Mục đích của luận án nhằm khảo sát sự lưu hành của xoắn khuẩn Leptospira trên chó và chuột. Nghiên cứu những biến đổi bệnh lý Leptospirosis trên chó. Nghiên cứu hiệu quả điều trị bệnh Leptospirosis trên chó.
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI
Trang 2CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS HỒ THỊ VIỆT THU
Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại:………., Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc … giờ … ngày …… tháng … năm ………
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
1 Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ
2 Thư viện Quốc gia Việt Nam
Trang 3Chương 1 GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh xoắn khuẩn là bệnh truyền nhiễm chung cho nhiều loài gia súc
và người gây ra bởi một số loài xoắn khuẩn gây bệnh (pathogenic
Leptospira species) Bệnh xảy ra phổ biến khắp thế giới, nhất là những
vùng nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, thuận lợi cho sự tồn tại của xoắn khuẩn
ở môi trường bên ngoài (Evangelista and Coburn, 2010) Xoắn khuẩn gây bệnh tồn tại trong ống thận và bài thải qua nước tiểu làm vấy nhiễm môi trường (Adler and Moctezuma, 2010) và trong tự nhiên chuột cống là nguồn tàng trữ xoắn khuẩn và là nguồn truyền lây bệnh cho chó, con người
và các loài động vật khác (Syke et al., 2011)
Ở Việt Nam trong thời gian qua có nhiều nghiên cứu về tình hình
nhiễm Leptospira trên các loài động vật và kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm
Leptospira khá biến động, phụ thuộc vào động vật khảo sát, thời gian và
địa điểm khảo sát (Vũ Đình Hưng, 1995; Nguyễn Thị Ngân, 2000; Lê Huỳnh Thanh Phương, 200; Hoàng Mạnh Lâm, 2002 và Hoàng Kim Loan,
2013) Tuy nhiên nghiên cứu về bệnh này trên chó rất ít, đặc biệt là khu vực
Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) chưa có nghiên cứu nào về
Leptospira và bệnh Leptospirosis trên chó Do đó đề tài nghiên cứu “Khảo
sát xoắn khuẩn Leptospira và Leptospirosis trên chó ở một số tỉnh Đồng
Bằng Sông Cửu Long” được thực hiện
1.2 Mục tiêu của đề tài
- Khảo sát sự lưu hành của xoắn khuẩn Leptospira trên chó và chuột
- Nghiên cứu những biến đổi bệnh lý Leptospirosis trên chó
- Nghiên cứu hiệu quả điều trị bệnh Leptospirosis trên chó
1.3 Những đóng góp mới của luận án
Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện 2 loài Leptospira
interrogans và Leptospira fainei hiện diện trên chó chưa tiêm phòng bệnh
Leptospirosis ở một số tỉnh ĐBSCL
1.4 Ý nghĩa khoa học của luận án
Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về tình hình dịch tễ bệnh
Leptospirosis trên chó, là cơ sở khoa học cho việc xây dựng qui trình phòng
và trị bệnh trên chó, hạn chế bệnh trên người và các loài động vật khác
Trang 4Chương III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Nội dung 1: Xác định tình hình nhiễm xoắn khuẩn Leptospira trên
chó và chuột
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Khảo sát sự lưu hành Leptospia được thực hiện trên chó khỏe và chó bệnh, 4 tháng tuổi trở lên chưa tiêm phòng Leptospirosis, từ các hộ chăn
nuôi ở 4 tỉnh (Cần Thơ, Vĩnh Long, An Giang và Cà Mau) và 3 phòng khám thú y (bao gồm chó khỏe và chó bệnh) trên địa bàn thành phố Cần
Thơ Khảo sát sự lưu hành Leptospira trên chuột từ những chuột bẫy được
ở các hộ nuôi chó được lấy mẫu khảo sát
3.1.2 Phương pháp thực hiện
a Phương pháp lấy mẫu
Mẫu huyết thanh chó: điều tra huyết thanh học cắt ngang được thực hiện
trên 1.433 mẫu huyết thanh (HT) của chó khỏe và chó bệnh chưa tiêm
phòng bệnh Leptospirosis theo giống, lứa tuổi, giới tính và phương thức
nuôi ở 4 tỉnh thuộc ĐBSCL
Cỡ mẫu: cỡ mẫu ước lượng cần phải lấy dựa theo công thức dịch tễ của
Fosgate (2009) cho mỗi tỉnh khảo sát
Bảng 3.1 Số lượng (SL) mẫu HT chó
Như vậy cỡ mẫu cần phải lấy ở mỗi tỉnh là
245 mẫu HT chó trở lên và được thể hiện
qua Bảng 3.1
Mẫu huyết thanh chuột: điều tra huyết
thanh học cắt ngang và phân tích các mẫu huyết thanh chuột tại 4 tỉnh của ĐBSCL
Cỡ mẫu: cỡ mẫu ước lượng cần phải lấy dựa theo công thức:
Địa điểm SL (con)
Trang 5Bảng 3.2 Phân bố mẫu huyết thanh chuột
Như vậy cỡ mẫu cần phải lấy ở mỗi tỉnh là
101 mẫu huyết thanh chuột trở lên và được
thể hiện qua Bảng 3.2
Tổng số 647 chuột, trong đó chuột cống (Rattus norvegicus) là 285 con, chuột xạ (Suncus murinus) 152 con và chuột nhắt (Mus musculus) 210 con
b Phương pháp xét nghiệm
Phản ứng MAT (Microscopic Agglutination Test) được sử dụng để
phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng Leptospira trên chó và chuột với 18
nhóm huyết thanh do Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh cung cấp (theo qui trình của WHO, 2003)
Phản ứng được kết luận dương tính khi hiệu giá ngưng kết ≥ 1: 200 đối với mẫu huyết thanh chó và ≥ 1: 20 mẫu huyết thanh chuột
c Chỉ tiêu khảo sát
- Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó và chuột theo các địa điểm khảo
sát
- Tỷ lệ nhiễm các serogroup Leptospira trên chó và chuột
- Cường độ nhiễm các serogroup Leptospira trên chó và chuột
- Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó theo theo giống, độ tuổi, giới tính
và phương thức nuôi chó
- Hệ số tương quan (R2) giữa tỷ lệ dương tính các serogroup
Leptospira trên chuột và chó, phương trình hồi qui tuyến tính y=a+bx
3.2 Nội dung 2: Phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu
Việc phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu được thực hiện
trên cùng 63 chó đã khảo sát các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu
từ 111 chó có MAT ≥ 1: 400
3.3.1 Phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu bằng kỹ thuật PCR
Phương pháp thực hiện: nước tiểu được lấy giữa dòng bằng ống thông
qua niệu đạo hoặc thu trực tiếp lúc thú đi tiểu với lượng nước tiểu cần lấy 6-20 ml, chia làm 3 phần để phân tích
- Phần 1: lấy 6 ml nước tiểu chưa ly tâm để phân tích các chỉ tiêu
sinh lý nước tiểu
Trang 6- Phần 2: lấy 3 ml nước tiểu sau ly tâm để ly trích DNA
- Phần 3: lấy 3 ml nước tiểu sau khi ly tâm để nuôi cấy trên môi trường Ellinghausen-McCullough-Johnson (EMJH)
Bảng 3.5 Quy trình nhiệt trong phản ứng PCR
3.3.2 Phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ mẫu nuôi cấy
Phương pháp nuôi cấy xoắn khuẩn
- Leptospira được nuôi cấy theo qui trình của WHO (2003) trên môi
trường EMJH, được quan sát dưới KHV nền đen và được định danh đến mức loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự
- Kỹ thuật PCR được thực hiện như mục 3.3.1
Trang 7Giải trình tự đoạn gene 16S rRNA của xoắn khuẩn Leptospira
- Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và được giải trình tự nucleotide tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc)
- Mẫu được giải trình tự gene 16S rRNA tự động trên máy ABI 3130 Sequencer, sử dụng cặp mồi 27F và 1492R
- Nếu mức độ đồng nhất của trình tự nucleotide trong đoạn gene 16S rRNA đạt ≥ 95% thì có thể xác định tới chi (genus) và ≥ 99% thì có thể xác
định tới loài (species) (dựa theo mô tả mức độ tương đồng của La Scola et
al., 2006)
- Cây phát sinh loài được xây dựng dựa trên các trình tự nucleotide
bằng cách sử dụng phần mềm MEGA 7.0 (Kumar et al., 2016) Tra cứu kết
quả trên BLAST SEARCH và so sánh các vi khuẩn sẵn có từ GenBank, cơ
sở dữ liệu trên NCBI để xác định các loài phân lập được và hai loài xoắn
khuẩn Leptospira tham chiếu được dùng để so sánh trong phân tích phát
sinh loài:
>Icterohaemorrhagiae NR_116542.1 Leptospira interrogans serovar
icterohaemorrhagiae strain RGA 16S ribosomal RNA gene, partial
sequence
>Hurstbridge NR_043049.1 Leptospira fainei serovar hurstbridge strain
BUT 6 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
3.3 Nội dung 3: Khảo sát những biến đổi bệnh lý bệnh Leptospirosis
trên chó
- Những biến đổi bệnh lý ở chó bệnh được khảo sát dựa trên chỉ số
sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu trên 13 chó dương tính với Leptospira
bằng PCR và có MAT≥ 1: 400
a Xét nghiệm máu
Các chỉ tiêu sinh lý máu được khảo sát bằng máy huyết học (Cell Dyn 3200, Mỹ) bao gồm: bạch cầu, neutrophile%, lymphocytes%, hồng cầu, hemoglobin, hematocrit, tiểu cầu và các chỉ tiêu sinh hóa máu được khảo sát bằng máy phân tích sinh hóa máu (AU604, Nhật): ure, creatinin, AST, ALT và bilirubin và so sánh với tiêu chuẩn của The Merck (2010)
b Xét nghiệm nước tiểu
- Các chỉ tiêu sinh lý nước tiểu được khảo sát bằng máy phân tích
nước tiểu (U120, Mỹ) bao gồm: hồng cầu, bạch cầu, protein và bilirubin và
so sánh với tiêu chuẩn của Merck (2010) và Khorami et al (2010)
Trang 8c Chỉ tiêu khảo sát
- Sự thay đổi các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu trên chó
bệnh Leptospirosis
- Những dấu hiệu lâm sàng trên chó nghi bệnh Leptospirosis: sốt, bỏ
ăn, nôn mửa, xuất huyết da,
3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu biện pháp điều trị bệnh Leptospirosis trên
chó
Đối tượng nghiên cứu: chó khỏe và chó bệnh được mang đến khám và
điều trị ở 3 phòng khám thú y tại thành phố Cần Thơ
- Bố trí phác đồ điều trị có sự hợp tác tham gia nghiên cứu với chủ nuôi
- Sáu mươi ba chó trong nội dung 2 có hiệu giá kháng thể kháng
Leptospira ≥ 1: 400, có sự hiện diện của xoắn khuẩn Leptospira trong nước
tiểu khi soi bằng KHV nền đen (được phân bố ngẫu nhiên gồm 32 chó không biểu hiện triệu chứng lâm sàng (TCLS) và 31 chó có một số biểu
hiện TCLS nghi nhiễm bệnh Leptospirosis: ói, ăn ít, buồn, lười vận động,
suy thận, suy gan, báng bụng, xuất huyết da và vàng da)
Doxycycline
21 5 mg/kgP,
ngày 2 lần
Uống 7–14 ngày Chỉ tiêu theo dõi để đánh giá hiệu quả điều trị dựa theo Goldstein,
(2010); Sykes et al (2011); Francey and Schweighauser, (2012) và Schuller et al (2015)
3.5 Phân tích và xử lý số liệu
- Xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2013
- Các chỉ tiêu sinh lý máu, sinh hóa máu, sinh lý, sinh hóa nước tiểu được trình bày dưới dạng ± SE
- Khảo sát các yếu tố liên quan đến tỷ lệ nhiễm Leptospira bao gồm
Trang 9nhóm giống, nhóm tuổi, giới tính và phương thức nuôi bằng phép trắc nghiệm χ2 trong phần mềm Minitab 16.0
- Phương pháp hồi qui (regression) dùng phân tích mối tương quan
về tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột và chó với phương trình có dạng:
y=a+ bx, trong đó a và b là hằng số, y và x là tỷ lệ dương tính trên chó và chuột
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả khảo sát tình hình nhiễm Leptospira trên chó và chuột 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm xoắn khuẩn Leptospira trên chó ở một số tỉnh
ĐBSCL
Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó
Tỉnh Số mẫu HT kiểm tra Số mẫu HT
dương tính
Tỷ lệ dương tính (%)
Tổng số 1.433 mẫu huyết thanh (HT) chó có 331 mẫu dương tính với
Leptospira chiếm tỷ lệ là 23,10% Trong đó, tỷ lệ nhiễm Leptospira trên
chó cao nhất ở tỉnh Vĩnh Long (26,95%), kế đến là Cần Thơ (24,46%), An Giang (20,15%) và Cà Mau (18,94%) So sánh nghiên cứu của Vũ Đình
Hưng (1995), khảo sát tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó ở các tỉnh miền
Nam: Long An, Cần Thơ, Đồng Nai và các vùng phụ cận thành phố Hồ Chí Minh là 44,44% Lê Huỳnh Thanh Phương (2001) khảo sát tại các tỉnh phía
Bắc Việt Nam với tỷ lệ nhiễm Leptospira trung bình trên chó 25,27%; ở Đắk Lắk tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó 19,15% (Hoàng Mạnh Lâm, 2002)
và kết quả nghiên cứu của Lý Thị Liên Khai (2012) tại Công ty cổ phần
thủy sản Sông Hậu Cần Thơ tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó 40,47% Điều này cho thấy những kết quả nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm Leptospira trên
chó giữa các quốc gia có khác nhau có thể do khác nhau về khí hậu, thời tiết, điều kiện địa lý của mỗi quốc gia nên tỷ lệ nhiễm khác nhau và do tính thích nghi của mỗi chó khác nhau cho nên tình hình dịch tễ ở mỗi
Trang 10địa phương khảo sát sẽ khác nhau (Levett, 2001; Ellis, 2010)
Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm các serogroup Leptospira trên chó
Qua Bảng 4.2 chứng minh có sự lưu hành 18/18 serogroup
Leptospira trên chó ở các tỉnh ĐBSCL Các serogroup chiếm tỷ lệ cao L icterohaemorrhagiae (35,05%), L canicola (18,43%), L hurstbridge
(12,69%), L bataviae (12,08%) và L gryppotyphosa (12,08%) So với
nghiên cứu của Vũ Đạt và Lê Huỳnh Thanh Phương (1999) đã chứng minh
được trên chó ở vùng phụ cận Hà Nội cũng có nhiễm các serogroup L
bataviae, L canicola, L gryppotyphosa và L icterohaemorrhagiae Như
Trang 11vậy tùy vào tình hình dịch tễ của mỗi địa phương có sự khác nhau về các
serogroup Leptospira đang lưu hành
Bảng 4.3 Cường độ nhiễm các serogroup Leptospira trên chó
Trang 12Cường độ nhiễm chủ yếu tập trung ở mức hiệu giá ngưng kết kháng
nguyên kháng thể thấp từ 1: 200 đến 1: 800, chỉ có hai serogroup L
canicola và L icterohaemorrhagiae ở mức cao từ 1: 1600 đến 1: 3200 So
với kết quả nghiên cứu của Vũ Đình Hưng (1995), cường độ nhiễm chủ yếu tập trung ở hiệu giá ngưng kết 1: 800 và nghiên cứu của Lê Huỳnh Thanh Phương (2001), chủ yếu tập trung ở hiệu giá ngưng kết từ 1: 800 đến 1:
1600 Nếu hiệu giá kháng thể kháng Leptospira càng cao chứng tỏ mức độ
nhiễm càng cao vì hiệu giá kháng thể phản ánh hàm lượng kháng thể có trong máu chó Tùy vào mỗi vùng, mỗi khu vực, mỗi quốc gia có thể nhiễm
các serogroup Leptospira với cường độ khác nhau và còn tùy thuộc vào
thời điểm lấy mẫu, tình trạng sức khỏe của con vật lúc lấy huyết thanh và điều kiện nuôi dưỡng của chó
Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo giống chó
Giống chó Số mẫu HT kiểm tra Số mẫu HT dương tính Tỷ lệ (%)
Tỷ lệ nhiễm Leptospira ở giống chó nội 23,71% và giống chó ngoại
22,24% khác nhau không ý nghĩa thống kê Điều này có thể do trong cùng một môi trường sống nên khả năng chó tiếp xúc với mầm bệnh là như nhau
nên tỷ lệ nhiễm Leptospira không khác biệt giữa hai nhóm giống chó giống
như nhận định của Harland et al (2013) và Maele et al (2008), yếu tố giống không ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm Leptospira
Bảng 4.5 Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo lứa tuổi chó
kiểm tra
Số mẫu HT dương tính
Tỷ lệ (%)
Tỷ lệ dương tính với Leptospira cao nhất ở chó lớn hơn 6 năm tuổi
(26,04%), kế đến chó từ ≤ 1 tuổi đến 6 năm tuổi (22,52%) và chó từ 4 tháng đến dưới 12 tháng tuổi có tỷ lệ nhiễm thấp nhất (21,51%), tuy nhiên qua phân tích thống kê khác nhau không có ý nghĩa Điều này nói lên rằng
Leptospira có thể gây bệnh cho chó ở mọi lứa tuổi và chó càng lớn tuổi thì
có tỷ lệ nhiễm càng cao (Harland et al., 2013)
Trang 13Bảng 4.6 Tỷ lệ chó nhiễm Leptospira theo giới tính
Giới tính Số mẫu HT kiểm tra Số mẫu HT dương tính Tỷ lệ (%)
Bảng 4.6 cho thấy ở ĐBSCL chó đực dương tính với Leptospira
24,20% và chó cái 22,01% và khác biệt không có ý nghĩa thống kê Điều
này nói lên rằng chó đực và cái đều có thể nhiễm Leptospira như nhau Theo kết quả khảo sát của Senthil et al (2013), tỷ lệ nhiễm Leptospira
trên chó đực (20,9%) và chó cái (21%) là tương đương nhau và nghiên cứu
của Dhliwayo et al (2012) và Anabel et al (2013) nhận xét tỷ lệ chó dương tính với Leptospira không phụ thuộc theo giới tính
Bảng 4.7 Tỷ lệ chó nhiễm Leptospira theo phương thức nuôi
Phương thức nuôi Số mẫu HT kiểm tra Số mẫu HT dương tính Tỷ lệ (%)
Những số liệu trong cùng một cột với chữ mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05)
Kết quả Bảng 4.7 cho thấy tỷ lệ dương tính với Leptospira đối với
chó nuôi thả rong là 25,92% cao hơn chó nuôi nhốt 17,56% và sai khác có
ý nghĩa thống kê (P<0,01) Điều này có thể giải thích do chó nuôi thả rong
ít được quan tâm chăm sóc, điều kiện vệ sinh kém có nhiều cơ hội tiếp xúc với mầm bệnh thông qua hoạt động tìm kiếm thức ăn hằng ngày, tiếp xúc
với nước tiểu chuột hoặc uống nước bẩn, ăn thức ăn có nhiễm Leptospira hơn chó nuôi nhốt nên chó nuôi thả rong có tỷ lệ nhiễm Leptospira cao hơn
(Garde, 2013)