Phân lập isorhamnetin, kaempferol và quercetin từ lá bạch quả (ginkgo biloba)

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Khảo sát hệ dung môi định tính cao bạch quả bằng phương pháp TLC - Phân lập và tinh chế isorhamnetin, kaempferol và quercetin có trong cao lá bạch quả - Khảo sát

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BẤCH KHOA

LÊ ĐOÀN QUỲNH NHƯ

PHÂN LẬP ISORHAMNETIN, KAEMPFEROL VÀ

QUERCETIN TỪ LÁ BẠCH QUẢ (GINKGO BILOBA)

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học

Mã số: 60520301

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HÒ CHÍ MINH, 2017

2/100

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

Cán bộ hướng dẫn khoa học: Tiến sĩ Huỳnh Khánh Duy và Tiến sĩ Tống Thanh Danh

Cán bộ chấm nhận xét 1 : PGS.TS NGUYỄN THỊ LAN PHI

2 Thu ký hội đong: TS PHAN THỊ HOÀNG ANH

3 ủy viên Phản biện LPGS.TS NGUYỄN THỊ LAN PHI

4 ựỹ viên Phản biện 2: TS TRẦN NGỌC QUYÊN

5 ủý viện Hội đồng: TS LÊ XUẨN lĨẾN

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đảnh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khỉ luận văn đã được sửa chữa

3! 100

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHÙ NGHĨA VIỆT NAM

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Lê Đoàn Quỳnh Như Ngày, tháng, năm sinh: 21/03/1992 Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học

I TÊN ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP ISORHAMNEHN, KAEMPFEROL VÀ QUERCETIN

TỪ LÁ BẠCH QUẢ (GINKGO BILOBA)

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Khảo sát hệ dung môi định tính cao bạch quả bằng phương pháp TLC

- Phân lập và tinh chế isorhamnetin, kaempferol và quercetin có trong cao lá bạch quả

- Khảo sát điều kiện thủy phân cao bạch quả (cao FL) trên các phương pháp chiết Soxhlet one- pot, phương pháp có sử dụng hỗ trợ vi sóng, siêu âm; từ đó tìm điều kiện tốt hơn cả đối với từng phương pháp

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 04/07/2016

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHỆM VỤ: 04/12/2106

Tp HCM, ngày tháng năm 2017

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

MSHV: 1570176 Nơi sinh: TP.HCM

Mã số: 60 52 03 01

4/100

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ vô cùng quý báu của quý thầy

cô, các anh chị, các bạn trường Đại học Bách khoa Tp.HCM, gia đình và bạn bè về sự động viên, giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành đến:

TS Huỳnh Khánh Duy, TS Tống Thanh Danh đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài

Quý thầy cô trường Đại học Bách khoa Tp.HCM đã tận tình giảng dạy và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Chị Nguyễn Lê Mỹ Tiên và bạn Trần Đỗ Anh Khoa và bạn Lâm Quốc Hoàng đã tạo mọi điều kiện và hỗ trợ cho tôi trong suốt khóa học và thời gian thực hiện đề tài

Gia đình và bạn bè đã luôn động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn

6/100

TÓM TẮT LUẬN VĂN

•

Đề tài “Phân lập isorhamnetin, kaempferol và quercetin từ lá bạch quả (Ginkgo 011000)” đã phân

lập được ba flavonoid chính trong cao bạch quả là isorhamnetin, kaempferol và quercetin thông qua việc thực hiện khảo sát trên một số phương pháp tìm ra điều kiện tốt trong việc phân lập, tạo

cho công tác kiểm ha chất lượng các chế phẩm có thành phần cao lá bạch quả trên thị trường

5/ 100

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công

bố trong bất kì công trình nào khác

7/100

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

8/100

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 4

LỜI CAM ĐOAN 5

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 7

I Tổng quan tài liệu 12

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 12

1.2 Yêu cầu thực tiễn 14

1.3 Các cách tiếp cận đã công bố để giải quyết vấn đề 15

1.4 Định hướng nghiên cứu 32

1.4.1 Đối tượng nghiên cứu 32

1.4.2 Nguyên liệu và thiết bị 33

1.5 Phương pháp thực hiện 34

1.6 Phương pháp kiểm định sản phẩm 41

II KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 41

2.1 Định danh dược liệu lá bạch quả 41

2.2 Khảo sát khả năng phân lập các flavonoid trong cao lá bạch quả qua phương thức chiết- thủy phân một bước 43

2.2.1 Thủy phân không có sự hỗ trợ của vi sóng 43

2.2.2 Thủy phân có sự hỗ trợ của vi sóng 51

2.3 Khảo sát khả năng phân lập các flavonoid trong cao lá bạch quả qua các phương thức chiết- thủy phân một bước 56

2.3.1 Phương pháp chiết Soxhlet one-pot 56

2.3.2 Phương pháp chiết với sự hỗ trợ của siêu âm 59

III KẾT LUẬN-KIẾN NGHỊ 64

3.1 Kếtluận: 64

3.2 Kiến nghị 65

IV TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

PHỤ LỤC 70

9/100

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1-1 Cây bạch quả (Gingko Bibola) 12

Hình 1-2 Lá cây bạch quả (Gingko Bibola) 13

Hình 1-3 Quả bạch quả (Gingko Bibola) 14

Hình 1-4 Cấu trúc phức vòng càng aluminium chloride của quercetin 16

Hình 1-5 Quy trình phân tích theo Hasler 18

Hình II-1 Vi phẫu của lá bạch quả 42

Hình II-2 TLC hệ dung môi đã khảo sát 44

10 /100

DANH MỤC BẢNG SỬ DỤNG

Bảng 1-1 Cấu trúc hóa học của Ginkgo Bibola flavonoids 15

Bảng 1-2 Quy trình phân lập và phân tích các flavonoid trong lá bạch quả 19

Bảng 1-3 Hàm lượng các aglycone (mg/g) thu được 20

21

Bảng 1-5 Kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả Jing Zhang 23

Bảng 1-6 Chương trình pha động rửa giải xác định phổ vân tay dịch chiết cao bạch quả trong nghiên cứu của tác giả A Chandra 24

Bảng 1-7 Chương trình pha động rửa giải xác định phổ vân tay dịch chiết cao bạch quả trong nghiên cứu của tác giả Amitabh 24

Bảng 1-8 Chương trình pha động rửa giải xác định phổ vân tay dịch chiết cao bạch quả trong nghiên cứu của tác giả Jiun-Lung Luo 25

Bảng 1-9 Nghiên cứu khả năng hấp phụ của màng lọc kỵ nước và màng trao đổi Ĩon27 Bảng 1-10 Đối chiếu điều kiện chạy HPLC của hai phương pháp của dược điển Anh (EP) và NSF - INA : 29

Bảng I-11 Hàm lượng flavonoid tổng chiết ra được qua hai phương pháp 29

Bảng 1-12 Hàm lượng flavone aglycone tổng của 13 loại lá bạch quả ở 13 môi trường sống khác nhau theo Dược điển Trung Quốc 30

Bảng 1-13 Hóa chất dùng trong chiết tách và thủy phân hóa học 33

Bảng 1-14 Dung môi dùng trong tinh chế và sắc ký 33

Bảng II-1 Ket quả khảo sát hệ dung môi phân tích cao FL 43

Bảng II-2 Dữ liệu phổ 1H NMR của chất K 45

Bảng II-3 Dữ liệu phổ 13C NMR của chất K 45

Bảng II-4 Dữ liệu phổ 1H NMR của chất Q 47

Bảng II-5 Dữ liệu phổ 13C NMR của chất Q 48

Bảng II-6 Dữ liệu phổ 1H NMR của chất 1 49

Bảng II-7 Dữ liệu phổ 13C NMR của chất 1 50

Bảng II-8 Điều kiện phản ứng của phương pháp chiết thủy phân có sự hỗ ttợ của vi sóng 52

Bảng II-9 Điều kiện phản ứng của phương pháp chiết Soxhlet one-pot 56 Bảng 1-4 Kết quả khảo sát giữa kết họp vói vi sóng (MAH) và đun hoàn lưu thông thường (CRH)

Bảng II-10 Điều kiện phản ứng của phương pháp chiết với sự hỗ ttợ của siêu âm.59

11/100

DANH MỤC BIỂU ĐỒ SỬ DỤNG

Biểu đồ II-1 Hàm lượng chất I trong cao FL của phương pháp thủy phân có sự hỗ trợ của vi sóng 53 Biểu đồ II-2 Hàm lượng chất Q trong cao FL của phương pháp thủy phân có sự hỗ trợ của vi sóng 53 Biểu đồ II-3 Hàm lượng chất K trong cao FL của phương pháp thủy phân có sự hỗ trợ của vi sóng 54 Biểu đồ II-4 Hàm lượng trong cao FL của chất Q của phương pháp chiết Soxhlet one-pot 57 Biểu đồ II-5 Hàm lượng trong cao FL của chất K của phương pháp chiết Soxhlet one-pot 58 Biểu đồ II-6 Hàm lượng trong cao FL của chất I của phương pháp chiết với sự hỗ trợ của siêu âm 61 Biểu đồ II-7 Hàm lượng trong cao FL của chất Q của phương pháp chiết với sự hỗ trợ của siêu âm 61 Biểu đồ n-8 Hàm lượng Uong cao FL của chất K của phương pháp chiết với sự hỗ Uợ của siêu âm 62

12/100

I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Bạch quả (Ginkgo biỉoba) là loài cây thân gỗ duy nhất còn sinh tần trong chỉ

Ginkgo, họ Ginkgoaceae Đây được xem là loại dược thảo được kê toa nhiều nhất ở Đức và là một

trong những liệu pháp điều trị thông dụng nhất ở Mỹ[l] Lượng thục phẩm chức năng chứa bạch quả được sử dụng tăng đáng kể ở Mỹ trong những năm gần đây Theo báo cáo thường niên của Nutrition Business Journal năm 2012, cao chiết từ lá bạch quả đứng thứ 37 trong danh sách thực phẩm chức năng bán chạy nhất tại Mỹ, và đứng thứ 13 về doanh số bán khi cán mốc 90 triệu USD Ước tính cho thấy khoảng 3 triệu người trên đất Mỹ sử dụng sản phẩm chứa bạch quả vào năm 2007, và chỉ 5 năm sau đó con số này gia tăng đều đến 7,7 triệu người sử dụng và doanh số đạt mức 151 triệu USD [2]

Dữ liệu của IMS Health MIDAS [3] cho thấy tổng doanh số bán trên toàn thế giới năm 2012 của sản

phẩm Gỉnkgo bỉbola đặt 1,26 tỷ USD Tuy vậy, vẫn cố những báo cáo thường xuyên về việc làm giả sản phẩm Ginkgo biỉoba hay sản phẩm kém chất lượng [4]

Hình 1-1 Cây bạch quả (Gingko Bibola)

13/ 100

Hình 1-2 Lả cây bạch quả (Gingko Biboỉa)

Lá và quả bạch quả được sử dụng nhiều trong y học Những nghiên cứu ứng dụng bạch quả đã được công bố như điều tộ hen suyễn, viêm phế quản, bệnh tim mạch, tăng cường lưu lượng máu ngoại

vi, đỉều trị suy giảm chức năng não [5] [6] Ngoài ra, bạch quả còn được sử dụng trong điều trị dị ứng, chứng ù tai, loạn trí, và các vấn đề về trí nhớ [7], [8], [9] Tổ chức y tế thế giới và ủy ban E của Đức đã thêm vào ứng dụng của bạch quả đối với bệnh tắc nghẽn động mạch ngoại biên Các nghiên cứu trước đó được thực hiện bằng phương pháp chiết xuất cao bạch quả chuẩn cũng đã cho thấy được những hiệu quả trong việc điều trị ở các thời kỳ đầu của chứng mất trí, bệnh tắc động mạch ngoại biên, suy não do thiếu lưu lượng máu đầy đủ và các bệnh liên quan khác [10] [11] [12] [13], Gần đây, một số thử nghiệm lâm sàng để đánh giá khả năng nhận thức của bệnh Alzheimer [14], bệnh đa xơ cứng và bệnh động mạch ngoại biên đã được tiến hành với kết quả hỗn hợp [15] [16] [17] [18] [19] [20]

14/100

Hình 1-3 Quả bạch quả (Gỉngko Bỉbola)

1.2 Yêu cầu thục tiễn

Sụ tiêu thụ ngày càng cao cùng với thị trường mỗi lúc một mở rộng là nguồn động lực to lớn không ngừng thôi thúc các nhà khoa học nghiên cứu về cao chiết từ lá của loại dược thảo kỳ diệu này

Cỏ rất nhiều hợp chất frong Ginkgo biloba như flavonoids, terpene frilactones,

proanthocyanidmes, ginkgolic acids, biflavone, polyflavones and ginkgotoxins [21] [22], tuy nhiên không hẳn thành phần nào cũng mang hoạt chất Cao chuẩn (chiết xuất từ lá bạch quả) (như

EGb76® và LI 1370®) cỏ thể xem là đại diện cho dược tính của Ginkgo biloba với thành phần Gỉnkgolide A, B, c, J N2L bilobalỉde hàm lượng từ (5-Ỉ-7) % và flavonoids chiếm khoảng (22-Ỉ-27)

một nửa phân tử đường

15/100

bạch quả, qua đó tiến hành đánh giá một số chế phẩm đang lưu hành trên thị trường, tôỉ quyết định

nhằm xây dựng phương pháp kiểm nghiệm một số chế phẩm có thành phần bạch quả trên thị trường”

1.3 Các cách tiếp cận đã công bố để giải quyết vấn đề

Việc sử dụng bạch quả dùng để chữa bệnh đã từ lâu ở Trung Quốc Nhưng những chế phẩm hiện đại từ bạch quả lạỉ không bắt nguồn từ y học cổ truyền Nghiên cứu về bạch quả lần đầu tiên được tiến hành bởi một công tỵ dược phẩm Dr w Schwabe, Karlsruhe (Đức) Họ giới thiệu sản phẩm cao chiết từ lá bạch quả vào năm 1965 như một sản phẩm điều trị các bệnh do tuổi già

Cỏ rất nhiều phòng nghiên cứu tiến hành nghiên cứu về các thành phần trong lá bạch quả Trong đố, thành phần flavonoid trong lá bạch quả được ưu tiên như là những hoạt chất có hoạt tính

Bảng 1-1 Cấu trúc hóa học của Ginkgo Biboỉa flavonoids

Theo xu thê của những cuộc nghiên cứu nhăm tạo ra nguôn cung thỏa mãn nhu câu

thị trường cũng như để tìm hiểu và nghiên cứu các flavonoid trong cao chiết từ lá

16/100

sinh học để chữa bệnh

Một trong những phương pháp cổ điển thường dùng để xác định hàm lượng flavonoid ưong những thảo dược là dùng quang phổ hấp thụ để đo phức càng cua của các aglycone với aluminium chloride Nhưng đối với là bạch quả, phương pháp này lại không cho tái lặp về kết quả Nguyên nhân

là do quá trình chiết không hoàn toàn do sự phân cực của các flanvonol glycoside (chiết bằng acetone)

và do lượng proanthocyanỉdine, chất gây nhiễu, quả nhiều [23] Đề cải thiện tăng độ chọn lọc của phép phân tích, HPLC kết hợp với đầu dò DAD được sử dụng đề phân tích cả các flavonoid glycoside

và aglycone

Hình ỉ-4 Cấu trúc phức vòng càng aluminium chloride của quercetin,

Các hợp chất flavanol glycoside khỉ được thủy phân sẽ tạo ra các aglycone tương ứng Những hợp chất này khỉ khảo sát phổ uv thì cho bước sóng chọn lọc trên 300 nm Sau khi tiến hành thủy phân cảc flavanol glycoside bằng methanolic HC1, HPLC được sử dụng đề định lượng các aglycone chính gồm quercetin, keampferol, ỉsorhamnetin và những aglycone hàm lượng rất ít như myricetin và luteoỉin thay thế cho hơn 20 hợp chất flavanol glycoside [24] Cả haỉ nhóm nghiên cứu của Schennen (1988) lẫn của Wagner (1989) đều tiền tinh chế hỗn hợp qua Sephadex LH-20

Schennen và các cộng sự đã sử dụng cột LiChroCart RP-18 với cột bảo vệ RP- 8 cùng hệ dung môi methanol-water-formic acid (55:41:4) Nội chuẩn được sử dụng là rutin Còn về nhóm nghiên cứu của Wagner thì tiến hành sử dụng cột Nucleosil C18 (5 pm) với hệ dung môi chạy gradient là methanol- nước Phương pháp sử dụng là phương pháp nội chuẩn [24],

17/100

Ở Hàn Quốc, Kim cùng một số nhà khoa học khác cũng tiến hành xác định mức độ ổn định của các hợp chất flavonol glycoside chính trong pha dung dịch của chiết suất bạch quả theo pH Kết quả cho thấy mức pH tối ưu cho việc lưu trữ là 6,5.Thời gian lưu trữ có thể lên tới 4 năm với điều kiện pH như trên tại 20°C Các aglycone hình thành được phân tích bằng HPLC trên LiChrosorb RP-

18 (10pm) với acetonitrile-isopropanol-nước-citric acid (50: 6:100:1) là dung môi pha động và phát hiện ƯV tại 365nm

Hai phương pháp phân tích các flanovol glycoside trong lá, cao và phytomedicine đã được Hasler phát triển [23] [25], Phương pháp I cho phép định tính và định lượng các aglycone sau khi đã thủy phân các flavonol glycoside Quy trình chuẩn bị mẫu gồm hai bước đơn giản: chiết kết hợp thủy phân các glycoside và quá trình làm sạch mẫu (clean- up) Sau cùng, lấy dịch chiết đã được tinh chế tiến hành phân tích bằng HPLC Các flavonol aglycone được phân tích trên cột RP- HPLC (vd: Hypersil ODS; 5 |im) sử dụng pha động 0,5 % (v/v) oríAo-phosphoric trong nước và dầu dò uv tại bước sóng 370 nm

bị đảo ngược

Yao (1995a) [24] cũng tiến hành phân tích là bạch quả bằng cách chiết bằng lưu chất siêu tới hạn (SFE) Kết quả tối ưu thu được ở áp suất 28 MPa, 40 °C và 13 % methanol trong carbon dioxide Độ thu hồi là 87,3 % với RSD = 5,4 % Tỷ lệ phần trăm Flavonoid lên đến 1,4 % đã được tìm thấy trong lả cao hơn bình thường Ưu điểm của phương pháp này là hàm lượng dung môi tồn dư thấp, hiệu quả chiết cao và điều kiện êm dịu (không phân hủy)

Fengxia Deng và s William Zito [26] đã phát triển phương pháp và thẩm định bằng GC-MS để định tính cũng như định lượng các hợp chất flavonoid cũng như các terpenoid trong cao bạch quả và những chế phẩm trên thị trường Phương pháp gồm hai bước:

Chuẩn bị mẫu và tạo dẫn xuất: cao bạch quả và các chế phẩm được thủy phân trong môi trường acid kết hợp siêu âm Hỗn hợp sẽ được lỵ tâm và tiến hành tạo dẫn xuất bằng DMF và BSTFA

Phân tích bằng GC-MS sử dụng nguồn ỉon hỏa EI Quá trình định danh được thực hiện vối chế độ

Lả hoặc cao khô

glycoside

ChạyHPLC bệ gradient McOH' H1O

3 aglycone

19/100

SCAN mode ữong khoảng (70 -ỉ- 650) m/z

Kết quả cho thấy độ thu hồi của quá trình chiết cao trên 95 %, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) thấp (5 -ỉ- 8) %

Nhóm nghiên cứu người Mỹ đến từ National Institute of Standards and Technology (NIST) [27] đã tiến hành khảo sát quả trình phân lập và phân tích các flavonoid trong lả bạch quả, cao bạch quả cũng như

Bảng 1-2 Quy trình phần ỉập và phân tích các flavonoid trong lả bạch quả

20/100

Ừong5 phút

Hòa tan trong 5 phút tại 100 °C

3 LC/UV (ChromaDex)

Đun hoàn lưu

HC1 trong methanol

Thời gian lh

CộtC18, đẳng dung môi methanol/ nước (45:55)

Bước sống hấp thu 370

nm

4 LC/UV (NSF international)

Đánh siêu âm

Ethanol/

nước/ HC1 (50:20:8)

Từ5đến

60 phút

CộtODS3 C18, hệ đẳng dung môi acetonitrile/

nước (50:50)

Bước sóng hấp thu 370

Siêu âm frong 5 phút

CộtODS3 C18, hệ đẳng dung môi acetonitrile/

nước (50:50)

Bước sóng hấp thu 370

21/100

Y Zhang et al [28] tiến hành thủy phân cao bạch quả với sự hỗ trợ của vỉ sống Kết quả sau khỉ tiến

hành tối ưu, dung môi n-propanol, nồng độ HC1 là 36% với thể tích 7,5 mL, công suất vỉ sóng là 300 MW trong thời gian 2 phút So với các phương pháp thủy phân acid thông thường, khỉ có sự hỗ trợ của vỉ sóng cỏ những lợi thế nhất định như tiết kiệm thời gian và chi phí thấp hơn Ngoài ra, một lò vi sóng của phòng thí nghiệm có thể thục hiện phản ứng cùng lúc trong 14 buồng phản ứng, do đố tăng đáng kể thông lượng của quá trình thủy phân của EGb Hơn nữa, quá trình thủy phân được hoàn thành trong một môi trường kín Phương pháp này cũng là thân thiện vối môi trường, và số lượng tiêu thụ dung môi là nhỏ hơn so với lượng tiêu thụ trong các phương pháp thủy phân dùng đun hoàn lưu thông thường Kết quả khảo sát giữa kết hợp với vi sóng (MAH) và đun hoàn lưu thông thường (CRH) được thể hiện ở Bảng 1-4 Mặc dù hàm lượng của

cả 2 cách đều tương đương nhưng thời gian của MAH chỉ có 2 phút

BảngI-4 Kấ quả khảo sái gịữakẳ hợp vớìvi sóng (MAH) và đunhữànỉưu thông ửtường(CRH)

(%)(n = 5)

RSD (%)

Flavonol glycosides (%)(n = 5)

RSD (%)

22/100

Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) được dùng là tác nhân giải hấp các flavonoid, dựa trên khả năng tạo phức của EDTA với ion kẽm mạnh hơn flavonid Thành phần các flavonoid sau khi tinh chế được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), kết quả cho thấy phương pháp tinh chế có độ họn lọc cao đối với flavonoid, trong đó có các aglycone của quercetin và kaempferol Hoạt tính chống oxy hóa của dịch trước và sau khi tinh chế được đánh giá dựa trên gốc tự do 2,2-dimethyl-l-peakryl-hydrazyl (DPPH), kết quả cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết hầu như không thay đổi sau khi được tinh chế

Phản ứng tổng hợp tạo phức được thực hiện trong môi trường pH từ 5,50 đến 10,50 Kết quả cho thấy,

pH tăng từ 5,50- 9,50 thành phần phức flavonoid tạo thành tăng, tỷ lệ phức tạo thành cao nhất đạt được là 79,9 % tại pH 9,50 Tại pH thấp hơn 9,50; ion hydroxyl từ natri hydroxid làm tăng khả năng khử proton của flavonoid và làm cho các ligand dễ dàng tạo thành phức Khi giá trị pH tăng lên 10,50; quá trình tạo phức giảm, do tại pH cao các ion kim loại có khuynh hướng tạo thành dạng kim loại hydroxide, ngoài ra nó cũng gây ra hiện tượng tách proton từ phức

Nhóm nghiên cứu cũng tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ ZnSŨ4 : EGb đến sự hình thành của phức với các tỷ lệ: 0,10 : 10; 0,15 : 1,0; 0,2 : 1,0; 0,25:1,0 và 0,3 : 1,0 tương ứng với kẽm ZnSŨ4 và EGb, tại

pH 9,50 Khi gia tăng tỷ lệ của hai tác chất, hàm lượng flavonoid tinh khiết tăng và đạt được giá trị cao nhất ứng với tỷ lệ ZnSŨ4 : EGb là 0,2 : 1,0 Và khi tiếp tục tăng tỷ lệ của hai tác chất, nhóm tác giả thấy hàm lượng flavonoid tinh khiết giảm; điều này được giải thích là do có sự tạo phức của ion kẽm với các tạp chất khác có trong dịch chiết như: các acid hữu cơ, D- glucaric và các acid ginkgolic Do đó, hàm lượng flavonid

sẽ giảm khi tiến hành giải hấp thu

Nồng độ EGb cũng là yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tinh chế flavonoid Nghiên cứu tiến được tiến hành tại pH 9,50; với tỷ lệ ZnSƠ4: EGb là 0,2 :1,0; nồng độ EGb dao động từ (0,5 -ỉ- 2,0) % (kl/tt methanol) Kết quả cho thấy, với nồng độ EGb cao hơn 1,0% (kl/tt) hàm lượng flavonoid tỉnh khiết sẽ giảm dần, do sự cạnh tranh tạo phức của các hợp chất khác cố trong dịch chiết với flavonoid

Qua kết quả nghiên cứu, nhóm tác già nhận xét phương pháp tinh chế flavonoid từ dịch chiết lá bạch quả (EGb) bằng phương pháp tạo phức với ỉon kẽm là phương pháp đơn giản, làm gia tăng hàm lượng các flavonoid tinh khiết (kết quả được trình bày trong Bảng 1-5), ngoài ra hoạt tính sinh học của các flavonoid không bị mất đi sau quá trình tinh chế

Bảng 1-5 Kết quả nghiên cứu của nhỏm tác giả Jing Zhang

23/100

Quercetin

(%)

Keampferol (%)

Isorhamnetin

(%)

£ hàm lượng flavonoid (%)

sp tinh chế 49,03 ±2,37 3,28 ±0,13 1,75 ±0,27 54,07 ±2,71

Sau đó nhỏm của Jing Zhang [30] tiếp tục tiến hành sử dụng nhựa polyamide cho quá trình phân lập

và tinh chế các flavonoid trong hỗn hợp của cao bạch quả Nhóm tiến hành đảnh giả bằng cao bạch quả chuẩn

có hàm lượng flavone glycoside ban đầu là 24 % Sau khi hoạt hóa cột sử dụng nhựa polyamide, dung dịch cao bạch quả trong ethanol được tiến hành cho hấp phụ trên cột cho đến khỉ đạt cân bằng Quá trình giải hấp phụ được tiến hành bằng cách cho ethanol 30 % qua cột với tốc độ 1,8 mL/ph Hàm lượng flavone glycoside được đánh giá bằng HPLC- PDA cho kết quả tăng lên đảng kể tới 55 % so vớỉ lượng ban đầu là 24 % Amỉtabh Chandra và các cộng sự [31] đã tiến hành kiềm Ưa chất lượng nhiều dạng chế phẩm thương mại trên thị trường Nhốm nghiên cứu tiến hành đánh giả và phân tích các chế phẩm bằng 2 phương pháp:

So sánh phổ vân tay của các flavone glycoside đối với dịch chiết chưa thủy

phân

Xác định tổng hàm lượng các flavone glycoside đối vói dịch chiết đã thủy phân

Phương pháp HPLC- DAD được tác giả dùng đề tiến hành khảo sát phổ vân tay từ dịch chiết bạch quả, với Cột C18 Zorbax 150 mm X 4,6 mm X 5|im, bước sóng phát hiện: 340 nm Pha động gồm H3PO4 0,2 % - MeOH - ACN, theo chương trình rửa giải được trình bày trong Bảng 1-6

Bảng 1-6 Chương trình pha động rửa giải xác định phổ vân tay dịch chiết cao bạch quả trong nghiên cứu

cứa tác giả A Chandra

Thời gian (phút) % II3PO4 (0,2 %) % MeOH % ACN

24/100

bước sóng phát hiện: 370 nm Pha động gồm H3PO4 0,2 % - ACN, theo chương trình rửa giải được trình bày

Bảng 1-7 Chương trình pha động rửa giải xác định phổ vân tay dịch chiết cao bạch quả trong nghiên cửu

của tảc giả Amỉtabh

Thời gian (phút) % H3PO4 (0,2 %) % ACN

Các flavonoid và trỉlactone terpen là các thành phần có hoạt tính dược lý trong dịch chiết của lá bạch quả Mặc dù flavonoid có thể được tìm thấy trong nhiều loại cây khác nhau, nhưng các ginkgolide và bilobalid

là các thành phần đặc trưng của bạch quả, ngoài ra tám dỉterpenoid cũng được tìm thấy trong bạch quả Trước đây, các nghiên cứu thiết lập phổ vân tay cho cao bạch quả được thực hiện bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò tử ngoại (HPLC/UV) Tuy nhiên, phương pháp này không phù hợp để xác định các trilactone terpen, do khả năng hấp thụ uv kém Vì vậy, nhóm nghiên cứu Jiun-Lung Luo [32] đã tiến hành thiết lập sắc ký đồ vân tay của dịch chiết lá và cao bạch quả bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò khối phổ TOF Điều kiện tiến hành sắc ký được tác giả ghi nhận:

o Cột C18, 150 mm X 43,0 mm X 2,5ịim

o Thể tích tiêm: 0,1|1L

o Nhiệt độ buồng cột: 30 °C

o Pha động gồm A(HCOOH/HiO 0,1 %) - B (HCOOH/MeOH 0,1 %), theo theo chương trình rửa giải

Bảng ỉ-8, Chương trình pha động rửa giải xác định phổ vân tay địch chiết cao bạch quả trong nghiên cứu

của tác giả Jiun-Lung Luo

Phương pháp phân tích khối phổ có thể dùng để xác định cấu trúc của các hợp chất mà không cần dùng

chuẩn đối chiếu, do đó đây là một phương pháp định tính khá hiệu quả Bằng phương pháp HPLC- Q-

TOF/MS, tác giả đã phát hiện 7 flavonoid glycoside 1-7 chưa được biết đến trước đây trong dịch chiết

cao bạch quả (trước khi được acid hóa), bằng sự phỏng đoán dựa trên sự phân mảnh của các hợp chất;

do phổ khối mang tính chất đặc trưng cho mỗi flavonoid Ngoài ra, phương pháp cũng được sử dụng để

phân tích và định lượng các sản phẩm từ bạch quả có chứa nhiều thành phần phức tạp, với thời gian phân

tích tối ưu hơn so với những phương pháp trước đây

Nhóm z Xu [33] thì tiến hành tinh chế cao bạch quả bằng phương pháp siêu lọc (ultrafiltration) sử dụng PVDF biến tính làm màng lọc Cao bạch quả thô được hòa tan trong ethanol 30% và được đưa qua

hệ thống màng lọc Kết quả HPLC cho thấy hàm lượng flavonoid của sản phẩm sau khi lọc tăng từ 21,3

wt.% lên 34,8 wt.% Ưu điểm của quy trình này là không sợ nhiễm bẩn mẫu cũng như tiết kiệm dung

môi hữu cơ

Shing-Yi Suen và cộng sự [34] thì tiến hành nghiên cứu khả năng hấp phụ trong quá trình phân lập cao bạch quả khi sử dụng màng lọc kỵ nước và màng trao đổi anion Cao bạch quả được hòa tan bằng

ethanol 30% và được tiến hành rửa giải qua cột bang ethanol 80% cho kết quả như ở Bảng 1-9

26/100

Bảng 1-9 Nghiên cứu khả năng hấp phụ của màng lọc kỵ nưởc và màng trao đổi ion

a

27/ 100

Trong năm 2013, cũng bằng công nghệ siêu lọc, nhóm của M Zhu [35] đã tiến hành tinh chế các hợp chất flavonoid trong cao bạch quả Khi tiến hành cho dung dịch cao bạch quả qua màng lọc poly ether sulfone có MWC0 = 10 kDa (PES- 10KD), hàm lượng flavanoid tăng lên từ 24 % lên 68

%

Phuong pháp tách chiết bằng CŨ2 siêu tới hạn (SFE) được biết tới nhiều ưu điểm như độ chọn lọc cao, không cần sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại, Chính vì lẽ đó, nhóm của Shi-Feng Miao [36] đã áp dụng SFE để tiến hành chiết lá bạch quả Đồng thòi tiến hành micro hóa những flavanoid thu được bằng cách kết hợp với SAA- HCM Hiệu suất chiết flavanoid của 1 lần chạy SFE- CO2 đạt được là 0,36 % (khoảng 37,5 % so với tổng lượng flavanoid trong lá bạch quả) và hàm lượng flavanoid trong cao thu được là 2,1 % Kích thước hạt cũng như sự phân bố kích thước hạt nằm trong khoảng (0,2 -ỉ- 3) pm

Còn nhóm của LiJin Zhang [37] thì tiến hành áp dụng dụng phương pháp chiết bằng enzyme

có hỗ trợ của siêu âm (UAEE) với dung môi là PEG để thu được các polysaccharide trong lá bạch quả Hiệu suất chiết là 7,29 % với thời gian khoảng 37,13 phút

Bên cạnh việc tìm cách để phân lập và tinh chế các hợp chất flavanoid trong cao bạch quả Việc phát triển phương pháp phân tích cũng rất quan họng để có thể định tính cũng như định lượng chính xác các thành phần trong cao bạch quả F Deng, S.W Zito [26] tiến hành thủy phân cao bạch quả với HC1 sau đó cho tạo dẫn xuất của flavanoid với BSTFA chứa 1 % trimethylchlorosilane và DMF chứa 0.01 % squalane như là chất nội chuẩn, hỗn hợp sẽ được tiêm vào thiết bị GC - MS để định lượng

Độ tuyến tính của phương pháp là hơn 0,99, RSD trong ngày không lớn hơn 10,4% với cả 3 flavonoid Mức độ thu hồi của Kaempferol, Isorhamnetin, Quercetin lần lượt là 88.7 ± 4.8 %, 63.0 ± 5.3 %, 90.9

± 6.2 %

D E Gray và cộng sự [38] tiến hành so sánh giữa 2 phương pháp của dược điển Anh (EP) và NSF - INA Điều kiện chạy HPLC được mô tả ở Bảng 1-10

28/100

Bảng 1-10 Đối chiếu điều kiện chạy HPLC của hai phương pháp của được điền

Anh (EP) và NSF - 1NA

Bảng 1-11 Hàm lượng flavonoid tổng chiết ra được qua hai phương pháp

Việc sử dụng phô vân tay được áp dụng rộng rãi đôi với việc xác định các hợp

chất cố trong các loại dược thảo Tuy nhiên nó thiếu đi khả năng xác định chính xác lượng chất nội tại của dược chất cỏ trong dược thảo Nhóm của Xiao-Ping Ding [39] dựa vào khả năng kháng oxỉ hốa của các hợp chất flavonoid đã tiến hành sử dụng HPLC- PDA kết hợp với đầu dò

chemiluminescence (CL) để đánh giá trực tiếp mức độ hoạt động của nhóm flavonoid trong lá bạch quả Kết quả khảo sát hàm lượng flavone aglycone tổng của 13 loại lá bạch quả ở 13 môi trường

29/100

Bảng 1-12 Hàm lượng flavone aglycone tổng của 13 loại lả bạch quả ở 13 mỏi

trường sống khác nhau theo Dược điển Trung Quốc

Nhóm của Xin Yao thì tiên hành sử dụng HPLC - PDA - TOF [40] để có thêm thông tin chi

tiết về thành phần hốa học cũng giúp cho thời gian phân tích nhanh hơn

30/ 100

Peak no RT í mini Hfi-mass IWz} TolcraocE

:ppmi (um) Molecular ula form

Assigned denirr>'

1 3.B5 739.2104 1.6 265.355 C U H Ì I O IM Kaero ffcrd 3-D-l2 Õ 6-G , ’bis:3- L-rhãmnũ^1ỉ-p-Ũ ■glucosldeỉ (c)

5 409 6091+44 -3.4 255355 C IT H M A 6 Cỉueimin 3-0-I6O3V-L- rhamnoeyl)-|kl>gluiDosidld

7 4.32 463.CBỐ7 -3J 265360 Quercetin I-O-fFOfllucasyl

9 4.53 5931499 -3.1 265350 Cí J H, ;| O| ị Kaernpfwd 3-D-ị6-ữ-i(y-L- rH.imnoĩỵl?ÍH3-gl ucoside]

10 4.62 623.1597 ■ỉ.? 255355 CaHjAt IxMhamnctin ỉỡ |i5í>i>L rhamnosyl} iWflkjooixId

14 4.88 593.149-8 2.4 265.340 CrcHtoAí teempíetd 3-ũ-i2-ữ-(ị5-D- gliXũiy ÍH-L-íti ãnìiiửỉidel laỉ

Ngoài các loại đầu dò trên, các nhà khoa học khác cũng tiến hành các phương pháp trên đầu

dò ba tứ cực MS/MS [41-43] để xác định cấu trúc cũng như định lượng cảc thành phần chính trong cao bạch quả Kết quả của các đầu dò này cho độ chính xác cao cũng như thời gian phan tích ngắn hơn nhiều so với chỉ dùng các loại đầu dò ƯV

31/100

1.4 Định hướng nghiên cứuq

1.4.1 Đỗi tượng nghiên cứu

- Cân phân tích PA214 Ohaus-US, độ chia nhỏ nhất 0,0001 g

- Cân phân tích Shinko Denshi -Japan, độ chia nhỏ nhất 0,01 g

- Tủ lạnh, tủ sấy chân không, tủ hút khí độc

- Máy khuấy từ có bộ phận gia nhiệt điều khiển được tốc độ khuấy và nhiệt độ

- Bếp gia nhiệt điện trở

- Máy cô quay dưới áp suất giảm

33/100

- NMR Bruker Avance II

- HPLC, Agilent 1200 Series coupled to MS detector, ƯV detector, micrOTOF-Qn Bruker

- Máy phân tích nhiệt vi sai Seetaram DSC 131

- Bể siêu âm 1000W

- Bể điều nhiệt

- Máy vi sóng 800W 1.5 Phuong pháp thực hiện

Ý tưởng đề tài đưa ra được thể hiện qua hai quy trình:

Quá trình 1: Phân lập và tinh chế các flavonoid chủ yếu trong cao chiết từ lá bạch quả Quá trình 2: Xây dựng phương pháp kiểm nghiệm flavonoid và thực hiện đánh giá trên một

số chế phẩm có thành phần bạch quả trên thị trường

Sử dụng phương pháp chiết Soxhlet cổ điển dùng để tách các hợp chất (3) (4) (5) ra khỏi lá bạch quả khô Phương pháp này bao gồm ba giai đoạn:

Giai đoạn 1: Chiết cao thô từ lá bạch quả khô

Lá bạch quả khô được xay thành bột Bột khô được chiết Soxhlet với hỗn hợp dung môi EtOH : H2O ttong 3 giờ Dịch chiết được lọc lấy pha lỏng Dùng n-hexane loại béo khỏi pha lỏng Tiến hành cô quay áp suất thấp hỗn hợp trên thu được cao thô

34/100

Sơ đồ 1-1 Quy trình chiết cao thô

Giai đoạn 2: Phân lập và tinh chế các hợp chất flavonoid (3) (4) (5) có trong cao bạch quả Các

flavonoid tồn tại ttong cao thô ở dạng glycoside, để thu được chúng ở dạng tự do, cần thực hiện quá trình thủy phân

EtOH: H2O

7:3

n-hexane

35/100

Sau thủy phân, tiến hành chiết phân pha, thu pha hữu cơ Cô quay loại dung môi đến khi thu được thể sệt Thực hiện sắc ký cột hấp phụ trên silica gel với hệ dung môi thích hợp nhằm phân lập các phân đoạn có chứa các flavonoid quan tâm

Sơ đồ 1-2 Quy trình phân lập các hợp chất flavonoid

Giai đoan 3: Kiểm ưa, định danh và xác định độ tinh khiết của các hợp chất đã phân lập

phân lập được để định tính

- Xác định độ tinh khiết bằng phương pháp HPLC- MS hoặc phương pháp nhiệt phân

36/100

vi sai DSC cho 3 hợp chất phân lập được

Sau khi hoàn tất các giai đoạn trên, nhận thấy quá trình 1 còn có những hạn chế nhất định có thể cải thiện được như: thời gian chiết Sohxlet khá dài, quá trình trải qua nhiều công đoạn, lượng (5) thu được rất thấp so với (3) và (4); đồng thời cũng là bước đệm cho việc thực hiện quá trình

2- xây dựng phương pháp kiểm nghiệm flavonoid và thực hiện đảnh giả trên một số chế phẩm

có thành phần bạch quả trên thị trường, đề tài đã sang hướng tiến hành khảo sát tìm điều kiện

tốt hơn trong việc phân lập và tinh chế các hợp chất chất (3) (4) (5) trong cao chiết từ lá bạch quả, bằng cách thực hiện khảo sát các điều kiện phân lập khác nhau: chiết Sohxlet one-pot, chiết cao từ lá bạch quả dưới sự hỗ trợ của siêu âm; thủy phân dưới sự hỗ trợ của vi sóng

37/100

Sơ đồ 1-3 Quy trình chiết Soxhlet one- pot

EtOH: H2O 7:3

HC136%

40/100

Định danh dược liệu lá bạch quả

được để định tính

Xác định độ tinh khiết bằng phương pháp HPLC- MS hoặc phương pháp nhiệt vi sai DSC cho 3 hợp chất phân lập được

2.1 Định danh dược liệu lá bạch quả

Lá bạch quả khô được ngâm mềm trong nước, sau đó được tiến hành cắt vi phẫu Tiến hành nhuộm vi phẫu:

Ngâm lát cắt vào dung dịch Javel từ (15 -ỉ- 30) phút (đến khi lát cắt hở nên hắng)

Ngâm lát cắt vào dung dịch acid acetic (1 + 3) % trong 2 phút để tẩy Javel còn sót

Tiếp tục ngâm lát cắt vào dung dịch iod từ (5 + 10) giây, rửa bằng nước cất

Ngâm vào dung dịch son phèn khoảng (15 + 30) phút

Rửa bằng nước cất đến khi dung dịch rửa hết màu

Cố định bản mẫu trên phiến kính, tiến hành quan sát dưới kính hiển vi điện tử và ghi nhận kết quả như sau: