Mục đích của luận án nhằm khảo sát sự lưu hành của xoắn khuẩn Leptospira trên chó và chuột. Nghiên cứu những biến đổi bệnh lý Leptospirosis trên chó. Nghiên cứu hiệu quả điều trị bệnh Leptospirosis trên chó.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI Mã ngành: 62 64 01 02 NGUYỄN THỊ BÉ MƯỜI KHẢO SÁT XOẮN KHUẨN LEPTOSPIRA VÀ LEPTOSPIROSIS TRÊN CHÓ Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SƠNG CỬU LONG Cần Thơ-2019 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS HỒ THỊ VIỆT THU Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại:…………………………………., Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc … … ngày …… tháng … năm ……… Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam Chương GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Bệnh xoắn khuẩn bệnh truyền nhiễm chung cho nhiều loài gia súc người gây số loài xoắn khuẩn gây bệnh (pathogenic Leptospira species) Bệnh xảy phổ biến khắp giới, vùng nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, thuận lợi cho tồn xoắn khuẩn mơi trường bên ngồi (Evangelista and Coburn, 2010) Xoắn khuẩn gây bệnh tồn ống thận thải qua nước tiểu làm vấy nhiễm môi trường (Adler and Moctezuma, 2010) tự nhiên chuột cống nguồn tàng trữ xoắn khuẩn nguồn truyền lây bệnh cho chó, người loài động vật khác (Syke et al., 2011) Ở Việt Nam thời gian qua có nhiều nghiên cứu tình hình nhiễm Leptospira lồi động vật kết cho thấy tỷ lệ nhiễm Leptospira biến động, phụ thuộc vào động vật khảo sát, thời gian địa điểm khảo sát (Vũ Đình Hưng, 1995; Nguyễn Thị Ngân, 2000; Lê Huỳnh Thanh Phương, 200; Hoàng Mạnh Lâm, 2002 Hoàng Kim Loan, 2013) Tuy nhiên nghiên cứu bệnh chó ít, đặc biệt khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) chưa có nghiên cứu Leptospira bệnh Leptospirosis chó Do đề tài nghiên cứu “Khảo sát xoắn khuẩn Leptospira Leptospirosis chó số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long” thực 1.2 Mục tiêu đề tài - Khảo sát lưu hành xoắn khuẩn Leptospira chó chuột - Nghiên cứu biến đổi bệnh lý Leptospirosis chó - Nghiên cứu hiệu điều trị bệnh Leptospirosis chó 1.3 Những đóng góp luận án Đây cơng trình nghiên cứu phát loài Leptospira interrogans Leptospira fainei diện chó chưa tiêm phòng bệnh Leptospirosis số tỉnh ĐBSCL 1.4 Ý nghĩa khoa học luận án Đây cơng trình nghiên cứu tình hình dịch tễ bệnh Leptospirosis chó, sở khoa học cho việc xây dựng qui trình phòng trị bệnh chó, hạn chế bệnh người loài động vật khác Chương III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung 1: Xác định tình hình nhiễm xoắn khuẩn Leptospira chó chuột 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Khảo sát lưu hành Leptospia thực chó khỏe chó bệnh, tháng tuổi trở lên chưa tiêm phòng Leptospirosis, từ hộ chăn nuôi tỉnh (Cần Thơ, Vĩnh Long, An Giang Cà Mau) phòng khám thú y (bao gồm chó khỏe chó bệnh) địa bàn thành phố Cần Thơ Khảo sát lưu hành Leptospira chuột từ chuột bẫy hộ ni chó lấy mẫu khảo sát 3.1.2 Phương pháp thực a Phương pháp lấy mẫu Mẫu huyết chó: điều tra huyết học cắt ngang thực 1.433 mẫu huyết (HT) chó khỏe chó bệnh chưa tiêm phòng bệnh Leptospirosis theo giống, lứa tuổi, giới tính phương thức ni tỉnh thuộc ĐBSCL Cỡ mẫu: cỡ mẫu ước lượng cần phải lấy dựa theo công thức dịch tễ Fosgate (2009) cho tỉnh khảo sát Bảng 3.1 Số lượng (SL) mẫu HT chó 2 P(1-P).Z 0,2(1-0,2) 1,96 Địa điểm SL (con) n= = = 245 Cần Thơ 650 d2 0,052 Vĩnh Long 256 An Giang 263 Như cỡ mẫu cần phải lấy tỉnh 264 245 mẫu HT chó trở lên thể Cà Mau Tổng 1.433 qua Bảng 3.1 Mẫu huyết chuột: điều tra huyết học cắt ngang phân tích mẫu huyết chuột tỉnh ĐBSCL Cỡ mẫu: cỡ mẫu ước lượng cần phải lấy dựa theo công thức: Bảng 3.2 Phân bố mẫu huyết chuột Địa điểm SL P(1-P) Z2 0,071(1-0,071) 1,962 (con) n= = = 101 Cần Thơ 195 d2 0,052 Vĩnh Long 140 An Giang 185 Như cỡ mẫu cần phải lấy tỉnh Cà Mau 127 101 mẫu huyết chuột trở lên Tổng 647 thể qua Bảng 3.2 Tổng số 647 chuột, chuột cống (Rattus norvegicus) 285 con, chuột xạ (Suncus murinus) 152 chuột nhắt (Mus musculus) 210 b Phương pháp xét nghiệm Phản ứng MAT (Microscopic Agglutination Test) sử dụng để phát kháng thể đặc hiệu kháng Leptospira chó chuột với 18 nhóm huyết Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh cung cấp (theo qui trình WHO, 2003) Phản ứng kết luận dương tính hiệu giá ngưng kết ≥ 1: 200 mẫu huyết chó ≥ 1: 20 mẫu huyết chuột c Chỉ tiêu khảo sát - Tỷ lệ nhiễm Leptospira chó chuột theo địa điểm khảo sát - Tỷ lệ nhiễm serogroup Leptospira chó chuột - Cường độ nhiễm serogroup Leptospira chó chuột - Tỷ lệ nhiễm Leptospira chó theo theo giống, độ tuổi, giới tính phương thức ni chó - Hệ số tương quan (R2) tỷ lệ dương tính serogroup Leptospira chuột chó, phương trình hồi qui tuyến tính y=a+bx 3.2 Nội dung 2: Phát xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu Việc phát xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu thực 63 chó khảo sát tiêu sinh lý sinh hóa máu nước tiểu từ 111 chó có MAT ≥ 1: 400 3.3.1 Phát xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu kỹ thuật PCR Phương pháp thực hiện: nước tiểu lấy dòng ống thông qua niệu đạo thu trực tiếp lúc thú tiểu với lượng nước tiểu cần lấy 6-20 ml, chia làm phần để phân tích - Phần 1: lấy ml nước tiểu chưa ly tâm để phân tích tiêu sinh lý nước tiểu - Phần 2: lấy ml nước tiểu sau ly tâm để ly trích DNA - Phần 3: lấy ml nước tiểu sau ly tâm để nuôi cấy môi trường Ellinghausen-McCullough-Johnson (EMJH) Thực phản ứng PCR Sáu mươi ba mẫu nước tiểu chó sử dụng để ly trích DNA dùng cho phản ứng PCR sở khuếch đại gene 16S rRNA Bảng 3.3 Trình tự nucleotide cặp mồi dùng khuếch đại vùng gene 16S rRNA Gene Mồi tổng Trình tự nucleotide bp M-27F 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’ 1500 16S M-1492R 5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT bp T-3’ Mồi tổng dựa theo nghiên cứu Weisburg et al (1991) Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích/1phản Nồng độ/1 phản ứng ứng 2X Master Mix 25X 1X Primer M-27F (10 µM) µL 0,4 µM Primer M-1492R (10 µM) µL 0,4 µM DNA tách chiết 1-2 µL 50-100 ng Bi.H20 Đủ 50 µL Bảng 3.5 Quy trình nhiệt phản ứng PCR Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ 95oC phút 95oC 30 giây 55oC 30 giây 30 o 72 C phút 45 giây 72oC phút 3.3.2 Phát xoắn khuẩn Leptospira từ mẫu nuôi cấy Phương pháp nuôi cấy xoắn khuẩn - Leptospira ni cấy theo qui trình WHO (2003) môi trường EMJH, quan sát KHV đen định danh đến mức loài kỹ thuật PCR giải trình tự - Kỹ thuật PCR thực mục 3.3.1 Giải trình tự đoạn gene 16S rRNA xoắn khuẩn Leptospira - Sản phẩm PCR sau tinh giải trình tự nucleotide Cơng ty Macrogen (Hàn Quốc) - Mẫu giải trình tự gene 16S rRNA tự động máy ABI 3130 Sequencer, sử dụng cặp mồi 27F 1492R - Nếu mức độ đồng trình tự nucleotide đoạn gene 16S rRNA đạt ≥ 95% xác định tới chi (genus) ≥ 99% xác định tới lồi (species) (dựa theo mô tả mức độ tương đồng La Scola et al., 2006) - Cây phát sinh loài xây dựng dựa trình tự nucleotide cách sử dụng phần mềm MEGA 7.0 (Kumar et al., 2016) Tra cứu kết BLAST SEARCH so sánh vi khuẩn sẵn có từ GenBank, sở liệu NCBI để xác định loài phân lập hai loài xoắn khuẩn Leptospira tham chiếu dùng để so sánh phân tích phát sinh loài: >Icterohaemorrhagiae NR_116542.1 Leptospira interrogans serovar icterohaemorrhagiae strain RGA 16S ribosomal RNA gene, partial sequence >Hurstbridge NR_043049.1 Leptospira fainei serovar hurstbridge strain BUT 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 3.3 Nội dung 3: Khảo sát biến đổi bệnh lý bệnh Leptospirosis chó - Những biến đổi bệnh lý chó bệnh khảo sát dựa số sinh lý sinh hóa máu nước tiểu 13 chó dương tính với Leptospira PCR có MAT≥ 1: 400 a Xét nghiệm máu Các tiêu sinh lý máu khảo sát máy huyết học (Cell Dyn 3200, Mỹ) bao gồm: bạch cầu, neutrophile%, lymphocytes%, hồng cầu, hemoglobin, hematocrit, tiểu cầu tiêu sinh hóa máu khảo sát máy phân tích sinh hóa máu (AU604, Nhật): ure, creatinin, AST, ALT bilirubin so sánh với tiêu chuẩn The Merck (2010) b Xét nghiệm nước tiểu - Các tiêu sinh lý nước tiểu khảo sát máy phân tích nước tiểu (U120, Mỹ) bao gồm: hồng cầu, bạch cầu, protein bilirubin so sánh với tiêu chuẩn Merck (2010) Khorami et al (2010) c Chỉ tiêu khảo sát - Sự thay đổi tiêu sinh lý sinh hóa máu nước tiểu chó bệnh Leptospirosis - Những dấu hiệu lâm sàng chó nghi bệnh Leptospirosis: sốt, bỏ ăn, nơn mửa, xuất huyết da, 3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu biện pháp điều trị bệnh Leptospirosis chó Đối tượng nghiên cứu: chó khỏe chó bệnh mang đến khám điều trị phòng khám thú y thành phố Cần Thơ - Bố trí phác đồ điều trị có hợp tác tham gia nghiên cứu với chủ ni - Sáu mươi ba chó nội dung có hiệu giá kháng thể kháng Leptospira ≥ 1: 400, có diện xoắn khuẩn Leptospira nước tiểu soi KHV đen (được phân bố ngẫu nhiên gồm 32 chó khơng biểu triệu chứng lâm sàng (TCLS) 31 chó có số biểu TCLS nghi nhiễm bệnh Leptospirosis: ói, ăn ít, buồn, lười vận động, suy thận, suy gan, báng bụng, xuất huyết da vàng da) Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm Thuốc sử dụng Số chó điều Liều lượng Đường Liệu trình trị (con) cấp Phác đồ 1: 20 0,2 mg/kgP, Tiêm 7–14 ngày Shoptapen cách ngày da/ bắp (Penicillin G+Streptomycin) Phác đồ 2: 22 22 mg/kgP, Uống 7–14 ngày Amoxicillin ngày lần Phác đồ 3: 21 mg/kgP, Uống 7–14 ngày Doxycycline ngày lần Chỉ tiêu theo dõi để đánh giá hiệu điều trị dựa theo Goldstein, (2010); Sykes et al (2011); Francey and Schweighauser, (2012) Schuller et al (2015) 3.5 Phân tích xử lý số liệu - Xử lý thống kê phần mềm Microsoft Excel 2013 - Các tiêu sinh lý máu, sinh hóa máu, sinh lý, sinh hóa nước tiểu trình bày dạng ± SE - Khảo sát yếu tố liên quan đến tỷ lệ nhiễm Leptospira bao gồm nhóm giống, nhóm tuổi, giới tính phương thức ni phép trắc nghiệm χ2 phần mềm Minitab 16.0 - Phương pháp hồi qui (regression) dùng phân tích mối tương quan tỷ lệ nhiễm Leptospira chuột chó với phương trình có dạng: y=a+ bx, a b số, y x tỷ lệ dương tính chó chuột Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết khảo sát tình hình nhiễm Leptospira chó chuột 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm xoắn khuẩn Leptospira chó số tỉnh ĐBSCL Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm Leptospira chó Tỉnh Số mẫu HT kiểm tra Số mẫu HT Tỷ lệ dương dương tính tính (%) Cần Thơ 650 159 24,46a Vĩnh Long 256 69 26,95a An Giang 263 53 20,15a Cà Mau 264 50 18,94b Tổng 1.433 331 23,10 Những số liệu cột với chữ mũ khác khác có ý nghĩa thống kê (P