Nội dung bản trích yếu Bệnh Parkinson là bệnh thoái hóa thần kinh tiến triển thường gặp ở những người trên 65 tuổi, với tỷ lệ mắc bệnh ở Việt Nam khoảng 1,6%. Phương pháp điều trị đầu tay là sử dụng các thuốc tiền chuyển hóa của dopamin như levodopa. Tuy nhiên điều trị nội khoa bằng thuốc thường người bệnh chỉ đáp ứng tốt trong 5 – 10 năm đầu do gặp phải hiện tượng kháng thuốc điều trị. Vì vậy, đây là nghiên cứu nhằm tiếp cận hướng điều trị mới đó là sử dụng tế bào gốc có khả năng biệt hóa thành nơron tiết dopamin để thay thế các nơron bị thoái hóa. Nghiên cứu được tiến hành trên đối tượng là 776 phôi chuột cống trắng từ 10,5 đến 14,5 ngày tuổi và 201 phôi – thai người từ 6 đến 8 tuần tuổi với chất liệu nghiên cứu là mẫu tế bào gốc ngoại bì thần kinh của các phôi đó nhằm hướng đến hai mục tiêu chính là (1) Phân lập, tăng sinh, biệt hóa và bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi chuột cống trắng thành tế bào dạng tiết dopamin; (2) Phân lập, tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi người thành tế bào dạng tiết dopamin. Thiết kế nghiên cứu thực hiện qua hai giai đoạn, giai đoạn 1 thực nghiệm trên phôi chuột cống trắng và giai đoạn 2 thực nghiệm trên phôi người. Mô hình nghiên cứu được thiết kế gồm các bước: thu thập phôi, phân lập mẫu mô sàn não giữa, tạo dịch treo tế bào gốc. Sau khi tạo được dịch treo tế bào, một phần được nuôi cấy tăng sinh tạo nơron tiết dopamin. Sử dụng môi trường nuôi cấy tế bào gốc thần kinh (M-NECS): môi trường nuôi cấy cơ bản DMEM/F12 tỷ lệ 1:1 có bổ sung thêm các yếu tố: Fetal Bovine Serum (FBS) 10%; Epithelial Grow Factor (EGF) 20ng/ml và basic Fibroblast Grow Factor – 2 (bFGF-2) (20ng/ml), (invitrogen, Mỹ); Penicillin - Streptomycin (100IU/ml) (Thermo Scientific, Mỹ); Amphotericine B (0,25µg/ml); Progesterone (20nM), Putrescine (62nM), muối Selenit (30nM), (Sigma, Mỹ); Insulin – Transferine – Selenium (25ng/ml) (Gibco, Mỹ). Các tế bào sau nuôi cấy được thu hoạch và định danh bằng các phương pháp mô học như nhuộm Hematoxyline – Eosine, nhuộm Giemsa để đánh giá hình thái tế bào, nhuộm Cajal II để đánh giá sự hiện diện của các xơ thần kinh trong tế bào, nhuộm Hóa mô miễn dịch với marker đặc hiệu cho nơron tiết dopamin là Vimentin và Tyroxin Hydroxylase (TH), đếm mật độ tế bào bắt màu với marker TH để xác định tỷ lệ nơron tiết dopamin trong mẫu tế bào thu hoạch được. Một phần khác sẽ được bảo quản lạnh trong môi trường cơ bản DMEM có bổ sung 10% Dimethyl Sulfoxide (DMSO) sau đó đánh giá tỷ lệ sống của tế bào sau rã đông cũng như khả năng nuôi cấy của tế bào sau bảo quản lạnh. Sau quá trình nghiên cứu, chúng tôi thu được một số kết quả sau: Đối với mục tiêu (1), các kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng phân lập và nuôi cấy mẫu tế bào gốc thần kinh phôi chuột tốt nhất ở tuổi phôi 12,5 đến 13,5 ngày tuổi. Tỷ lệ phân lập thành công 100% ở nhóm tuổi phôi này với số lượng tế bào thu được khoảng 1,34 ± 0,048 x 105 tế bào/ml. Các tế bào sau nuôi cấy có đặc điểm của tế bào của mô thần kinh với nhiều tế bào hình sao với các nhánh bào tương tỏa ra xung quanh liên hệ với các tế bào gần kề. Nhuộm Cajal II thấy hình ảnh các xơ thần kinh trong tế bào bắt màu nâu vàng rõ. Sử dụng marker TH để đánh dấu nơron tiết dopamin, quan sát thấy nhiều tế bào dương tính với TH trong mẫu nuôi cấy. Tỷ lệ nơron dương tính với TH khoảng 5,38 ± 3,56%. Bảo quản lạnh các tế bào gốc thần kinh phôi sau phân lập trong môi trường cho tỷ lệ sống 64,9%. Đối với mục tiêu (2), việc phân lập, tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc thần kinh phôi – thai người để tạo nơron tiết dopamin có thể thực hiện được bằng nguồn phôi được lấy từ kỹ thuật giảm thiểu thai trong điều trị hỗ trợ sinh sản. Tuổi phôi thích hợp cho phân lập và nuôi cấy từ 6,5 đến 7,5 tuần tuổi. Các tế bào sau nuôi cấy cũng là các tế bào của mô thần kinh và dương tính với marker TH – thể hiện sự tồn tại của nơron tiết dopamin trong mẫu thu hoạch được. Đây là một đề tài nghiên cứu rất mới. Tuy có được thành công bước đầu đã nuôi tạo được các nơron tiết dopamin nhưng vẫn còn vài khó khăn đặc biệt trong việc nghiên cứu trên phôi người. Như việc khó khăn trong phân lập các phôi sau giảm thiểu do đặc điểm không toàn vẹn của phôi. Vì vậy cần thêm những nghiên cứu trong tương lai để hoàn thiện quy trình nuôi cấy, tăng tỷ lệ tế bào tiết dopamin sau nuôi cấy cũng như tăng tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh để có thể sẵn sàng nguồn tế bào tiến tới ứng dụng thử nghiệm trên động vật và xa hơn là điều trị trên lâm sàng.
1 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Ngày nay, việc nghiên cứu ứng dụng hiểu biết cấp độ tế bào tế bào hướng mũi nhọn y học Một lĩnh vực mũi nhọn nghiên cứu, tìm hiểu sử dụng tế bào gốc điều trị việc cấy ghép mô, tế bào vào thể trưởng thành nhằm phục hồi phần hay toàn chức mô, tế bào sau thương tổn bệnh lý hay lão hóa, sau sang chấn học hay khuyết tật bẩm sinh Ý tưởng cấy ghép tế bào gốc để điều trị bệnh Parkinson - bệnh lý rối loạn thần kinh thối hóa tiến triển giảm chức nơron tiết dopamin não năm 1980 Trên giới, nhiều nghiên cứu động vật người việc ghép tế bào gốc cải thiện đáng kể triệu chứng bệnh Parkinson Nhiều loại tế bào gốc khác thử nghiệm động vật: tế bào gốc tủy xương, tế bào gốc cảm ứng (iPS cells), tế bào gốc ngoại bì thần kinh bào thai (mesencephalic neuroepithelial stem cells = M-NECs) Trong số loại trên, tế bào gốc ngoại bì thần kinh bào thai người thử nghiệm lâm sàng người mang lại kết tích cực tế bào có tỷ lệ biệt hóa thành neuron tiết dopamin sau ghép cao, mơ ghép hịa hợp tốt với mơ chủ chưa có chứng việc tiết dopamin bất thường từ mảnh ghép mô chủ Ở Việt Nam nay, tỷ lệ mắc bệnh Parkinson khoảng 1,6% người 65 tuổi, có xu hướng ngày tăng Thêm vào đó, điều trị nội khoa cách sử dụng thuốc tiền chất chuyển hóa dopamin Levodopa có tác dụng tốt khoảng 5-10 năm tượng kháng thuốc điều trị Với mong muốn tiếp cận phương pháp điều trị bệnh Parkinson mong muốn nâng cao chất lượng sống cho người bệnh, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tăng sinh biệt hóa tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi – thai thành tế bào dạng tiết dopamin” với mục tiêu: Phân lập, tăng sinh, biệt hóa bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi chuột cống trắng thành tế bào dạng tiết dopamin Bước đầu phân lập, tăng sinh biệt hóa tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi – thai người thành tế bào dạng tiết dopamin Commented [M1]: Nơron 2 Những đóng góp luận án Luận án thành công phân lập, tăng sinh, biệt hóa bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh phơi chuột cống trắng thành tế bào dạng tiết dopamin Bước đầu thành công việc phân lập, tăng sinh biệt hóa tế bào gốc thần kinh phôi người thành tế bào dạng tiết dopamin Đây cơng trình nghiên cứu có số lượng mẫu lớn, công phu phân lập, nuôi cấy biệt hóa tế bào tế bào gốc thần kinh chuột người, làm tiền đề cho nghiên cứu thực nghiệm điều trị bệnh Parkinson tế bào gốc ngoại bì thần kinh động vật tiến hành cho bệnh nhân tình nguyện tương lai Cấu trúc luận án Luận án gồm 115 trang với trang Đặt vấn đề, 33 trang Tổng quan, 17 trang Đối tượng phương pháp nghiên cứu, 30 trang Kết quả, 30 trang Bàn luận, trang Kết luận, trang Khuyến nghị Hướng nghiên cứu Luận án có Bảng số liệu, Biểu đồ, 27 hình ảnh tế bào nghiên cứu; 115 Tài liệu tham khảo, phụ lục, danh sách phôi chuột, danh sách bệnh nhân Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tế bào gốc thần kinh: định nghĩa đặc điểm Tế bào gốc thần kinh tế bào có khả tăng sinh tự đổi mà giữ đặc tính khơng biệt hóa suốt q trình tồn chúng Q trình tự làm thông qua hai cách phân chia đối xứng bất đối xứng Nếu phân chia đối xứng tạo hai tế bào gốc giúp làm tăng quần thể tế bào gốc phân chia bất đối xứng tạo tế bào gốc tế bào khác bắt đầu q trình biệt hóa Như vậy, tế bào gốc thần kinh tế bào chưa biệt hóa có khả tự tái tạo khả biệt hóa thành dịng tế bào cam kết Các tế bào gốc thần kinh có khả biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác như: nơron, tế bào hay tế bào nhánh 1.2 Q trình hình thành biệt hóa nơron tiết dopamin in vivo Các tế bào gốc chịu trách nhiệm biệt hóa thành nơron tiết dopamin cư trú sàn não phơi Trong q trình phát triển phơi, vào giai đoạn phôi vị, máng thần kinh khép, thành ống thần kinh biểu mô gồm hàng tế bào gọi biểu mô thần kinh Trong trình phát triển, thành não dày lên tăng sinh mạnh tế bào biểu mô Các tế bào thành ống ban đầu có dạng biểu mô trụ giả tầng, bào tương tế bào trải khắp chiều dầy thành ống, nhân tế bào phân bố mức độ cao thấp khác Ở lớp sâu thành ống, tế bào phân chia mạnh, tạo thành lớp sinh sản vùng Sau hình thành lớp sinh sản, tế bào di cư vùng ngoại vi thành ống bắt đầu q trình biệt hóa Ở giai đoạn sớm, tế bào đầu dịng tiết dopamin có biểu với marker Shh, Lmx1a, Lmx1b… bào tương tế bào Sau đó, tế bào đầu dịng tiếp tục biệt hóa thành nơron tiết dopamin chưa trưởng thành Các nơron bắt đầu rời khỏi vùng sinh sản dọc theo nhánh tế bào thần kinh xuyên tâm để xâm nhập vào vùng trung gian thành ống Trong suốt trình di cư, nguyên bào thần kinh tiết dopamin tiếp tục biệt hóa để trở thành tế bào tiết dopamin trưởng thành Ở giai đoạn này, tế bào xuất biểu với marker Tyroxin Hydroxylase (TH) Như vậy, tế bào đầu dòng tiết dopamin bắt đầu hình thành sàn não giữa, sau trải qua hàng loạt bước phát triển, biệt hóa di cư đến vị trí định như: liềm đen, vùng đồi, hành khứu, võng mạc… Về mặt thời gian, trình ngày thứ chuột tuần thứ sau thụ tinh người Chính hiểu biết giúp ích nhiều cho việc tìm kiếm dòng tế bào tối ưu phục vụ điều trị bệnh Parkinson 1.3 Tế bào gốc não phôi ứng dụng điều trị Sử dụng mảnh mô sàn não giữa: Tác giả Perlow cs (1979) tiến hành ghép mảnh mô phân lập từ sàn não vào thể vân chuột gây Parkinson 6-Hydroxydopamine (6-OHDA), kết cho thấy có cải thiện triệu chứng lâm sàng số chuột sau ghép Tuy nhiên kỹ thuật bộc lộ nhiều hạn chế như: tỷ lệ chuột sống sau ghép thấp, tỷ lệ cải thiện triệu chứng lô nghiên cứu khơng đồng Những hạn chế liên quan tới việc nuôi dưỡng tế bào mô ghép không tiếp xúc với mạch máu dịch não tủy mô chủ Để khắc phục hạn chế việc sử dụng mảnh mô sàn não giữa, nhiều tác giả sử dụng dịch treo tế bào phân lập từ mảnh mô để tiêm vào thể vân chuột bị Parkinson Kết đạt khả quan tỷ lệ khỏi bệnh chuột sau ghép ổn định lô nghiên cứu Hơn quan sát cấu trúc thể vân sau ghép kỹ thuật hóa mơ miễn dịch, tác giả thấy có tồn tế bào phôi vật chủ Những tế bào sống tạo nơron liên kết với tế bào mô chủ, quan sát nơron di cư đến 0,5mm – 1mm từ vị trí tiêm Những thành cơng chuột thực nghiệm thúc đẩy nhà khoa học tiến hành thử nghiệm bệnh nhân tình nguyện Mẫu dịch treo tế bào gốc tiêm vào não bệnh nhân Parkinson Sau ghép ghi nhận cải thiện triệu chứng rối loạn vận động triệu chứng ngủ bệnh nhân Parkinson Một thử nghiệm lâm sàng có nhóm chứng lớn 34 bệnh nhân tình nguyện ghép dịch treo tế bào gốc ngoại bì thần kinh phơi nhóm dùng giả dược tác giả Olanow cs năm 1992 đưa kết luận có cải thiện triệu chứng bệnh nhân điều trị so với nhóm khơng điều trị, đặc biệt đối tượng bệnh nhân bị Parkinson nhẹ Điều thú vị tác giả nhận thấy việc cải thiện có khác biệt lớn nhóm dùng phơi so với nhóm dùng phơi Do tác giả nhận thấy có mối liên quan số lượng tế bào sử dụng với khả cải thiện triệu chứng Trong nguồn mô phôi thai đồng loại ỏi, vậy, để gia tăng số lượng tế bào cấy ghép, nhà khoa học có ý tưởng ni cấy tăng sinh hỗn hợp tế bào để gia tăng lượng nơron tiết dopamin giúp tối ưu hiệu điều trị bệnh 1.4 Phân lập, nuôi cấy bảo quản lạnh tế bào gốc sàn não phôi 1.4.1 Phân lập Phân lập tế bào gốc thần kinh gồm bước: trích thủ mô, phân ly tế bào làm quần thể tế bào Để trích thủ trước tiên phải có kiến thức đầy đủ vị trí ổ tế bào gốc thần kinh kỹ thuật định vị để có mẫu mơ đáng tin cậy Sau lấy mẫu mô não cần đặc biệt ý khâu bảo quản, nên thực vài tỷ lệ sống tế bào giảm dần theo thời gian Sau trích thủ mảnh mơ vị trí, tiến hành tách tế bào tạo dịch treo Có sử dụng phương pháp tách tế bào enzym tách tế bào học Enzym thường sử dụng để tách rời tế bào trypsin Trong đó, trypsin thường dùng kết hợp với acid ethylendiaminetetra (EDTA), chất gắn với Ca2+ làm tăng tác dụng cắt đứt liên kết tế bào Thông thường, tách tế bào enzym thường chưa đủ để tách hoàn toàn tế bào gốc thần kinh mơ Do đó, nhà khoa học thường phối hợp với việc tách tế bào biện pháp học cách sử dụng pi – pét pasteur hút lên xuống nhiều lần Sau trình tách rời, tế bào enzym học, quần thể tế bào thu làm cách lọc qua màng lọc kích thước lỗ lọc 70µm 100µm Cũng dựa vào tín hiệu huỳnh quang với marker đặc hiệu để lựa chọn tế bào gốc thần kinh 1.4.2 Nuôi cấy Môi trường thường sử dụng để nuôi cấy tế bào gốc thần kinh mơi trường có bổ sung yếu tố tăng trưởng Môi trường thường sử dụng DMEM tạo hỗn hợp muối vô cơ, amino acid vitamin DMEM thường kết hợp với dung dịch Ham’s F12 tỷ lệ 1:1 nhằm tăng mức độ dinh dưỡng muối vô khác Ngồi ra, mơi trường cịn cần bổ sung thêm chất tăng trưởng khác như: yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGF), yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGF), insulin, transferin hay putrescine, huyết thanh, kháng sinh, kháng nấm Những yếu tố thường bổ sung nuôi cấy chúng sử dụng thời gian ngắn nhiệt độ 4℃ Những yếu tố kết hợp với môi trường nuôi cấy giúp cho tế bào gốc thần kinh vừa giữ tính “gốc” tế bào, kéo dài thời gian tăng sinh số lượng tế bào, vừa giúp tăng hiệu biệt hóa thành nơron tiết dopamin Phương pháp ni cấy: có hai phương pháp ni cấy tế bào gốc thần kinh phương pháp ni cấy tạo cụm dịch treo phương pháp ni cấy lớp đơn Trong phổ biến phương pháp nuôi cấy tạo cụm dịch treo tế bào thần kinh Theo tế bào thần kinh nuôi cấy môi trường khơng có chất kết dính chứa đầy đủ yếu tố tăng trưởng Điều cho phép tế bào phát triển tạo thành cụm tế bà Một số nhà nghiên cứu cho cụm tế bào tương tự vi mơi trường kích thích phát triển tế bào thần kinh chúng có tương tác trực tiếp tế bào – tế bào cụm Tuy nhiên phương pháp có số nhược điểm ví dụ cụm lớn, khuếch tán chất dinh dưỡng vào bên khó khăn tập trung mật độ lớn tế bào cụm hạn chế đánh giá tế bào gây trở ngại cho việc nghiên cứu trình biệt hóa tế bào Ni cấy tế bào gốc thần kinh lớp đơn việc sử dụng chất bám dính bề mặt đĩa cấy để kích thích dịng tế bào thần kinh bám dính tăng sinh, lại khơng thuận lợi cho dịng tế bào khác phát triển Phương pháp khắc phục hạn chế việc nuôi cấy tạo cụm việc thẩm thấu chất dinh dưỡng vào tế bào tốt hay việc nghiên cứu tế bào đơn lẻ dễ dàng Tuy nhiên khả tăng sinh biệt hóa thành nơron trưởng thành lại không hiệu nuôi cấy tạo cụm Lý tác giả đưa ưu ổ vi môi trường cụm tế bào tạo ra, chúng có tác dụng tương hỗ q trình tăng sinh biệt hóa tế bào gốc thần kinh Các tế bào gốc thần kinh sau q trình ni cấy thu hoạch sử dụng biện pháp định danh để nhận diện tế bào mô thần kinh nơron tiết dopamin Các biện pháp thường sử dụng đánh giá mặt hình thái marker đặc hiệu TH thường sử dụng để đánh giá xuất nơron tiết dopamin 1.4.3 Bảo quản lạnh Bảo quản lạnh việc lưu giữ tế bào nhiệt độ thấp mà bảo tồn cấu trúc khả sống tế bào Tế bào thần kinh mẫu sau phân lập hay ni cấy có số đặc điểm đặc biệt như: nhiều tế bào giai đoạn biệt hóa khác có tế bào đơn lẻ lẫn cụm tế bào Vì vậy, việc lựa chọn mơi trường phương pháp bảo quản lạnh để tối ưu khả thu hồi tế bào nhiều tác giả nghiên cứu Sử dụng chất bảo vệ lạnh thấm qua màng tế bào Dimethylsulfocide (DMSO) với nồng độ – 10% cho tỷ lệ sống cao sau rã đông 7 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng địa điểm nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành trên: - 776 phôi chuột cống trắng chủng Wistar từ 10,5 đến 14,5 ngày tuổi Trong 186 phơi sử dụng để nghiên cứu hình thái cấu trúc não giữa, 590 phôi sử dụng để phân lập nuôi cấy tế bào - 201 phôi người từ 6,5 đến 8,0 tuần tuổi không mắc bệnh lây truyền như: HIV, Viêm gan B, Giang Mai Các phôi thu thập phương pháp giảm thiểu thai thai phụ đa thai điều trị kỹ thuật Hỗ trợ sinh sản cho phép thai phụ 2.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành Labo nuôi cấy tế bào, Bộ môn Mô – Phooii, trường Đại học Y Hà nội thời gian từ 10/2014 đến 10/2018 2.2 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành thực nghiệm Labo chia làm giai đoạn: 2.2.1 Các bước tiến hành phôi chuột Sơ đồ mô tả bước tiến hành thực nghiệm phơi chuột: Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu ni cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi chuột 2.2.2 Các bước tiến hành phôi người - Phôi người 6,0 – 8,0 tuần tuổi thu thập từ bào thai làm thủ thuật giảm thiểu thai thai phụ đa thai điều trị Hỗ trợ sinh sản - Sau thu thập từ bệnh viện, phôi để ống Falcon có chứa 10ml mơi trường HBSS, bảo quản ngăn mát tủ lạnh (nhiệt độ - 4℃) sau chuyển Labo ni cấy tế bào vịng Những phơi đủ tiêu chuẩn nghiên cứu tiếp tục q trình phân lập, ni cấy định danh tương tự 2.2.3 Chỉ tiêu nghiên cứu * Đối với mục tiêu 1: - Hình thái vi thể, siêu vi, hóa mơ miễn dịch mẫu não phơi chuột theo tuổi phơi - Hình thái vi thể, siêu vi, hóa mơ miễn dịch tế bào phôi chuột sau nuôi cấy - Tỷ lệ nơron tiết dopamin – TH (+) sau nuôi cấy - Tỷ lệ cụm tế bào có nơron tiết dopamin – TH (+) sau nuôi cấy - Tỷ lệ sống tế bào sau bảo quản lạnh nitơ lỏng *Đối với mục tiêu 2: - Hình thái vi thể, siêu vi, hóa mơ miễn dịch mẫu não phơi người - Hình thái vi thể, siêu vi, hóa mơ miễn dịch tế bào phôi người sau nuôi cấy - Tỷ lệ nơron tiết dopamin – TH (+) sau nuôi cấy - Tỷ lệ cụm tế bào có nơron tiết dopamin – TH (+) sau nuôi cấy 2.2.4 Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu a Các kỹ thuật hiển vi để đánh giá hình thái vi thể tế bào: Nhuộm Hematoxyline – Eosine (HE) để nghiên cứu cấu trúc vi thể não phôi chuột, phôi người cách nhuộm màu xanh/đỏ với thuốc nhuộm Hematoxyline Eosine Nhuộm Giemsa để quan sát bề mặt mẫu tế bào nuôi cấy cách sử dụng thuốc nhuộm Giemsa 10% pha với nước cất trước sử dụng Nhuộm Cajal II mục đích để xác định có mặt xơ thần kinh mô não phôi chuột mẫu tế bào nuôi cấy Sử dụng dung dịch AgNO3 1,5% Các tiêu sau nhuộm đọc kính hiển vi quang học sử dụng vật kính với độ phóng đại x10, x20 x40 b Các kỹ thuật hiển vi điện tử Hiển vi điện tử quét (SEM) mục đích để quan sát cấu trúc siêu vi bề mặt tế bào sau nuôi cấy Hiển vi điện tử xuyên (TEM) mục đích quan sát siêu cấu trúc màng tế bào,bào tương, nhân tế bào, bào quan mối liên hệ tế bào Mẫu sau làm tiêu đọc kính hiển vi điện tử quét kính hiển vi điện tử xuyên c Kỹ thuật hóa mơ miễn dịch Nhuộm hóa mơ miễn dịch với marker Vimentin (ab92745- Mỹ) để quan sát diện xơ Vimentin tế bào não phôi tế bào sau nuôi cấy để nhận diện tế bào gốc thần kinh marker Tyrosine Hydrosylase (TH) (ab112 – Mỹ) để quan sát diện enzym Tyrosine Hydroxylase tế bào não phôi, tế bào nuôi cấy để nhận diện tế bào tiết dopamin Các tiêu sau nhuộm quan sát kính hiển vi huỳnh quang d Kỹ thuật đếm tế bào TH (+) Các tế bào sau thu hoạch nhuộm hóa mơ miễn dịch với marker TH Sử dụng kính hiển vi huỳnh quang đếm tế bào bắt màu đỏ vi trường – tế bào TH(+) Di chuyển ngẫu nhiên 10 vi trường độ phóng đại x20 Đếm tổng số lượng tế bào vi trường vừa quan sát Tỷ lệ tế bào TH(+) = Số lượng tế bào TH(+)/Tổng số tế bào đếm 2.2.6 Đạo đức nghiên cứu - Nghiên cứu phần nội dung Đề tài Độc lập cấp Nhà nước Hội đồng Đạo đức trường Đại học Y Hà Nội thông qua theo Công văn số 148/HĐĐĐĐHYHN ngày 06/8/2014 v/v chấp thuận Hội đồng Đạo đức nghiên cứu Y Sinh học Nghiên cứu có đồng ý lãnh đạo sở chấp thuận tự nguyện sản phụ làm thủ thuật giảm thiểu thai, có cam kết đồng ý Các thơng tin bệnh nhân lưu giữ bí mật, phục vụ cho nghiên cứu Danh sách bệnh nhân không công bố tên tuổi đầy đủ để đảm bảo bí mật theo quy định pháp luật Nghiên cứu phục vụ cho sức khỏe bệnh nhân, ngồi khơng có mục đích khác 10 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Phân lập, tăng sinh, biệt hóa bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh não phôi chuột 3.1.1 Phân lập, nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc ngoại bì thần kinh sàn não phơi chuột theo nhóm tuổi phơi Giai đoạn đầu, sử dụng 186 phôi để nghiên cứu cấu trúc hình thái não 148 phơi chuột từ 10,5 đến 14,5 ngày tuổi (E10,5 – E14,5) sử dụng để đánh giá khả phân lập nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh não theo tuổi phơi a Tỷ lệ trích thủ thành cơng não theo tuổi phơi Bảng 3.1 Tỷ lệ trích thủ thành công mẫu mô não theo tuổi phôi Tuổi phôi E10,5 E11,5 E12,5 E13,5 E14,5 Tổng số (n) Số phơi 30 25 30 33 30 148 Số phơi trích thủ thành công Tỷ lệ (%) 19 18 27 30 27 121 63,3 72 90 90,9 90 81,7 Bảng 3.1 cho thấy tỷ lệ trích thủ thành cơng vùng não theo nhóm tuổi phơi E10,5; E11,5; E12,5; E13,5; E14,5 là: 63,3%; 72%; 90%; 90,9% 90% Đối với phơi 10,5 ngày tuổi, tỷ lệ trích thủ thành công vùng não thấp Ở tuổi phơi cao hơn, tỷ lệ trích thủ thành cơng cao cao nhóm tuổi E12,5 – E14,5 b Tổng số tế bào sau phân lập Mẫu mơ não sau trích thủ, tiến hành ủ qua men Dispase Trypsin –EDTA để tạo mẫu dịch treo tế bào Để đánh giá hiệu phân lập tế bào gốc sàn não đếm tổng số tế bào mẫu dịch treo thu Số lượng tế bào trung bình theo tuổi phơi thể biểu đồ 3.1 sau: 11 Biểu đồ 3.1 Tổng số tế bào sau phân lập Tổng số tế bào sau phân lập thấp tuổi phôi 10,5 ngày (khoảng 0,78 ± 0,05 x 105 TB) cao tuổi phôi 14,5 ngày (khoảng 1,4 ± 0,51 x 105 TB) Có khác biệt số lượng tế bào tuổi phôi 11,5 12,5 ngày (khoảng 0,82 ± 0,085 x 105 TB so với 1,34 ± 0,048 x 105 TB) c Tỷ lệ mọc mẫu nuôi cấy theo tuổi phôi Sau phân lập tạo mẫu dịch treo, tế bào gốc ngoại bì thần kinh nuôi cấy môi trường M-NECS để đánh giá hiệu tăng sinh mẫu Kết tăng sinh tế bào thể bảng 3.2: Bảng 3.2 Tỷ lệ mọc mẫu theo tuổi phôi Tuổi phôi E10,5 E11,5 E12,5 E13,5 E14,5 19 18 27 30 27 Số mẫu Số mẫu 16 27 30 27 mọc Tỷ lệ 10,5% 88,9% 100% 100% 100% Bảng 3.2 cho thấy tỷ lệ mọc thấp (10,5%) phôi chuột E10,5 phơi giai đoạn E11,5 có tỷ lệ mọc cao (88,9%) Phơi E12,5 – E14,5 có tỷ lệ mọc mẫu tốt 100% 3.1.2 Nuôi cấy tăng sinh biệt hóa tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi chuột E12,5 – E13,5 tạo nơron tiết dopamin Sau giai đoạn lựa chọn tuổi phôi phù hợp để nuôi cấy nơron tiết dopamin, nhận thấy tuổi phôi phù hợp cho nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc sàn não giai đoạn phôi 12,5 – 13,5 ngày tuổi Chúng tiến hành thực nghiệm 442 mẫu mơ não trích thủ từ phôi chuột cống trắng giai đoạn E12,5 – 13,5 Trong đó, 370 mẫu Commented [M2]: Thống dấu thập phân 12 tiến hành nuôi cấy tăng sinh tạo nơron tiết dopamin, lại 72 mẫu phân lập thành dịch treo tế bào để bảo quản lạnh Kết thu 415 giếng tế bào sau nuôi cấy Trong 138 mẫu làm tiêu nhuộm HE, Giemsa Cajal II; 159 mẫu nhuộm Hóa mơ miễn dịch với marker TH Vimentin; 40 mẫu làm tiêu Hiển vi điện tử quét (SEM) Hiển vi điện tử xuyên (TEM) a Sự phát triển mẫu tế bào nuôi cấy theo thời gian Hai ngày sau nuôi cấy: đa số tế bào bám dính, bắt đầu quan sát thấy hình ảnh giống nơron: tế bào hình sao, có vài nhánh bào tương ngắn tỏa từ thân, tận có đầu phình Một số tế bào có nhánh dài đến tiếp xúc với tế bào gần kề (Hình 3.1A) Những ngày tiếp theo: tế bào tăng sinh nhanh, có nhiều tế bào dạng biểu mô tạo thành đám, rải rác có tế bào hình nằm phân tán, nhiều tế bào có nhánh dài giống nơron đứng phân tán tạo thành cụm dạng nơron, nhánh tế bào dài nối với chằng chịt (Hình 3.1B, C, D) Các tế bào cụm dạng nơron có xu hướng phát triển lan vùng xung quanh đồng thời tỏa nhiều nhánh bào tương liên hệ với cụm gần kề (Hình 3.1C, D): Thời gian trung bình để mẫu ni cấy mọc kín đáy lồng dao động khoảng 7,4 ± 2,3 ngày Thời gian nuôi cấy tốc độ phát triển tế bào đồng mẫu Hình 3.1.Tế bào gốc não nuôi cấy A Sau ngày (KHV soi ngược x100) B Sau ngày (KHV soi ngược x100) C Sau ngày (KHV soi ngược x100) D Sau ngày (KHV soi ngược x100) 13 b Định danh tế bào sau ni cấy Hình thái vi thể Hình 3.2 Hình thái vi thể tế bào gốc não nuôi cấy A TBG não sau nuôi cấy ngày (Giemsa x100) B TBG não sau nuôi cấy ngày (Giemsa x 200) TBG não sau nuôi cấy ngày (Cajal II x 100) Hình thái siêu vi thể Sử dụng kính hiển vi điện tử quét quan sát bề mặt tế bào ni cấy, nhận thấy hình ảnh nơron với thân lớn, hình cầu hình thoi, nhánh bào tương dài tiếp nối với nhánh bào tương tế bào kề bên (Hình 3.3): Hình 3.3 Tế bào gốc não sau nuôi cấy ngày (SEM) Trên lát cắt qua lớp tế bào nuôi cấy, thấy có nhiều hình ảnh nhánh bào tương cắt ngang xung quanh tế bào (Hình 3.4A) 14 Có tận nhánh bào tương phình to thành nón tăng trưởng (Hình 3.4B) có sy-náp hình thành nhánh bào tương (Hình 3.4C): Commented [M3]: ??? Hình 3.4 Tế bào gốc phơi chuột cống trắng sau ni cấy ngày (A) Nón tăng trưởng (TEM x 12600); (B) Các nhánh bào tương cắt ngang (TEM x 12600); (C) Synap (vòng tròn đỏ) (TEM x 24100) Nhuộm hóa mơ miễn dịch với marker Vimentin TH Khi nhuộm hóa mơ miễn dịch với marker vimentin, chúng tơi quan sát hình ảnh hầu hết tế bào dương tính với marker vimentin mẫu ni cấy (Hình 3.5A), nhân tế bào bắt màu xanh Sytox (Hình 3.5B) Các tế bào dương tính với marker TH để đánh dấu nơron tiết dopamin Các nơron tiết dopamin đứng riêng rẽ thành cụm (Hình 3.5C, D) Formatted: Font: (Default) Times New Roman, Font color: Text Hình 3.5 Nhuộm HMMD với marker Vimentin TH tế bào gốc não phôi chuột cống trắng sau nuôi cấy (KHV huỳnh quang x200) (A, B) pha màu khác vị trí; A: Tế bào dương tính với marker Vimentin (đỏ); B: Nhân tế bào dương tính với Sytox (xanh) (C, D) Tế bào dương tính với marker TH c Tỷ lệ tế bào, cụm tế bào dương tính với marker TH sau ni cấy Tiến hành đếm nơron cụm nơron dương tính với marker TH 15 kính hiển vi huỳnh quang chúng tơi nhận thấy tỷ lệ nơron cụm nơron có diện enzym Tyrosine Hydroxylase sau: Bảng 3.3 Tỷ lệ tế bào, cụm tế bào dương tính với marker TH sau ni cấy Tỷ lệ TB có TH (+) Tỷ lệ cụm TB có TH (+) Tuổi phơi X ± SD (%) X ± SD (%) 1,18 ± 0,48 13,27 ± 7,40 E10,5 - E11,5 5,38 ± 3,56 37,09 ± 6,53 E12,5 - E13,5 0,01 0,05 Tỷ lệ sống sau bảo quản lạnh nhóm C thấp có ý nghĩa thống kê với nhóm cịn lại với p 0,05 Tỷ lệ mọc mẫu nhóm C thấp có ý nghĩa thống kê với nhóm cịn lại với p 0,05 7,5 tuần 1,08 ± 0,20 x 105 85,6 ± 5,0 0 tuần 0 11,5tuần Tổng 102 cộng Trong số 102 phôi phân lập mẫu tế bào biểu mô ống thần kinh, trung bình, phơi 6,5 tuần tuổi có số lượng tế bào thu khoảng 0,96 x 105 tế bào; phôi tuần khoảng 1,02 x 105 tế bào; phôi 7,5 tuần tuổi khoảng 1,08 x 105 tế bào Tỷ lệ sống tế bào sau phân lập dao động từ 84,7% - 86,1% Khơng có khác biệt số lượng tế bào thu tỷ lệ sống tế bào phôi phân lập 3.2.3 Ni cấy tăng sinh biệt hóa tế bào gốc biểu mô ống thần kinh phôi người tạo nơron tiết dopamin Số lượng tế bào ni cấy dương tính với marker TH Số lượng nơron dương tính với TH mẫu nuôi cấy đánh giá theo tuổi phôi theo thời gian nuôi cấy Kết thể bảng 3.7: 18 Bảng 3.7 Sự phân bố tế bào TH (+) giếng nuôi cấy theo tuổi phôi Sau ngày Sau ngày nuôi cấy nuôi cấy Tuổi Số Số tế bào Số tế bào phôi mẫu Số mẫu TH(+) TH(+) (n) 18 6,5 tuần 18 15,9 ± 4,8 40,7 ± 17,9 65 18,4 ± 5,7 65 tuần 44,7 ±15,9 19 7,5 tuần 19 17,4 ± 5,6 38,2 ± 15,5 P=0,243 > P=0,266 > Tổng 102 102 0,05 0,05 cộng Sau 10 ngày nuôi cấy Số mẫu Số tế bào TH(+) 18 65 19 107,6 ± 10,04 114,7 ± 16,4 111,8 ± 14,4 102 P=0,096 > 0,05 Theo thời gian nuôi cấy: số lượng tế bào dương tính với TH tăng từ ngày, ngày lớn 10 ngày sau nuôi cấy Theo tuổi phơi: số lượng tế bào dương tính với TH khơng có khác biệt mẫu nuôi cấy tuổi phôi khác từ 6,5 – 7,5 tuần Sự gia tăng số lượng tế bào dương tính với marker TH q trình ni cấy thể rõ biểu đồ đây: Commented [M7]: Không cần viết kiểu Commented [M8]: -Cần so sánh tăng sinh thời điểm theo dõi (5, 7, 10 ngày…) có khác biệt khơng -Nhóm thuổi phôi tăng sinh tốt Số lượng tế bào TH (+) 160 120 80 40 Ngày Ngày Ngày 10 Biểu đồ 3.3 Sự gia tăng số lượng tế bào TH(+) theo thời gian Các tế bào dương tính với marker TH có xu hướng tăng dần sau 5; 10 ngày nuôi cấy.Số lượng tế bào TH (+) ngày tăng lên từ trung bình khoảng 17,8 ± 5,6 tế bào ngày lên 42,8 ± 16,3 tế bào dương tính TH ngày Và vào khoảng ngày 10 sau nuôi cấy với trung bình 112,9 ± 15,3 tế bào TH(+) Commented [M9]: Phân tích tăng sinh biệt hố Đặc điểm, ý nghĩa… 19 Chương BÀN LUẬN 4.1 Phân lập, tăng sinh, biệt hóa bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh phơi chuột 4.1.1 Phân lập, ni cấy tăng sinh tế bào gốc ngoại bì thần kinh não theo nhóm tuổi phơi Thời gian bắt đầu xuất tế bào gốc tiết dopamin não phơi chuột khoảng 10,5 ngày Vì vậy, để sử dụng nguồn tế bào gốc nuôi tạo nơron tiết dopamin tuổi phôi cho hiệu cao câu hỏi Nghiên cứu cho thấy (1) vấn đề trích thủ, giai đoạn phơi nhỏ E10,5 tỷ lệ phẫu tích thu hồi mẫu não thấp (72%) E12,5 – 14,5 tỷ lệ lên tới 90% (bảng 3.1); (2) tổng số tế bào sau phân lập: nhóm tuổi phơi E10,5 E11,5, số lượng tế bào thu thấp có ý nghĩa so với nhóm tuổi phơi E12,5; (3) khả ni cấy, 10,5% mẫu tế bào phôi giai đoạn E10,5 có khả tăng sinh mơi trường nuôi cấy tỷ lệ 100% tuổi phơi E12,5 Có thể thấy tuổi nhỏ, thành ống thần kinh mỏng, việc phẫu tích lấy tế bào gốc khó khăn nhóm tuổi phơi lớn, tế bào thu hiệu ni cấy tăng sinh Do lựa chọn tuổi phôi E12,5 – E13,5 để nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh 4.1.2 Ni cấy tăng sinh biệt hóa tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi chuột E12,5 – E13,5 tạo nơron tiết dopamin a Sự phát triển mẫu nuôi cấy theo thời gian Thời gian trung bình để tế bào mọc kín đáy lồng ni cấy nghiên cứu 7,4 ± 2,3 ngày Mốc thời gian trung bình tương đồng với nhiều nghiên cứu Theo tác giả Shimoda cs (1992), tế bào gốc sàn não phát triển tốt giai đoạn – 10 ngày, sau 14 ngày, bắt đầu quan sát thấy tượng thối hóa tế bào ni cấy b Định danh tế bào sau nuôi cấy Nhuộm Cajal II để phát tế bào mô thần kinh: quan sát nhiều loại tế bào đĩa cấy đa phần nơron đa cực với 20 nhiều nhánh bào tương dài tế bào hình Dưới kính hiển vi điện tử quét, quan sát thấy hình ảnh nơron cực với thân tế bào hình ovan nằm hình ảnh nơron đa cực với thân tế bào lớn nhiều nhánh bào tương xung quanh Bên cạnh đó, có tế bào giống với nguyên bào thần kinh tế bào biệt hóa cao với hình ảnh “sy-náp” xuất tế bào nuôi cấy Đặc điểm nhóm tác giả Robert F cs (2012) mơ tả nuôi cấy tế bào gốc thần kinh phôi chuột Các tác giả bắt đầu quan sát số lượng synap sau ngày ni cấy tăng nhiều sau 14 – 21 ngày 4.1.3 Bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh phơi Trong nghiên cứu sử dụng môi trường bảo quản có chứa 10% DMSO – chất bảo vệ lạnh thấm qua màng tế bào Môi trường nhiều nghiên cứu chứng minh có hiệu tốt tế bào gốc thần kinh như: tỷ lệ sống tế bào cao sau rã đơng, quy trình thao tác đơn giản, khơng ảnh hưởng tới tính “gốc” tế bào Qua nghiên cứu quan sát thấy mẫu bảo quản lạnh tốt giai đoạn sau phân lập giai đoạn nuôi cấy sơ cấp (P0), cịn giai đoạn ni cấy thứ cấp (P1) cho tỷ lệ sống thấp nhiều Như vậy, liệu khả trữ lạnh tế bào thần kinh trưởng thành so với tế bào chưa trưởng thành hay khơng? Nhóm tác giả Rodiguez cs (2017) cho nhận định tương tự tỷ lệ sống sau rã đơng nhóm chưa ni cấy khoảng 60 – 70% nhóm ni cấy tạo nơron trưởng thành (29- 34%) Các nhà khoa học đồng thuận tế bào biệt hóa có sức chịu đựng q trình hạ nhiệt độ so với tế bào chưa biệt hóa, màng tế bào dễ bị tổn thương dẫn đến tượng ly giải tế bào trình rã đông Các tế bào sau rã đông tiến hành nuôi cấy tăng sinh, kết tạo mẫu tế bào thần kinh với nhiều tế bào sao, tế bào nhánh nơron Điều cho thấy việc bảo quản lạnh không làm ảnh hưởng tới khả tăng sinh biệt hóa tế bào 21 4.2 Phân lập, tăng sinh biệt hóa tế bào gốc ngoại bì thần kinh phơi người 4.2.1 Đặc điểm phôi nghiên cứu Sự phân bố tuổi phôi nghiên cứu không đồng đều: 79,1% số phôi giai đoạn 6,5 – 7,5 tuần Sở dĩ có tượng là thời điểm lý tưởng để thực kỹ thuật giảm thiểu phôi – phôi không bé không lớn – giúp thao tác dễ dàng không ảnh hưởng tới phơi cịn lại Hơn nữa, xét thời điểm lại giai đoạn phù hợp để lấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh để ni cấy biệt hóa tạo nơron tiết dopamin Tác giả Freeman cs (1991) nghiên cứu trình sinh sản di cư nơron tiết dopamin phôi người từ 6,0 – 13,2 tuần tuổi nhận thấy bắt đầu xuất tế bào đầu đòng tiết dopamin vùng bụng não từ 5,5 tuần tuổi; khoảng tuần tuổi tế bào bắt đầu di cư khỏi não giữa; tuần tuổi quan sát hình thành mạng lưới nơron nơron tiết dopamin; tuần tuổi bắt đầu thấy nơron tiết dopamin di cư tới thể vân đồng thời giảm biểu nơron TH (+) não Việc sử dụng phôi giảm thiểu để phân lập tế bào gốc thần kinh có nhiều ưu điểm như: biết xác tuổi phơi, phơi lấy điều kiện vô khuẩn, mẫu mô tương đối tinh khiết, cuối cùng, sản phẩm sinh học bỏ 4.2.2 Tổng số tế bào phân lập tỷ lệ sống Tổng số tế bào trung bình phân lập phôi dao động từ 0,96 x 105 đến 1,08 x 105 tế bào Trong số đó, tỷ lệ sống sau phân lập mẫu đạt 80% Giữa cá nhóm tuổi phơi 6,5 tuần, tuần 7,5 tuần nhóm tuổi phơi 7,5 tuần có số lượng tế bào lớn nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê 4.2.3 Ni cấy tăng sinh biệt hóa tế bào gốc biểu mô ống thần kinh phôi tạo nơron tiết dopamin Sau 2-3 ngày ni cấy, quan sát kính hiển vi soi thấy tế bào bắt đầu bám đáy lồng ni cấy, tế bào có xu hướng biệt hóa thành nơron thấy nhiều nhánh bào tương tỏa xung quanh Các tế bào có xu hướng bám đáy tốt mẫu phôi 7,5 tuần, số 22 lượng tế bào phân lập ban đầu cao so với phôi 6,5 tuần tuổi Thời gian tế bào phủ kín đáy lồng nuôi cấy khoảng – 10 ngày So với ni cấy phơi chuột,tế bào gốc phơi người có tốc độ tăng sinh chậm tỷ lệ tế bào nuôi cấy ban đầu tương đương 4.3 Hiệu nuôi cấy tăng sinh biệt hóa tế bào gốc ngoại bì thần kinh tạo nơron tiết dopamin Trong nghiên cứu này, sử dụng marker TH để đánh dấu nơron tiết dopamin mẫu tế bào sau nuôi cấy Trên mẫu nuôi cấy phôi chuột phôi người quan sát có mặt tế bào TH(+), tế bào có xu hướng tăng dần theo thời gian Tỷ lệ tế bào TH(+) mẫu phôi chuột 5,38 ± 3,56% Tỷ lệ khác nhiều nghiên cứu, báo cao dao động từ – 18% Sở dĩ có khác có không đồng môi trường nuôi cấy, phương pháp nuôi cấy tuổi phôi sử dụng để nuôi cấy Trong nghiên cứu tác giả McKay cs (1998), việc bổ sung 10% FBS bFGF vào môi trường nuôi cấy cho tỷ lệ thu hồi nơron tiết dopamin cao so với nhóm khơng bổ sung (14,1% với 2,9%) Tác giả Stull cs (2002) lại đưa ý tưởng nghiên cứu việc sử dụng chất chống oxy hóa mơi trường ni cấy như: vitamine E, Selenite, melatonine… nhằm mục đích bảo vệ nơron chống lại stress oxy hóa Kết khơng ngồi mong đợi nhóm tác giả thấy nhóm có bổ sung chất mơi trường ni cấy khả ni cấy kéo dài ngày so với nhóm khơng bổ sung số lượng nơron tiết dopamin cao gấp lần nhóm bổ sung chất chống oxy hóa 23 KẾT LUẬN Từ kết thu nghiên cứu phân lập, tăng sinh biệt hóa tế bào gốc thần kinh phôi – thai thành tế bào dạng tiết dopamin, rút số kết luận sau: Phân lập, tăng sinh, biệt hóa bảo quản lạnh thành cơng tế bào gốc ngoại bì thần kinh phơi chuột - Phân lập, ni cấy tăng sinh biệt hóa tốt tuổi phôi E12,5 –E13,5 Tỷ lệ phân lập mẫu mô sàn não thành công 100% với số lượng tế bào sau phân lập khoảng 1,34 ± 0,048 x 105 tế bào - Các tế bào sau nuôi cấy tế bào mô thần kinh, nhiều tế bào có nhánh bào tương tỏa xung quanh liên hệ với tế bào gần kề Sử dụng marker TH để đánh dấu nơron tiết dopamin quan sát thấy nhiều tế bào dương tính với TH mẫu sau ni cấy Tỷ lệ biệt hóa tạo nơron TH (+) dao động 5,38 ± 3,56% mẫu tế bào sau nuôi cấy - Bảo quản lạnh tế bào gốc thần kinh phôi môi trường DMEM 10% DMSO cho tỷ lệ sống trung bình 64,9% Các tế bào giai đoạn sau phân lập sau nuôi cấy sơ cấp cho tỷ lệ sống sau bảo quản lạnh cao so với việc bảo quản lạnh giai đoạn nuôi cấy thứ cấp Phân lập, tăng sinh biệt hóa tế bào gốc thần kinh phơi người: - Có thể sử dụng ống thần kinh phôi phôi người lấy từ kỹ thuật giảm thiểu thai điều trị hỗ trợ sinh sản để nuôi cấy tạo nơron tiết dopamin - Số tế bào thu sau phân lập từ phôi tuần 6,5 0,96 ± 0,14 x 105, phôi tuần thứ 1,02 ± 0,17 x 105 , phôi tuần thứ 7,5 1,08 ± 0,2 x 105 với tỷ lệ sống tương ứng 86,1 ± 3,7%; 84,7 ± 4% 85,6 ± 5% Khơng có khác biệt số lượng tế bào tỷ lệ tế bào sống phân lập theo tuổi phôi từ 6,5 đến 7,5 tuần với p = 0,404 - Các tế bào sau nuôi cấy tế bào mô thần kinh, có nhánh bào tương tỏa xung quanh liên hệ với tế bào gần kề - Số lượng nơron TH(+) sau ngày 10 ngày nuôi cấy tăng từ 15,9 ± 4,8 tế bào lên 107,6 ± 10,04 tế bào tuổi phôi 6,5 tuần; từ 18,4 ± 5,7 tế bào lên 114,7 ± 16,4 tế bào tuổi phôi tuần từ 17,4 ± 5,6 tế bào lên 111,8 ± 14,4 tế bào tuổi phôi 7,5 tuần Commented [M10]: Bám sát mục tiêu Commented [M11]: Phân lập sao, tăng sinh nào, kết biệt hoá? Commented [M12]: Nên bổ sung MT 24 KHUYẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP Về khía cạnh nghiên cứu phơi người, chúng tơi nhận thấy cịn vài khó khăn khâu thu thập phôi phân lập tế bào gốc ngoại bì thần kinh phơi đặc điểm khơng tồn vẹn phơi sau giảm thiểu Chính vậy, cần nhiều nghiên cứu phôi người để hồn thiện quy trình ni cấy tăng tỷ lệ tạo nơron tiết dopamin Mục tiêu nghiên cứu nuôi cấy đề tạo nơron tiết dopamin phục vụ điều trị bệnh Parkinson Chính cần thêm nghiên cứu sâu thử nghiệm điều trị động vật người để đánh giá khả tồn tế bào sau nuôi cấy não vật chủ Commented [M13]: Khuyễn nghị rút từ NC này? ... luận án Luận án gồm 115 trang với trang Đặt vấn đề, 33 trang Tổng quan, 17 trang Đối tượng phương pháp nghiên cứu, 30 trang Kết quả, 30 trang Bàn luận, trang Kết luận, trang Khuyến nghị Hướng nghiên... triển lan vùng xung quanh đồng thời tỏa nhiều nhánh bào tương liên hệ với cụm gần kề (Hình 3.1C, D): Thời gian trung bình để mẫu ni cấy mọc kín đáy lồng dao động khoảng 7,4 ± 2,3 ngày Thời gian nuôi... KQ nuôi cấy tăng sinh: thời gian, đặc điểm, môi trường… - KQ nuôi cấy biệt hố: thời gian, đặc điểm, qui trình, mơi trường - Định danh tính gốc sau tăng sinh - Định danh TB biệt hố; mức độ biệt