Bảo quản tế bào gốc tủy răng chuột

Bài viết Bảo quản tế bào gốc tủy răng chuột trình bày tế bào gốc tủy răng chuột nhắt trắng Mus musculus var albino được bảo quản trong môi trường DMEM/ F12 bổ sung DMSO 10%, FBS 20% theo 2 quy trình giảm nhiệt: (1) để trong điều kiện 4oC/20 phút, -20oC/30 phút, sau đó chuyển sang bảo quản ở -80oC; (2) để trong điều kiện -20oC/30 phút và bảo quản ở -80oC,... Mời các bạn cùng tham khảo.

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC by inversion - PCR Five severe Hemophilia A patients were selected for this study; we use Inversion - PCR to analyse intron 22 inversion in F8 gene 1/5 patients were found to have intron 22 inversion In conclusion, intron 22 inversion was successfully identified in Vietnamese severe Hemophilia A patients by I - PCR technique Keywords: Hemophilia A, inversion intron 22, inversion - PCR BẢO QUẢN TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG CHUỘT Tô Minh Quân1, Lê Thị Ngọc Hương1, Hoàng Đạo Bảo Trâm2 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Trường Đại học Y - Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tế bào gốc tủy chuột nhắt trắng Mus musculus var albino bảo quản môi trường DMEM/ F12 bổ sung DMSO 10%, FBS 20% theo quy trình giảm nhiệt: (1) để điều kiện 4oC/20 phút, -20oC/30 phút, sau chuyển sang bảo quản -80oC; (2) để điều kiện -20oC/30 phút bảo quản -80oC Tế bào đông lạnh giải đông môi trường nuôi cấy DMEM/F12 bổ sung FBS 20% 370C Các tế bào tiếp tục nuôi cấy môi trường DMEM/F12, bổ sung FBS 10%, Peniciline 100UI/ml, Streptomycine 100µg/ml, điều kiện 37oC, CO2 5% Tỷ lệ tế bào sống sau q trình bảo quản đơng lạnh thời điểm ngày, tuần, tuần tuần đánh giá phương pháp nhuộm Trypan Blue Sự biểu marker bề mặt tế bào kiểm tra phương pháp Flow Cytometry Thử nghiệm cho thấy tế bào tủy chuột bảo tốt thời gian tuần theo quy trình đơng lạnh -20oC/20 phút bảo quản -80oC Sau giải đông, tế bào có khả bám, tăng trưởng biểu marker tế bào gốc trung mô CD73, CD90, CD105 không biểu marker tế bào máu CD19, CD34, CD45 Từ khóa: tế bào gốc tủy răng, bảo quản tế bào, nuôi cấy tế bào I ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào gốc tế bào chưa biệt hóa mơ sống, có khả trở thành tế bào chuyên biệt với chức đặc trưng [1] Trong điều kiện in vivo in vitro, tế bào gốc tự làm với tính riêng biệt Ngày nay, tế bào gốc tách thu nhận từ nhiều nguồn (phôi giai đoạn tiền làm tổ, thai, thể trưởng thành, ) Tủy vùng tế bào giúp sống Địa liên hệ: Hoàng Đạo Bảo Trâm, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh, 217 Hồng Bàng, Quận 5, TpHCM email: hoangdaobaotram@gmail.com Ngày nhận: 13/03/2013 Ngày chấp thuận: 20/6/2013 20 trì chức Tương tự tủy xương, tủy chứa tế bào gốc trung mơ Ngồi ra, tủy chứa tế bào tiền nguyên bào ngà, tế bào tạo máu Tế bào tủy nguyên liệu quan trọng cho nghiên cứu lĩnh vực tái tạo Sau thành công Gronthos năm 2000 việc phân lập nuôi cấy tế bào gốc tủy người [2], giới có nhiều nghiên cứu tiếp tục phát triển theo hướng Tại Việt Nam, số nghiên cứu cho kết nuôi cấy thành công tế bào từ mảnh mô tủy người [3; 4] Song song với việc phân lập tế bào gốc, kỹ thuật bảo quản tế bào gốc động vật phát triển mở kỷ nguyên công nghệ tế bào động vật Với mục tiêu xuyên suốt TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC lưu giữ tế bào trạng thái nguyên vẹn Tế bào gốc tủy thu nhận theo thời gian sử dụng sau cho mục đích nghiên cứu hay điều trị, việc bảo phương pháp tách với Trypsin/EDTA 0,25%; 0,02% Tế bào gốc tủy bảo quản quản tế bào gốc động vật bao hàm nhiều ý nghĩa thực tiễn: giảm thiểu biến đổi gen, môi trường DMEM/F12 bổ sung DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 10%, FBS 20% Tế bào ngăn cản biệt hóa tế bào, giảm nguy nhiễm khuẩn chết tế bào, giảm nhiễm chéo đông lạnh theo quy trình nhiệt: Quy trình 1: mẫu trải qua giai dòng tế bào, giảm nguy biến đổi cấu trúc đoạn điều kiện 4oC 20 phút -20oC thay đổi hình thái, giảm chi phí ni cấy [1] Về lý thuyết, tế bào gốc có khả phân 30 phút, sau chuyển sang bảo quản điều kiện -80oC; chia vô hạn, song nhiều nghiên cứu cho thấy tế bào phân chia nhiều lần Quy trình 2: mẫu trải giai đoạn điều kiện -20oC 20 phút, sau chuyển sang bảo khoản thời gian dài, xảy bất thường nhiễm sắc thể Trong đó, kỹ quản điều kiện -80oC thuật phân lập dòng tế bào gốc khó tuần, tuần, tế bào tiến hành giải đông môi trường nuôi cấy DMEM/F12 bổ sung khăn, việc bảo quản tế bào gốc cần thiết nhằm phục vụ mục đích nghiên cứu ứng dụng Một số kỹ thuật bảo quản tế bào gốc áp dụng phổ biến kỹ thuật đông lạnh kỹ thuật đông khô [1] Nghiên cứu tiến hành nhằm mục tiêu: bảo quản tế bào gốc tủy chuột áp dụng Sau thời gian đông lạnh ngày, tuần, FBS 20% Tỷ lệ sống chết tế bào xác định phương pháp nhuộm Trypan Blue, biểu marker CD73, CD90, CD105, CD19, CD34, CD45 đánh giá phương pháp Flow Cytometry quy trình nhiệt III KẾT QUẢ II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Tỷ lệ tế bào sống giải đông nuôi cấy sau bảo quản Tế bào gốc tủy chuột nhắt trắng Mus musculus var albino thu nhận Tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản đông lạnh phương pháp nuôi cấy mảnh mô tủy môi trường DMEM/F12 (Sigma) bổ sung ngày theo hai quy trình cao (> 90%), khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê huyết bào thai bò (FBS) 10% (Sigma), (p > 0,05) (bảng 1) Các tế bào đông lạnh sau Peniciline 100UI/ml (Sigma), Streptomycine 100 µg/ml (Sigma) điều kiện 37oC, CO2 5% giải đông tiếp tục nuôi cấy mơi trường có bổ sung huyết Bảng Tỷ lệ tế bào sống giải đông sau bảo quản ngày Tỷ lệ tế bào sống TCNCYH 83 (3) - 2013 Quy trình 4oC/20’ -20oC/30’ -80oC Quy trình 95% 94% 97% 97% 97% 98% -20oC/30’ -80oC 21 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Sau ngày, quan sát tượng tế bào bám bề mặt đĩa ni cấy, tế bào có hình dạng tương tự tế bào trước đưa vào bảo quản đơng lạnh (hình 1) Các tế bào tiếp tục tăng sinh ngày ni cấy Hình Hình ảnh qua hiển vi quang học đảo ngược: tế bào giải đông sau bảo quản đông lạnh ngày (a: x40; b: x200) Hình Hình ảnh qua hiển vi quang học đảo ngược: tế bào giải đông sau bảo quản hai tuần (a: x40; b: x200) Kết thu nhận sau ngày cho thấy hai quy trình đơng lạnh có hiệu tương đương Tuy nhiên, quy trình đơn giản tiết kiệm thời gian, tiếp tục áp dụng đánh giá với thời gian bảo quản dài hơn, thời điểm sau tuần, tuần tuần Tỷ lệ tế bào sống trung bình sau tuần, tuần, tuần bảo quản 95,2%, 65,6%, 17,3% Sau tuần bảo quản đông lệ tế bào sống giảm 20% (bảng 2) Kết cho thấy hiệu đông lạnh tế bào giảm dần theo thời gian Sự biểu marker bề mặt tế bào sau giải đông Sau giải đông nuôi cấy tế bào bảo quản đông lạnh thời gian tuần, tế bào bám bề mặt đĩa nuôi cấy sau ngày, tế bào có hình thái tương tự tế lạnh -80 C, trung bình tỷ lệ tế bào sống giảm từ 96,3% 95,2% Sau tuần, tỷ lệ tế bào trước bảo quản, với dạng hình thoi, dài bào sống trung bình 65,6% Sau tuần, tỷ tăng trưởng tốt, thời gian đạt mật độ o 22 100 - 120 µm, rộng 10 - 30 µm Các tế bào TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC hợp dòng ngày Khi tiến hành đánh giá biểu dương tính với marker CD73 đặc tính tế bào phương pháp Flow (98,08%), CD90 (91,3%), CD105 (98,76%) Cytometry, tế bào có biểu marker bề âm tính với marker CD19 (0,72%), CD34 mặt tế bào gốc trung mô, tiêu chuẩn (0,56%), CD45 (7,65%), tương tự tế Hiệp hội Quốc tế tế bào gốc [5] Tế bào có bào ni cấy trước bảo quản đơng lạnh (hình 3) Bảng Mật độ tỷ lệ tế bào sống giải đông sau bảo quản 2, tuần Thời gian bảo quản tuần tuần tuần Mẫu Mật độ tế bào (tb/ống) Tỷ lệ tế bào sống 4,88 x 106 95,7% 4,57 x 106 93,2% 4,34 x 106 96,6% 4,39 x 106 62,9% 4,06 x 106 63,5% 4,25 x 106 70,3% 5,01 x 106 15% 4,16 x 106 20% 17% 5,19 x 10 Hình Kết đánh giá marker bề mặt tế bào tủy chuột P4 sau bảo quản tuần TCNCYH 83 (3) - 2013 23 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Trong điều kiện nghiên cứu, o tế bào sinh ung thư Bảo quản nhằm lưu nhận thấy, quy trình bảo quản -80 C, thời gian bảo quản tốt vòng giữ tế bào trì đặc tính tế bào giúp có nguồn tế tuần bào gốc có sẵn với số lượng lớn, phục vụ cho nghiên cứu liệu pháp điều trị cần IV BÀN LUẬN Tế bào gốc trưởng thành tế bào thu nhận từ thể trưởng thành Tế bào Bên cạnh đó, q trình ni cấy tế bào đạt đến giai đoạn tối ưu thường không dễ dàng, thường bao qua nhiều giai đoạn nuôi cấy gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells MSC) tế bào có nguồn gốc trung sơ cấp từ mảnh mô, nuôi cấy thứ cấp qua nhiều hệ Do đó, việc lưu trữ dòng tế mơ có khả tự phân chia biệt hóa bào giúp tiết kiệm cơng sức, tiền bạc thời gian nghiên cứu thành nhiều dòng tế bào tế bào tạo sụn, xương, mỡ, mô liên kết đệm Do đó, MSC xem nguồn tế bào gốc nhiều triển vọng cho phương pháp điều trị liệu pháp tế bào MSC thu từ nhiều nguồn tủy xương, máu cuống rốn, mô mỡ, Trong đó, MSC từ nguồn tế bào tự thân thu nhận dễ dàng, gây xâm lấn bệnh nhân có tiềm biệt hóa thành loại tế bào Quần thể tế bào gốc tủy ít; xấp xỉ 1% tổng số tế bào q trình tích tuổi làm giảm dần khả tham gia tạo mô làm lành thương tế bào [6] Trong nghiên cứu in vitro hay nghiên cứu tiền lâm sàng ứng dụng lâm sàng, lượng tế bào gốc cần sử dụng thường lớn Việc nuôi cấy cho tế bào gốc tủy tăng sinh có vai trò cần thiết liệu pháp tế bào; nhiên, q trình ni cấy tăng sinh, tế bào có nguy tính gốc, cảm ứng tự biệt hóa… Do đó, tế bào gốc cần nuôi cấy để đạt số lượng tế bào cần thiết khoảng thời gian ngắn với số lần cấy chuyền Đối với tế bào đạt tới thời điểm tối ưu nhằm sử dụng nghiên cứu sau cho ứng dụng lâm sàng, việc kéo dài thời gian nuôi cấy làm gia tăng khả tính gốc tế bào gia tăng khả xuất 24 Trong nghiên cứu Ding cộng sự, tế bào nhú chóp (SCAP) bảo quản đông lạnh tháng nitrogen lỏng Các tác giả nhận thấy quy trình đông lạnh thực không ảnh hưởng tới đặc điểm hình thái, khả tăng sinh đặc tính kiểu hình tế bào Trong loại dung dịch bảo quản bao gồm DMSO 1% + trehalose 9% + FBS 90%, DMSO 4% + trehalose 6% + FBS 90%, DMSO 8% + trehalose 2% + FBS 90%, DMSO 10% + FBS 90%, dung dịch DMSO 4% + trehalose 6% + FBS 90% loại dung dịch bảo quản ưu việt nhất, cho mức độ tế bào sống cao, nâng khả biệt hóa giảm tác hại DMSO [7,8] Nhiều nghiên cứu chứng minh khả nuôi cấy lại tế bào gốc tủy sau bảo quản, tế bào trì đặc tính hình thái chức khả biệt hóa đa dòng (m ultilineage differentiation) [9; 10; 11] Nghiên cứu hướng tới thiết lập quy trình đơng lạnh, giải đông đơn giản, phù hợp với điều kiện hầu hết đơn vị nghiên cứu đơn vị lâm sàng Đối với trình bảo quản, mơi trường đơng lạnh, quy trình hạ nhiệt, quy trình giải đơng đóng vai trò quan trọng tính chất tế bào Môi trường đông lạnh sử dụng mơi trường DMSO 10% DMSO (Dimethyl Sulfoxide) có TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC đặc tính thấm qua màng tế bào cách thụ động, giảm tổn thương tế bào hạn chế hình thành tinh thể đá nội bào để bảo vệ tế bào, độc với tế bào nồng độ cao Do đó, DMSO thường sử dụng bảo quản tế bào nồng độ thấp - 10% Quy trình giảm nhiệt nghiên cứu quy trình thường sử dụng phòng nghiên cứu: 4oC 20 phút, -20oC vòng 30 phút, bảo quản lâu dài -80oC Việc giảm nhiệt độ bước nhằm hạn chế hình thành tinh thể đá phá vỡ tế bào Tuy nhiên, qua trình khảo sát, quy trình đơng lạnh giảm xuống -20oC 30 phút, sau bảo quản âm 80oC Hai quy trình có hiệu tương tự nên việc rút ngắn thời gian cần thiết Do mục đích hướng tới quy trình đơn giản, thuận tiện cho đơn vị nghiên cứu lẫn lâm sàng, nhiệt độ bảo quản sử dụng -80oC, nhiệt độ -196oC nhiều tài liệu bảo quản 196oC thích hợp bảo quản thời gian dài Kết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ tế bào sống giảm dần theo thời gian từ tuần (95,2%), đến tuần (65,6%) tuần (17,3%) Ngồi ra, q trình bảo quản đơng lạnh có khả V KẾT LUẬN Thử nghiệm thực quy trình bảo quản tế bào gốc tủy chuột nhắt trắng Mus musculus var albino Kết thử nghiệm cho thấy khả bảo quản tế bào tủy chuột thời gian tuần theo quy trình để điều kiện -20oC 20 phút bảo quản 80oC; tế bào nuôi cấy sau trình bảo quản đơng lạnh trì tính gốc Lời cảm ơn Đề tài thực nguồn kính phí chương trình khoa học cơng nghệ trọng điểm cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng phát triển công nghệ tiên tiến phục vụ bảo vệ chăm sóc sức khỏe cộng đồng”, mã số KC.10/11-15, Bộ Khoa học Công nghệ TÀI LIỆU THAM KHẢO Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trương Định (2010) Công nghệ tế bào gốc Nhà xuất giáo dục Việt Nam, 30 - 35 Gronthos S., Makani M., Brahim J et al (2000) Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo Proc Natl gây tổn thương tế bào, chất lượng tế bào sau rã đông khảo sát Sau Acad Sci USA, 97,(25), 13625 - 13630 tuần bảo quản, tế bào trì dạng Trinh, Nguyễn Thị Nhật Uyên cộng hình thoi đặc trưng Thời gian tế bào đạt mật độ hợp dòng tương tự với tế bào trước (2011) Nuôi cấy tế bào gốc từ tủy người Tạp chí cơng nghệ sinh học, 9(3), 297 - 301 đông lạnh Các kết khảo sát biểu marker bề mặt tế bào giải đông cho thấy Trần Lê Bảo Hà, Đồn Ngun Vũ, Tơ Đồn Ngun Vũ, Phạm Trần Hương tế bào giải đông biểu marker tương tự tế bào nuôi cấy trước đông Minh Quân cộng (2011) Study on culture of human dental pulp stem cells to apply in tissue engineering Journal of Biomimetics lạnh: dương tính với marker tế bào trung Biomaterials & Tissue Engineering 11, 13 - 20 mơ CD73, CD90, CD105 âm tính với marker tế bào trung mô CD19, CD34, CD45 Kết thử nghiệm cho thấy tế bào gốc tủy bảo quản thành công thời gian tuần theo quy trình nhiệt -80oC TCNCYH 83 (3) - 2013 Domicini M., Le Blanc K., Mueller I et al (2006) Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells The International Society for Cellular Therapy position statement Cytotherapy, 8(4), 315 - 317 Smith AJ, Patel M., Graham L et al 25 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC (2005) Dentine regeneration: key roles for stem cells and molecular signalling Oral Biosciences and Medicine, 2, 127 - 132 et al (2006) Long - term cryopreservation of dental pulp stem cells (SBP - DPSCs) and their differentiated osteoblasts: a cell source for Ding G., Wang W., Liu Y et al (2010) Effet of cryopreservation on biological and tissue repair, J Cell Physiol, 208(2), 319 - 25 10 Perry B.C., Zhou D., Wu X Et al immunological properties of stem cells from apical papilla Journal of Cellular Physiology (2008) Collection, cryopreservation, and characterization of human dental pulp-derived 223, 415 - 422 mesenchymal stem cells for banking and De Rosa A., De Francesco F., Tirino V et al (2009) A new method for cryopreserving adipose-derived stem cells: an attractive and suitable large-scale and long-term cell banking clinical use Tissue Eng Part C Methods, 14 (2), 149 - 156 technology Tissue Eng Part C Methods, 15(4), 659 - 667 Papaccio G., Graziano A., d'Aquino R 11 Zhang W., Walboomers X.F., Shi S et al (2006) Multilineage differentiation potential of stem cells derived from human dental pulp after cryopreservation Tissue Eng, 12(10), 2813 - 2823 Summary CRYOPRESERVATION OF DENTAL PULP STEM CELLS OF MICE Dental pulp stem cells of mice (Mus musculus var albino) (DPSCs) were preserved by procedures: (1) 4oC/20mins, then -20oC/30mins, and stored at -80oC; (2) -20oC/30mins, and stored at -80oC Dental pulp fragments were cultured in 35mm-dish with DMEM/F12, supplemented with 10% FBS, 100UI/ml Peniciline and 100µg/ml Streptomycine, at 37oC and 5% CO2 The cell viability was measured by trypan blue exclusion method after day, weeks, weeks and weeks Dental pulp stem cells were identified using flow cytometry method Cultured population of cells (P4) expressed in high level of mesenchymal stem cells as CD73, CD90, CD105 and low level of endothelial hematopoietic cells as CD19, CD34, CD45 The result showed that mice DPSCs were sucessfully cryopreserved by the following procedure: 20oC/30mins, and stored at -80oC in weeks After thawing, cells adhered, developed and expressed some of the markers of the mesenchymal stem cells such as CD73, CD90, CD105 and did not express some of the markers of the hematoeic stem cells such as CD19, CD34, CD45 Keywords: dental pulp stem cells (DPSC), cell cryopreservation, cell culture 26 TCNCYH 83 (3) - 2013 ... q trình bảo quản đơng lạnh có khả V KẾT LUẬN Thử nghiệm thực quy trình bảo quản tế bào gốc tủy chuột nhắt trắng Mus musculus var albino Kết thử nghiệm cho thấy khả bảo quản tế bào tủy chuột thời... gian bảo quản tốt vòng giữ tế bào trì đặc tính tế bào giúp có nguồn tế tuần bào gốc có sẵn với số lượng lớn, phục vụ cho nghiên cứu liệu pháp điều trị cần IV BÀN LUẬN Tế bào gốc trưởng thành tế bào. .. thấm qua màng tế bào cách thụ động, giảm tổn thương tế bào hạn chế hình thành tinh thể đá nội bào để bảo vệ tế bào, độc với tế bào nồng độ cao Do đó, DMSO thường sử dụng bảo quản tế bào nồng độ