMSC khơng có thay đổi nhóm SMG (0,89 Hình 3.10 Hình dạng nhân ±0,002) nhóm đối chứng (0,88 ± hucMSC 0,003) Sự phân bố tế bào hucMSC theo hình dạng cường độ nhân hai nhóm thí nghiệm tương đồng (Hình 3.11 3.12) Nhóm đối chứng có phân bố cường độ nhân vượt qua ngưỡng 1,5 × 107 hầu hết giá trị cường độ nhân nhóm SMG nằm ngưỡng 1,5 × 107 Hình 3.11 Sự phân bố nhân Hình 3.12 Sự phân bố mối tương quan nhân mối tương quan hình dạng nhân cường độ diện tích nhân cường độ nhân hucMSC nhân hucMSC 3.4.2 Sự thay đổi hình thái tế bào chất 16 Hình 3.13A 3.13B cho thấy hình thái hucMSC hai nhóm vi trọng lực (SMG) đối chứng có dạng thn dài đặc trưng tế bào gốc trung mô Tuy nhiên màng tế bào chất tế bào hucMSC nhóm SMG có xu hướng trải rộng nhiều so với nhóm đối chứng Nhận định bổ sung kết đo diện tích tế bào Hình 3.13C, diện tích trung bình tế bào hucMSC nhóm SMG 14083,34 ± 1069,38 µm2, cao so với nhóm đối chứng (11368,67 ± 535.27 µm2) (p ≤ 0,05) Các tế bào hucMSC cho thấy sinh trưởng bình thường hai nhóm khơng phát dấu hiệu thể apoptotic quần thể Hình 3.13 Hình thái tế bào chất hucMSC A, B: Hình thái tế bào chất hucMSC điều kiện bình thường (A) điều kiện vi trọng lực mô (B) C: Biểu đồ đánh giá diện tích tế bào hucMSC *: p ≤ 0,05 Thước đo: 223,64 µm Kết Hình 3.14 cho thấy giá trị FSC hucMSC nhóm SMG tăng lên với giá trị trung bình 10803988,58 ± 20960,12, cao so với nhóm đối chứng (9829898,02 ± 206370,30) (p ≤ 0,01) Điều cho thấy điều kiện vi trọng lực mơ làm tăng kích thước tế bào tế bào hucMSC 17 Hình 3.14 Giá trị FSC biểu thị kích thước tế bào hucMSC A, B: Biểu đồ thể giá trị FSC hucMSC nhóm đối chứng (A) nhóm SMG (B) C: Biểu đồ giá trị FSC trung bình **: p ≤ 0,01 Kết phân tích hình thái tế bào chất cho thấy điều kiện vi trọng lực mô gây thay đổi mặt hình thái hucMSC sau ngày nuôi cấy Cụ thể tế bào mơi trường vi trọng lực mơ có xu hướng mở rộng diện tích so với điều kiện bình thường 3.5 Đánh giá cấu trúc khung xương tế bào 3.5.1 Biểu mức phiên mã gene mã hóa vi ống, vi sợi Kết Realtime qRT-PCR cho thấy hai gene α-tubulin βactin giảm mức độ biểu mRNA tế bào nuôi cấy mơi trường SMG (Hình 3.15) Mức độ biểu β-actin nhóm SMG 0,60 ± 0,03, thấp hẳn so với nhóm đối chứng 1,00 ± 0,06 (p ≤ 0,001) Sự thay đổi biểu α-tubulin rõ rệt mức độ biểu nhóm SMG 0,23 ± 0,03 Hình 3.15 Biểu mức giảm gần năm lần so với nhóm phiên mã gene mã hóa vi đối chứng 1,00 ± 0,08 (p ≤ 0,001) ống, vi sợi ***: p ≤ 0,001 18 3.5.2 Biểu mức dịch mã gene mã hóa vi ống, vi sợi Kết Western Blot đánh giá biểu protein β-actin vi sợi α-tubulin vi ống thể Hình 3.16 Theo đó, protein β-actin giảm biểu mạnh môi trường vi trọng lực mô (SMG) Mức độ biểu β-actin nhóm SMG 0,06 ± 0,01, giảm 16 lần so với nhóm đối chứng (1,00 ± 0,02) Biểu protein α-tubulin giảm mức độ biểu nhóm SMG 0,42 ± 0,01 nhóm đối chứng 1,00 ± 0,02 Các khác biệt có ý nghĩa thống kê qua phân tích One-way ANOVA (p ≤ 0,001) Hình 3.16 Biểu mức dịch mã protein cấu trúc vi sợi, vi ống phương pháp Western Blot ***: p ≤ 0,001 3.5.3 Đánh giá tái cấu trúc khung vi ống, vi sợi tế bào Kết Hình 3.17 cho thấy hucMSC nhóm đối chứng có mật độ vi ống (tubulin) dày tập trung nhiều xung quanh nhân Trong bó vi ống nhóm vi trọng lực (SMG) có mật độ thấp trải khắp tế bào Qua quan sát, hucMSC nhóm đối chứng có hình dạng giống ngun bào sợi với bó vi ống phân bố song song dọc theo chiều dài tế bào Cách xếp khơng tìm thấy nhóm SMG, thay vào phân bố đan xen bó vi ống tế bào chất Hình 3.18 mơ tả phân bố song song dọc theo chiều dài tế bào bó vi sợi nhóm hucMSC đối chứng Quan sát cho thấy 19 nhóm SMG vi sợi biểu mật độ thấp phân bố tế bào Các bó sợi actin nhóm SMG mảnh so với nhóm đối chứng Cả hai kết nhuộm actin tubulin cho thấy giới hạn chiều dài tế bào hucMSC nhóm SMG Các tế bào nhóm có xu hướng mở rộng theo hình trịn thay kéo dài Hình 3.17 Ảnh nhuộm huỳnh Hình 3.18 Ảnh nhuộm huỳnh quang vi ống hucMSC quang vi sợi hucMSC Thước đo: 223,64 µm Thước đo: 223,64 µm Cường độ phát huỳnh quang vi ống hai nhóm đối chứng SMG thể Hình 3.19 Qua tính tốn, cường độ vi ống hucMSC nhóm đối chứng 3980694,27 ± 842699,73, cao so với nhóm SMG (2860286,60 ± 338612,60) (p ≤ 0,001) Điều chứng tỏ mật độ vi ống phân bố dày nhóm tế bào ni điều kiện bình thường so với mơi trường mô vi trọng lực 20 Kết đánh giá cường độ phát huỳnh quang vi sợi Hình 3.20 cho thấy cường độ actin hucMSC nhóm SMG 3364019,71 ± 688901,20, thấp so với nhóm đối chứng (4276497,43 ± 1190673,58) (p ≤ 0,05) Do kết luận mơi trường mơ vi trọng lực (SMG) làm giảm khả biểu vi sợi hucMSC Hình 3.19 Kết đánh giá Hình 3.20 Kết đánh giá mật độ vi ống hucMSC mật độ vi sợi hucMSC *: ***: p ≤ 0,001 Thước đo: p ≤ 0,05 Thước đo: 223,64 223,64 µm µm 3.6 Tóm tắt ảnh hưởng vi trọng lực mô lên tế bào hucMSC phương thức ức chế tăng sinh tế bào môi trường vi trọng lực mô Nghiên cứu sử dụng hệ thống clinostat 3D tạo môi trường vi trọng lực mô để đánh giá tiêu tăng sinh, hình thái tế bào cấu trúc khung xương tế bào gốc trung mô cuống rốn người (human umbilical cord mesenchymal stem cell, viết tắt hucMSC) Kết thí nghiệm cho thấy vi trọng lực mơ làm giảm biểu protein điều hòa chu kỳ tế bào cyclin A1 21 A2, CDK4, CDK6 Sự giảm biểu protein điều hòa chu kì tế bào thúc đẩy tế bào hucMSC vào pha nghỉ Vi trọng lực mô làm giảm biểu protein cấu trúc nên khung xương tế bào β-actin α-tubulin Việc giảm biểu protein cấu trúc dẫn đến thay đổi trình tổng hợp hệ thống vi sợi vi ống, từ cảm ứng tái tổ chức khung xương tế bào tế bào hucMSC Vi ống vi sợi thành phần thoi vơ sắc rãnh phân tách trình phân chia tế bào Sự suy giảm biểu vi sợi vi ống nguyên nhân gây ức chế tăng sinh tế bào Ngoài ra, protein điều hòa chu kỳ tế bào chứng minh có ảnh hưởng đến tổng hợp vi sợi vi ống Do đó, nghiên cứu đề xuất hai phương thức ức chế tăng sinh tế bào hucMSC tác động môi trường vi trọng lực mô thông qua giảm biểu protein điều hòa chu kỳ tế bào giảm biểu protein cấu trúc vi sợi, vi ống Hai q trình khơng tiến hành riêng lẻ mà xảy tác động lẫn (Hình 3.21) Hình 3.21 Sơ đồ tóm tắt ảnh hưởng vi trọng lực mô lên tăng sinh tế bào hucMSC 22 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Nghiên cứu sử dụng hệ thống clinostat 3D tạo môi trường vi trọng lực mô để đánh giá tiêu tăng sinh, hình thái tế bào cấu trúc khung xương tế bào gốc trung mô cuống rốn người (human umbilical cord mesenchymal stem cell - hucMSC) Kết thí nghiệm cho thấy điều kiện vi trọng lực mô làm giảm tăng sinh làm thay đổi hình thái nhân, tế bào chất đồng thời tái cấu trúc khung xương tế bào hucMSC Sự chết theo chương trình hucMSC khơng bị ảnh hưởng điều kiện vi trọng lực mô Nghiên cứu đề xuất hai phương thức ức chế tăng sinh điều kiện vi trọng lực mô lên tế bào hucMSC: phương thức thứ thông qua giảm biểu protein điều hòa chu kỳ tế bào Cyclin A, CDK2, CDK4, CDK6, từ bắt giữ tế bào pha G0/G1 ngăn chặn tế bào vào pha phân chia G2/M; phương thức thứ hai thông qua giảm biểu protein cấu trúc vi sợi vi ống, làm ức chế hình thành thoi vơ sắc rãnh phân tách từ làm giảm phân chia tế bào Hai trình xảy tác động lẫn Kiến nghị Qua nhiều báo cáo, thời gian thử nghiệm đặc trưng dòng tế bào nhân tố tác động đến sinh trưởng chu kỳ tế bào Do đó, nghiên cứu tới thực nhiều dòng tế bào khác với mức thời gian, điều kiện vi trọng lực khác để làm rõ chế tác động vi trọng lực lên tế bào sinh vật Ngoài ra, nhóm nghiên cứu tiến hành đánh giá ảnh hưởng điều kiện vi lực mô lên khả bám dính tương tác tế bào gốc trung mô Nghiên cứu tiến hành thời 23 gian dài đánh giá thêm ảnh hưởng yếu tố khác giống môi trường không gian xạ lên tế bào gốc trung mơ 24 NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN Nghiên cứu cho thấy điều kiện vi trọng lực mô làm giảm tăng sinh làm thay đổi hình thái nhân, tế bào chất đồng thời tái cấu trúc khung xương tế bào hucMSC Sự chết theo chương trình hucMSC khơng bị ảnh hưởng điều kiện vi trọng lực mô Nghiên cứu mô tả hai phương thức ức chế tăng sinh điều kiện vi trọng lực mô lên tế bào hucMSC: phương thức thứ thông qua giảm biểu protein điều hòa chu kỳ tế bào Cyclin A, CDK2, CDK4, CDK6, từ cảm ứng tế bào vào pha G0/G1 ngăn chặn tế bào vào pha phân chia G2/M; phương thức thứ hai thông qua giảm biểu protein cấu trúc vi sợi vi ống, làm ức chế hình thành thoi vơ sắc rãnh phân tách từ làm giảm phân chia tế bào DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Ho Nguyen Quynh Chi, Hoang Nghia Son, Doan Chinh Chung, Le Dinh Huan, Tran Hong Diem, Le Thanh Long, Simulated microgravity reduces proliferation and reorganizes the cytoskeleton of human umbilical cord mesenchymal stem cells, Physiol Res., 2020, Sep 9, PMID: 32901501 (SCI, Q2) Ho Nguyen Quynh Chi, Hoang Nghia Son, Morphological changes of human mesenchymal stem cells under 3d clinostat culture, Asian Jr of Microbiol Biotech Env Sc., 2020, 22 (3), 63-67 Ho Nguyen Quynh Chi, Hoang Nghia Quang Huy, Doan Chinh Chung, Hoang Nghia Son, Le Thanh Long, Inhibited growth of mesenchymal stem cells under simulated microgravity, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2020, 18 (2), 1-10 ... án ‒ Đánh giá ảnh hưởng vi trọng lực mô lên tăng sinh tế bào hucMSC ‒ Đánh giá ảnh hưởng vi trọng lực mô lên trình apoptosis tế bào hucMSC ‒ Đánh giá ảnh hưởng vi trọng lực mô lên thay đổi hình... trường vi trọng lực mô nhằm mục tiêu đánh giá tác động điều kiện vi trọng lực mô lên tăng sinh cấu trúc khung xương tế bào gốc trung mô cuống rốn người (human mesenchymal stem cells, vi? ??t tắt hucMSC... thống vi trọng lực mô nghiên cứu thực hệ thống 1.4 Tế bào gốc trung mơ cuống rốn Phần trình bày đặc tính sinh học tế bào gốc trung mô cuống rốn lợi ích chúng nghiên cứu 1.5 Sự tăng sinh tế bào