Nội dung của bài viết trình bày về vấn đề xây dựng quy trình phát hiện Enterrovirus 71 bằng phương pháp Real‐time RT‐PCR, kết quả cho thấy quy trình Real‐time PCR có độ nhạy và đặc hiệu cao để phát hiện EV71 từ các mẫu lâm sàng.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số * 2014 Nghiên cứu Y học PHÁT HIỆN ENTEROVIRUS 71 BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL‐TIME RT‐PCR Trịnh Thị Hồng*, Hồ Thị Thanh Thủy **, Cao Minh Nga *** TĨM TẮT Mở đầu: Enterovirus 71 (EV71) là tác nhân chủ yếu gây nên bệnh Tay‐Chân‐Miệng và thường gây ra các biến chứng nguy hiểm, có thể dẫn đến tử vong. Mục tiêu: Xây dựng quy trình phát hiện Enterrovirus 71 bằng phương pháp Real‐time RT‐PCR. Phương pháp: Thiết kế mồi và mẫu dò dựa trên vùng VP1 của EV71. Tiến hành thực nghiệm bằng phương pháp Real‐time RT‐PCR trên các mẫu dịch phết, mẫu phân của những bệnh nhân nghi ngờ nhiễm Tay‐Chân‐ Miệng. Kết quả: Hệ mồi và mẫu dò Taqman của chúng tơi thiết kế có độ đặc hiệu cao, độ nhạy khoảng 102 bản sao/phản ứng. Quy trình có thể được sử dụng để phát hiện EV71 trong cả mẫu dịch phết và mẫu phân. Kết luận: Quy trình Real‐time PCR mà chúng tơi xây dựng có độ nhạy và đặc hiệu cao để phát hiện EV71 từ các mẫu lâm sàng. Từ khóa: Bệnh Tay‐Chân‐Miệng, Enterovirus 71 (EV71), Real‐time RT‐PCR. ABSTRACT DETECTION OF ENTEROVIRUS 71 BY REAL‐TIME RT‐PCR METHOD Trinh Thi Hong, Ho Thi Thanh Thuy, Cao Minh Nga * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 273 ‐ 278 Background: Enterovirus 71 (EV71) is the main cause of Hand‐Foot‐Mouth Disease (HFMD) and often cause dangerous complications that can lead to death. Objectives: To design a procedure for detection EV71 by real‐time PCR. Methods: Specific primers and Taqman probe were designed based on VP1 region of EV71. Conducting experiments by real‐time PCR method on swab and stool samples collected from pediatric patients with suspected HFMD. Results: Our primer‐probe system that we designed was highly specific. The sensitivity of the method was 10 copies/reaction. The procedure can be applied to detection in both swab and stool samples. Conclutions: Real‐time RT‐PCR method we set up showed a high sensitivity and specificity to detection of EV71 from clinical specimens. Keywords: Hand, Foot and Mouth Disease (HFMD), Enterovirus 71 (EV71), Real‐time RT‐PCR. trong vòng 1 tuần. Tuy nhiên, nếu do Enterovirus ĐẶT VẤN ĐỀ 71 (EV71) thì thường gây ra các biến chứng nguy Bệnh Tay‐Chân‐ Miệng là một bệnh nhiễm hiểm và có thể dẫn đến tử vong nếu khơng được khuẩn cấp tính do virus đường ruột gây ra, phát hiện sớm và xử lí kịp thời. thường gặp ở trẻ em dưới 5 tuổi. Bệnh tay‐chân‐ Sự bùng phát các vụ dịch lớn, nhỏ liên quan miệng mà do các chủng Enterovirus khác gây nên tới EV71 đã được báo cáo trên tồn thế giới kể từ thì thường ở thể nhẹ, ít có biến chứng và tự khỏi * Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP. HCM ** Cơng ty CP Cơng nghệ Việt Á *** Bộ mơn Vi Sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược TP. HCM ĐT: 0908361512 Email : pgscaominhnga@yahoo.com Tác giả liên lạc: PGS.TS. Cao Minh Nga Nhiễm 273 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số * 2014 đầu những năm 1970. Trong thập kỷ qua, tỷ lệ mắc bệnh tay chân miệng, đặc biệt là do nhiễm EV71, xuất hiện ngày càng tăng trong khu vực Châu Á Thái Bình Dương(3,4,7). Điều này đã thúc đẩy các mối quan tâm rằng nếu khơng có biện pháp can thiệp, nó sẽ tiếp tục lây lan trong khu vực và tồn cầu. Hiện nay, bệnh tay chân miệng chưa có vắc xin phòng bệnh và chưa có thuốc điều trị đặc hiệu. Trong khi đó EV71 lại gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm nên việc xác định nhanh chóng và chính xác EV71 mang một ý nghĩa rất quan trọng. Chẩn đốn xác định dựa trên ni cấy mơ, phân lập và phát hiện virus nhưng tốn thời gian và khó thực hiện. Do đó những phương pháp này khơng thiết thực cho việc ra quyết định lâm sàng, đặc biệt trong việc quyết định giữa các can thiệp và điều trị ở những bệnh nhân mà đặc trưng lâm sàng không rõ ràng hay thậm chí khơng có. Hiện nay, các xét nghiệm kháng thể và PCR phổ biến rộng rãi hơn và cho phép chẩn đoán nhanh hơn nhưng chưa được sử dụng rộng rãi do chi phí cũng như mối quan tâm về việc độ nhạy và độ đặc hiệu khơng đảm bảo(3). Với mong muốn phát triển một phương pháp có thể phát hiện nhanh bệnh và điều trị kịp thời với độ nhạy và đặc hiệu cao hơn so với các phương pháp thơng thường, chúng tơi tiến hành “Xây dựng quy trình phát hiện Enterrovirus 71 bằng phương pháp Real‐time RT‐ PCR ”. ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ‐ Các mẫu dịch phết hầu họng, dịch phết trực tràng, mẫu phân nghi ngờ nhiễm tay chân miệng được cung cấp bởi Viện vệ sinh dịch tễ Tây Nguyên, Bệnh viện Hải Phòng, Bệnh viện Khánh Hòa. ‐ Các mẫu dịch phết hầu họng, dịch phết trực tràng dương tính EV71 đã được phát hiện bằng phương pháp Real‐time RT‐PCR do Bệnh viện Nhi Đồng 2 cung cấp. 274 Phương pháp thiết kế mồi và mẫu dò Mồi và mẫu dò được thiết kế dựa trên vùng VP1 (vùng bảo tồn cao) của EV71. Sau đó, chúng tơi dùng phần mềm trực tuyến OligoAnalyzer (IDT) để kiểm tra và chỉnh sửa các mồi và mẫu dò cho phù hợp với các tiêu chuẩn (kích thước,% GC, Tm, các cấu trúc thứ cấp). Phương pháp tách chiết RNA Tách chiết RNA theo phương pháp phenol/chloroform (Sambrook và Russell, 2001) để loại bớt những hợp chất ức chế phản ứng real‐time PCR. Phương pháp RT‐ PCR Chạy phản ứng RT với 10 μl hỗn hợp RT + 15 μl dịch RNA phiên mã ngược thành cDNA. Chương trình ln nhiệt: 25oC trong 5 phút, 42oC trong 30 phút, 85oC trong 5 phút, giữ ở 4oC. Phương pháp PCR Chạy phản ứng PCR với 2,5 μl dịch cDNA từ phản ứng RT + 12,5 μl Master mix + 0,5 μl mồi xi và mồi ngược + nước Biopure cho đủ thể tích phản ứng 25 μl/ phản ứng. Chương trình luân nhiệt: 200C – 10 phút, 950C – 5 phút; 40 chu kỳ: 940C – 30 giây, 550C – 30 giây, 720C ‐ 30 giây; 1 chu kỳ : 720C – 6 phút. Giữ ở 40C. Phương pháp điện di trên gel agarose Sử dụng kỹ thuật điện di để phân tách các phân tử DNA. Sự phát hiện được quan sát bằng mắt thường dưới đèn UV nhờ sự phát màu của ethidium bromide gắn xen trong DNA. Dùng thang DNA 100bp làm thang chuẩn để xác định kích thước đoạn DNA mẫu(1). Phương pháp real‐time RT‐PCR 2,5µl cDNA từ phản ứng RT + 12,5μl master mix + 0,5 μl mồi xuôi và mồi ngược + 0,5 μl mẫu dò + thêm nước cất cho đủ 25 μl Sau đó tiến hành chương trình ln nhiệt (bảng 1). Chun Đề Nội Khoa Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số * 2014 Bảng 1: Chương trình luân nhiệt Số chu kỳ Nhiệt độ 950C Thời gian phút 40 950C 550C 720C 15 giây 45giây 20 giây Việc phân tích kết quả sau phản ứng luân nhiệt được thực hiện với phần mềm iCycler (Bio‐ rad) theo hướng dẫn sử dụng. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết quả thiết kế hệ mồi và mẫu dò trên lý thuyết Theo các tài liệu tham khảo được, các hệ mồi và mẫu dò được thiết kế dựa trên kết quả so sánh sự sắp gióng trình tự vùng VP1 của EV71 với trình tự của cosxakie virus A16 (CA16)(4,5,7,9). Bảng 2: Trình tự cặp mồi và mẫu dò thiết kế Mồi xi Mồi ngược Mẫu dò Sản phẩm PCR Kết quả kiểm tra hoạt động của hệ mồi bằng thực nghiệm Chạy thử hệ mồi thiết kế trên mẫu dương tính đã được khẳng định bằng phương pháp Real‐Time RT‐PCR ở Bệnh viện Nhi Đồng 2 (Kit tách chiết: QIAGEN; PCR mix: One‐step Invitrogen; Primer/probe: in house) và kết quả cho thấy: hệ mồi được thiết kế hoạt động hiệu quả trong phản ứng PCR do chúng tôi thiết lập. Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR Chúng tơi sử dụng kỹ thuật giải trình để kiểm tra sản phẩm PCR được nhân bản từ cặp mồi đã thiết kế trên vùng gen VP1 của EV71. Chúng tơi lấy sản phẩm PCR gửi đi giải trình tự ở cơng ty Macrogen (Hàn quốc). Kết quả giải trình tự cho thấy: hệ mồi của chúng tơi Nhiễm Trong nghiên cứu này, chúng tơi tham khảo hệ mồi và mẫu dò từ nghiên cứu của Tan E.L và Poh C.L (8). Để mồi và mẫu dò bắt cặp tốt hơn với trình tự mục tiêu, chúng tơi tiến hành thiết kế lại mồi ngược, chỉnh sửa một số nucleotide ở mồi xi, giữ lại mẫu dò, đồng thời chúng tơi sử dụng một số nucleotide thay thế: R (A, G) và Y (C, T) cho cả hệ mồi và mẫu dò. Để kiểm tra đặc tính của mồi và mẫu dò về nhiệt độ lai, kích thước mồi, các cấu trúc thứ cấp…, chúng tơi sử dụng phần mềm Annhyb và phần mềm trực tuyến oligo Analyzer 3.1 (IDT, Hoa Kỳ). Kết qủa cho thấy: chiều dài, %GC, nhiệt độ lai, các cấu trúc thứ cấp (UG của Hairpin, Self‐Dimer, Hetero) đều thỏa các u cầu đặt ra về việc thiết kế mồi và mẫu dò. Trình tự (5’-3’) TCAGYAGRGCRGGATTRGTTG GCATYTGYGCGTAACCTGTTA AGAYCTCCCTCTTGARGGYACAACYAA 108 bp Chúng tôi sử dụng phần mềm ClustalX, Blast, Annhyb để xác định khả năng bắt cặp đặc hiệu của các mồi và mẫu dò. Kết quả cho thấy: hệ mồi và mẫu dò bắt cặp hồn tồn với các trình tự mục tiêu và đặc hiệu cao đối với EV71. Nghiên cứu Y học Vị trí gen (JF738000.1) 2602 - 2622 2709 - 2689 2630 - 2656 hoạt động tốt, đặc hiệu và chuyên biệt, có thể ứng dụng được vào quy trình. Xây dựng phản ứng Real‐time RT‐ PCR Kiểm tra hoạt động của hệ mồi và mẫu dò trong phản ứng real‐time RT‐PCR Chúng tơi thiết lập phản ứng Real‐time PCR với mẫu chứng dương và mẫu chứng âm với cặp mồi ở nhiệt độ là 55oC. Kết quả cho thấy: hệ mồi và mẫu dò cho EV71 có khả năng nhân bản tốt. Khảo sát độ đặc hiệu của cặp mồi và mẫu dò Kết quả hình 1 cho thấy: Hệ mồi và mẫu dò chỉ nhân bản với EV71 và âm tính với những tác nhân khác (Herpes simplex virus, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis, Adenovirus, Human papilloma virus). Điều này chứng tỏ trong q trình thao tác khơng bị nhiễm, hệ mồi và mẫu dò đã thiết kế hoạt động tốt, đặc hiệu với EV71. 275 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số * 2014 EV71 HSV, NGN, CHT, MTB, HPV, Adeno Chứng âm Hình 1: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của cặp mồi EV71 tơi chọn nồng độ này để tối ưu cho các phản ứng tiếp theo. Khảo sát nồng độ MgCl2 Nồng độ MgCl2 được khảo sát từ 1,5 mM đến 5,0 mM với đơn vị tăng là 0,5 mM. Tiêu chí đánh giá là chu kỳ ngưỡng (Ct). Kết quả hình 2 cho thấy: nồng độ MgCl2 = 3,0 mM cho giá trị Ct nhỏ nhất, chúng tơi chọn nồng độ này để tối ưu cho các phản ứng tiếp theo. Probe 300nM MgCl2 3,0mM Chứng âm Hình 3: Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò Taqman Chứng âm Hình 2: Kết quả khảo sát nồng độ MgCl2 Khảo sát nồng độ mẫu dò Taqman Chúng tơi thiết lập bảng khảo sát trên gradient nồng độ mẫu dò từ 100 đến 500 nM với đơn vị tăng là 50 nM. Tiêu chí đánh giá của thí nghiệm là Ct. Kết quả hình 3 cho thấy: nồng độ mẫu dò = 300nM cho giá trị Ct nhỏ nhất, chúng 276 Khảo sát nhiệt độ lai Chúng tôi khảo sát nhiệt độ bắt cặp trong khoảng (Tm mồi xi + Tm mồi ngược)/2 ± 5oC với đơn vị tăng 0,5oC. Tiêu chí đánh giá là Ct và nhiệt độ biến tính của sản phẩm PCR. Kết quả hình 4 cho thấy: ở 59,5 0C cho giá trị chu kỳ ngưỡng là nhỏ nhất, chúng tơi chọn nhiệt độ này để tối ưu cho các phản ứng tiếp theo. Chun Đề Nội Khoa Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số * 2014 Nghiên cứu Y học 59,5 oC Chứng âm m Hình 4: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai Khảo sát độ nhạy Pha lỗng bậc 10 liên tiếp mẫu ban đầu (đã biết trước nồng độ) thành nhiều nồng độ khác nhau. Ở mỗi nồng độ, tiến hành khảo sát với những điều kiện tối ưu đã được khảo sát từ các thí nghiệm trên. Từ đó sẽ xác định nồng độ nhỏ nhất mà phương pháp có thể phát hiện và vẫn cho kết quả chính xác, rõ ràng. Kết quả: giới hạn phát hiện của quy trình là 102 bản sao/phản ứng (hình 5). phẩm. Hệ số tuyến tính của đường chuẩn qua ba lần thực nghiệm đều bằng 1, hiệu quả khuyếch đại từ 95,9% đến 97,2%. Qua đó cho thấy phản ứng real‐time PCR của chúng tơi là hiệu quả và đạt mức độ tối ưu. Khảo sát tính lặp lại của phản ứng Real‐ Time PCR Khảo sát hệ số biến thiên nội phản ứng và hệ số biến thiên liên phản ứng trên mẫu chuẩn EV71 với các nồng độ 102, 104, 106 bản sao/phản ứng và hai mẫu bệnh phẩm. Phản ứng được lặp lại ba lần. Kết quả: hệ số biến thiên nội phản ứng real‐time RT‐PCR EV71 nằm trong khoảng 0,54 đến 1,35 và hệ số biến thiên liên phản ứng nằm trong khoảng 1,4 đến 2,0. Ứng dụng quy trình trên các mẫu bệnh phẩm Tiến hành khảo sát trên 74 mẫu bệnh phẩm với các thơng số đã tối ưu ở các thí nghiệm trên. Hình 5: Khảo sát độ nhạy của quy trình Khảo sát hệ số tuyến tính của đường chuẩn (standard curve) Chúng tôi xây dựng đường chuẩn cho phản ứng định lượng EV71, từ đường chuẩn này có thể xác định được hàm lượng virus trong bệnh Nhiễm Kết quả khảo sát trên 74 mẫu: Có 40 mẫu nhiễm EV71, trong đó có 10 mẫu (5 mẫu dịch phết họng và 5 mẫu dịch phết trực tràng) đã được đối chiếu với kết quả xét nghiệm cũng bằng phương pháp Real‐time RT‐ PCR bằng kít của hãng QIAGEN (Đức) thì thấy hồn tồn phù hợp. Điều này chứng tỏ quy trình phát hiện 277 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số * 2014 EV71 trong các mẫu dịch phết và mẫu phân bằng phương pháp Real‐time RT‐ PCR của chúng tơi xây dựng có khả năng ứng dụng để phát hiện EV71 trong các mẫu nhiễm. KẾT LUẬN ‐ Chúng tơi đã xây dựng thành cơng quy trình phát hiện EV71 bằng Real‐time RT‐PCR với độ nhạy là 102 copies/ml, độ đặc hiệu cao, nhiệt độ lai tối ưu của quy trình là 59,50C, nồng độ mẫu dò Taqman là 300nM. ‐ Quy trình đã được ứng dụng để khảo sát trên 74 mẫu bệnh phẩm, trong đó có 40/74 mẫu cho kết quả dương tính với EV71. TÀI LIỆU THAM KHẢO 278 Cao Minh Nga (2008). Ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh nhiễm trùng (Tài liệu tập huấn). Bộ Y Tế. Viện Pasteur TP. HCM. REDI (2009). Forum on Hand Foot and Mouth Disease (HFMD) in Asia‐Pacific Region, Ministry of Health Singapore. REDI (2011). A Guide to Clinical Management and Public Health Response for Hand, Foot and Mouth Disease, World Health Organization. Singh S, et al (2000). “RT‐PCR, nucleotide, amino acid and phylogenetic analyses of enterovirus type 71 strains from Asia”. J. Virol. Methods, 88:193–204. Singh S, et al (2002). “Direct detection of enterovirus 71 (EV71) in clinical specimens from a hand, foot and mouth disease outbreak in Singapore by reverse transcription‐PCR with universal enterovirus and EV71‐specific primers”, J. Clin. Microbiol, 40 (8), p. 2823 – 2827. Solomon T, et al (2010). “Virology, epidemiology, pathogenesis, and control of enterovirus 71”, Lancet Infect Dis, 10: 778–90. Tan EL, Yong LL, Quak SH, Yeo WC, Chow VT, Poh CL (2008). “Rapid detection of Enterovirus 71 by real‐time TaqMan RT‐PCR”, Journal of Clinical Virology, p. 203–206. Tan EL and Poh CL (2010). “Development of TaqMan and Hybridisation Probes for detection of Enterovirus 71 (EV71)”. National University of Singapore. Tsang WS and Poh CL (2010). “Rapid Identification of Enterovirus 71 (EV71) by Real‐Time Reverse Transcription‐ Polymerase Chain Reaction (RT‐PCR) with EV71 Specific Primers”. National University of Singapore. Ngày nhận bài báo: 07/11/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 28/11/2013 Ngày bài báo được đăng: 05/01/2014 Chuyên Đề Nội Khoa ... chúng tôi tiến hành “Xây dựng quy trình phát hiện Enterrovirus 71 bằng phương pháp Real time RT PCR ”. ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ‐ Các mẫu dịch phết hầu họng, dịch ... ‐ Các mẫu dịch phết hầu họng, dịch phết trực tràng dương tính EV71 đã được phát hiện bằng phương pháp Real time RT PCR do Bệnh viện Nhi Đồng 2 cung cấp. 274 Phương pháp thiết kế mồi và mẫu dò ... Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số * 2014 EV71 trong các mẫu dịch phết và mẫu phân bằng phương pháp Real time RT PCR của chúng tơi xây dựng có khả năng ứng dụng để phát hiện EV71 trong các mẫu nhiễm.