Nghiên cứu tác dụng của cao chiết cồn từ vỏ quả Thanh long ruột trắng (Hylocereus undatus) trên mô hình chuột nhắt đái tháo đường

Nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết và bảo vệ gan, thận của cao chiết cồn 45% từ vỏ quả Thanh long trên bệnh cảnh đái tháo đường thực nghiệm.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA CAO CHIẾT CỒN TỪ VỎ QUẢ THANH LONG RUỘT TRẮNG (HYLOCEREUS UNDATUS) TRÊN MƠ HÌNH CHUỘT NHẮT ĐÁI THÁO ĐƯỜNG Trịnh Minh Thiên*, Nguyễn Lĩnh Nhân*, Nguyễn Thị Thu Hương* TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết bảo vệ gan, thận cao chiết cồn 45% từ vỏ Thanh long bệnh cảnh đái tháo đường thực nghiệm Phương pháp nghiên cứu: Chuột gây tăng glucose huyết cách tiêm phúc mạc streptozotocin với liều 170 mg/kg Đánh giá tác dụng hạ đường huyết định lượng nồng độ glucose huyết tương lúc đói nghiệm pháp dung nạp glucose Về tác dụng bảo vệ gan, thận khảo sát định lượng malondialdehyde (MDA) dịch đồng thể gan-thận Các liều thử nghiệm chọn 0,875 g/kg 1,75 g/kg (tương đương với 2,5 g g dược liệu khô tuyệt đối/kg thể trọng chuột) Kết quả: Ở hai liều thử nghiệm, cao chiết cồn 45% từ vỏ Thanh long làm giảm nồng độ glucose huyết chuột bị đái tháo đường hai thực nghiệm xác định glucose huyết đói nghiệm pháp dung nạp glucose; nhiên, tác dụng yếu so với thuốc đối chiếu glibenclamid liều mg/kg chưa đưa trị số sinh lý Cao chiết cồn 45% từ vỏ Thanh long hai liều thử nghiệm làm giảm hàm lượng MDA gan thận chuột thử nghiệm, tác dụng tương đương với thuốc đối chiếu glibenclamid liều mg/kg Kết luận: Cao chiết cồn 45% từ vỏ Thanh long ruột trắng thể tác dụng hạ đường huyết bảo vệ gan, thận theo hướng kháng stress oxy hóa bệnh cảnh đái tháo đường thực nghiệm gây streptozotocin Từ khóa: Vỏ Thanh long, hạ đường huyết, tác dụng bảo vệ gan,thận, stress oxy hóa ABSTRACT STUDY ON THE EFFECTS OF THE ETHANOL EXTRACT FROM HYLOCEREUS UNDATUS FRUIT PEEL ON DIABETIC MOUSE MODEL Trinh Minh Thien, Nguyen Linh Nhan, Nguyen Thi Thu Huong * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 22 - No 5- 2018: 109 – 114 Objectives: The aim of this study is to investigate the hypoglycemic and hepatorenal protective effects of 45% ethanol extract from Hylocereus undatus fruit peel in diabetic mouse model Methods: Swiss albino mice were caused hyperglycemia by streptozotocin (170 mg/kg, intraperitoneal injection) The hypoglycemic effect was evaluated on measurement of fasting plasma glucose level and oral glucose tolerance test The hepatorenal protective effect was evaluated by malondialdehyde (MDA) in liver or kidney homogenates The extract doses were 0.875 g/kg and 1.75 g/kg (equivalent to 2.5 g and g absolute dry weights of raw materials/ kg mouse body weight) Results: The 45% ethanol extract from H undatus fruit peel at test doses reduced plasma glucose levels in fasted diabetic mice and at 30 or 120 after glucose overload in oral glucose tolerance test However, this effect was weaker than glibenclamide (at dose of m /kg) and not restored to physiological values The 45% ethanol extract from H undatus fruit peel as well as glibenclamide also reduced MDA contents in the liver and kidneys homogenates of diabetic mice  Trung Tâm Sâm Dược liệu TP Hồ Chí Minh - Viện Dược liệu Tác giả liên lạc: PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương ĐT: 02838274377 Email: huongsam@hotmail.com 109 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Conclusions: The 45% ethanol extract from H undatus fruit peel had the hypoglycemic and hepatorenal protective effects in streptozotocin-induced diabetic mice Keywords: Hylocereus undatus fruit peel, hypoglycemia, hepatorenal protective effect, oxidative stress lý vỏ Thanh long Việt Nam giới ĐẶT VẤN ĐỀ hạn, phần lớn nghiên cứu quan tâm đến Thanh long (Hylocereus undatus, dragon fruit) thịt Thanh long Vì vậy, nhóm nghiên cứu thuộc họ Cactaceae loại trái nhiệt đới tiến hành khảo sát tác dụng cao chiết từ vỏ với nguồn vitamin C cần thiết cho thể Thanh long bệnh cảnh gây tăng đường việc giúp cải thiện hệ miễn dịch, giàu huyết thực nghiệm streptozotocin Từ đó, đề phospho canxi có vai trò thiết yếu tài hướng đến mục tiêu sàng lọc thêm nguồn trình hình thành xương, phát triển dược liệu góp phần cải thiện sức khỏe, nâng tế bào, thành phần caroten có tác dụng cao chất lượng sống người trì cải thiện thị lực(8) Ngồi ra, Thanh long ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU có tác dụng ổn định huyết áp, mang lại nhiều lợi ích cho người có nguy bị nhồi máu Đối tượng nghiên cứu (8) tim đột quỵ Hui Luo cộng (2014) Vỏ Thanh long thu từ tươi tiến hành phân tích thành phần hóa thực vật trồng tỉnh Bình Thuận Vỏ Thanh long có vỏ Thanh long ruột trắng cho thấy có chứa màu tím hồng thái mỏng từ - cm, phơi β-amyrin (23,39%), γ-sitosterol (19,32 %), khô, xay thành bột có kích thước - mm với độ octadecan (9,25%), heptacosan (5,52%), ẩm đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn Dược điển Việt campesterol (5,27%), nonacosan (5,02%), Nam IV (< 13%) Bột khô dược liệu vỏ Thanh hexadecyl ester (5,21%) ,… Cao chiết vỏ long chiết với cồn 45% phương pháp Thanh long thể hoạt tính gây độc tế bào chiết ngấm kiệt với tỷ lệ dược liệu: dung mơi hoạt tính đánh bắt gốc tự do(3) Kolla cộng 1:15, thu nhận cao chiết cồn 45% từ vỏ (2010) cho thấy cao chiết nước từ Thanh long Thanh long có độ ẩm 13,23% đạt yêu cầu liều 250 mg/kg 500 mg/kg làm giảm nồng độ tiêu khối lượng làm khô theo tiêu chuẩn đường huyết lúc đói mơ hình đái tháo Dược điển Việt Nam IV áp dụng cho cao đặc (< đường gây streptozotocin (liều 40 mg/kg) 20%) Hàm lượng polyphenol cao chiết cồn làm giảm hàm lượng malondialdehyde (MDA)(7) 45% từ vỏ Thanh long 10,56% Các liều Gần nghiên cứu lâm sàng chứng thử nghiệm chọn tương đương với 2,5 minh tác dụng hạ đường huyết Thanh g dược liệu khô tương ứng với 1/40 Dmax long bệnh nhân bị đái tháo đường tuýp 2(5) 1/20 Dmax (Dmax liều tối đa cho uống mà Việt Nam quốc gia có diện tích sản khơng gây chết chuột thử nghiệm khảo sát lượng Thanh long lớn châu Á độc tính cấp đường uống) nước hàng đầu giới Động vật nghiên cứu xuất Thanh long (Theo: vtv.vn/xuat-khauCác thử nghiệm thực chuột thanh-long.html) Thanh long nhắt trắng đực chủng Swiss albino, tuần tuổi, trồng hầy hết tỉnh thành, phát triển trọng lượng trung bình 25 ± g, cung cấp mạnh thành vùng chuyên canh quy mô lớn Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế Nha Trang tập trung tỉnh Bình Thuận, Tiền Giang Chuột nuôi thực phẩm viên Long An (Theo: https://vnexpress.net, cung cấp Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế 9/2/2018) Mặc dù sử dụng rộng Nha Trang, với nước uống đầy đủ Thể tích cho rãi nguồn trái có giá trị dinh dưỡng uống tiêm 0,1 ml/10 g cân nặng cao; nay, nghiên cứu tác dụng dược 110 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Hóa chất – thuốc thử nghiệm Khảo sát nồng độ glucose huyết tương(4,9) Streptozotocin (Sigma-Aldrich Co., Ltd, USA) thuốc đối chiếu Glibenclamid (chứa glibenclamid mg/viên, Số lô 0030916, hạn dùng 7/9/2019, Công ty xuất nhập y tế Domesco, Việt Nam) Sau ngày điều trị, chuột cho nhịn đói qua đêm trước tiến hành định lượng glucose huyết đói Chuột uống nước cất, cao thử nghiệm thuốc đối chiếu ngày cuối trước tiến hành lấy máu tĩnh mạch đuôi chuột Nồng độ glucose huyết tương xác định theo Kit GOD-PAP Human Diagnostic Ltd Co (Germany) Phương pháp nghiên cứu Thiết kế thực nghiệm, đo lường độc lập Mơ hình gây tăng đường huyết streptozotocin Thiết kế nghiên cứu ngẫu nhiên, đánh giá thay đổi nồng độ glucose huyết chuột thử nghiệm trước sau gây mơ hình tăng đường huyết streptozotocin so sánh thống kê tác dụng cao chiết với lô chứng (không điều trị) với lơ thuốc đối chiếu (chọn thuốc có tác dụng điển hình lâm sàng glibenclamid) Chuột gây tăng glucose huyết cách tiêm phúc mạc (i.p) streptozotocin (pha đệm natri citrat pH 4,5) với liều 170 mg/kg thể trọng Sau ngày tiêm, lấy máu tĩnh mạch đuôi chuột định lượng glucose huyết, chọn chuột có trị số glucose huyết đo lúc đói (fasted blood glucose) ≥ 126 mg/dl (Theo: American Diabetes Association: Standards of medical care in diabetes, 2016) phân chia ngẫu nhiên vào lơ thử nghiệm nhóm bệnh lý (Bảng 1) Đối với nhóm sinh lý, chuột thử nghiệm tiêm đệm natri citrat pH = 4,5 (i.p) phân lơ thử nghiệm tương tự nhóm bệnh lý(4) Bảng Bố trí lơ thử nghiệm Nhóm Lơ chuột n=8 Chứng Nhóm sinh lý Thử Thử Đối chiếu Chứng Nhóm bệnh lý Thử Thử Đối chiếu Thuốc thử nghiệm Nước cất Cao chiết cồn vỏ Thanh long (Cao TL) liều (0,875 g/kg) Cao chiết cồn vỏ Thanh long liều (1,75 g/kg) Glibenclamid (5 mg/kg) Nước cất Cao chiết cồn vỏ Thanh long liều (0,875 g/kg) Cao chiết cồn vỏ Thanh long liều (1,75 g/kg) Glibenclamid (5 mg/kg) Nghiệm pháp dung nạp glucose Nghiệm pháp dung nạp glucose tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh đái tháo đường tin cậy lâm sàng, theo mơ hình WHO, sử dụng liều uống 75 g glucose đo đường huyết sau với giá trị chẩn đoán ≥200 mg/dl (đái tháo đường) khoảng 140 199 mg/dl (rối loạn dung nạp glucose) (Theo: American Diabetes Association: Standards of medical care in diabetes, 2016) Trên động vật thử nghiệm chuột nhắt trắng, liều uống glucose g/kg thể trọng chuột đo đường huyết sau 30 phút 120 phút với giá trị chẩn đoán tương tự người Cho chuột nhịn đói 12 giờ, tiến hành lấy máu tĩnh mạch đuôi chuột xác định nồng độ glucose huyết ban đầu Cho chuột uống mẫu thử định ngày ngày Sau lần uống cuối tiến hành nghiệm pháp dung nạp glucose (cho uống dung dịch glucose liều g/kg), lấy máu tĩnh mạch đuôi để xác định nồng độ glucose huyết tương sau gây dung nạp 30 phút 120 phút(9) Định lượng MDA gan thận chuột(1,2) Đồng thể gan (hoặc thận) chuột dung dịch KCl 1,15% theo tỷ lệ 1:9 vòng phút Cho 1ml dịch đồng thể gan (hoặc ml dịch đồng thể thận) vào ống ly tâm, bổ sung dung dịch đệm Tris-HCl (pH = 7,4) vừa đủ ml Hỗn hợp phản ứng ủ 37 oC vòng 60 phút, sau dừng phản ứng ml acid tricloacetic 10% ly tâm nhiệt độ oC vòng 10 phút với tốc độ 10.000 vòng/phút Thu ml dịch sau ly tâm cho phản ứng với ml acid thiobarbituric 0,8% 100 oC 15 phút Đo độ 111 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học hấp thu bước sóng 532 nm tính tốn hàm lượng MDA (nM/g protein) theo phương trình hồi quy tuyến tính chất chuẩn MDA Đánh giá kết Các số liệu biểu thị trung bình: M ± SEM (Standar Error of the Mean – sai số chuẩn trị số trung bình) xử lý thống kê dựa vào phép kiểm One–Way ANOVA Student Newman Keuls test (phần mềm SigmaStat 3.5) Kết thực nghiệm có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% p < 0,05 so với lô chứng Cao chiết đánh giá có tác dụng làm hạ đường huyết mức độ giảm nồng độ glucose huyết tương đạt khoảng > 30% so với lô chứng không điều trị KẾT QUẢ Kết khảo sát nồng độ glucose huyết tương Kết Bảng cho thấy cao chiết cồn từ vỏ Thanh long liều 0,875 g/kg liều 1,75 g/kg sau ngày uống không ảnh hưởng nồng độ glucose huyết tương chuột bình thường Trong nhóm bệnh lý, nồng độ glucose huyết tương trước điều trị tăng đạt 52 - 55% so với chứng sinh lý Sau ngày điều trị, nồng độ glucose huyết tương lô uống cao chiết cồn từ vỏ Thanh long liều 0,875 g/kg liều 1,75 g/kg giảm 52%, có khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý Bên cạnh đó, nồng độ glucose huyết tương lô uống cao chiết cồn từ vỏ Thanh long liều 0,875 g/kg liều 1,75 g/kg khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với nhau; có khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô đối chiếu glibenclamid (giảm 60%) có khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý Như vậy, hai liều thử nghiệm, cao chiết cồn từ vỏ Thanh long tác dụng hạ đường huyết chuột bị gây đái tháo đường yếu so với glibenclamid liều mg/kg chưa đưa trị số glucose huyết mức sinh lý Bảng Kết khảo sát nồng độ glucose huyết tương chuột đo lúc đói lơ thử nghiệm Lô thử nghiệm (n=8) Chứng sinh lý Cao TL liều 0,875 g/kg Sinh lý Cao TL liều 1,75 g/kg Glibenclamid liều mg/kg Nhóm Chứng bệnh lý Bệnh lý Cao TL liều 0,875 g/kg Cao TL liều 1,75 g/kg Glibenclamid liều mg/kg Nồng độ glucose huyết tương (mg/dL) Trước điều trị Sau điều trị ngày 96,89 ± 3,41 95,44 ±3,27 94,56 ± 6,39 94,89 ± 4,01 93,00 ± 4,38 91,33 ± 4,95 89,11 ± 5,53 81,89 ± 3,91* (giảm 14%) 212,56 ± 16,35* 250,67 ± 11,89* (tăng 54% so với chứng sinh lý) (tăng 62% so với chứng sinh lý) #$ 200,56 ± 12,54* 120,44 ± 1,86* (giảm 52% so với chứng bệnh lý) #$ 200,67 ± 12,21* 119,11 ± 4,32* (giảm 52 % so với chứng bệnh lý) # 215,33 ± 12,76* 99,56 ± 4,67 (giảm 60% so với chứng bệnh lý) Cao TL: cao Thanh long * p < 0,05 so với lô chứng sinh lý # p < 0,05 so với lô chứng bệnh lý $ p < 0,05 so với lô đối chiếu thuộc nhóm bệnh lý Kết bảng cho thấy cao chiết cồn từ vỏ Thanh long liều 0,875 g/kg liều 1,75 g/kg sau ngày uống không ảnh hưởng nồng độ glucose huyết tương chuột bình thường nghiệm pháp dung nạp glucose Ở thời điểm 30 phút sau dung nạp glucose, nhóm bệnh lý, nồng độ glucose huyết tương lô cho uống cao chiết cồn từ vỏ Thanh long liều 0,875 g/kg liều 1,75 g/kg giảm 39% 43% (tương ứng) đạt ý nghĩa thống kê so 112 với lô chứng bệnh lý Ở thời điểm 120 phút sau dung nạp glucose, nhóm bệnh lý, nồng độ glucose huyết tương lô thử uống cao chiết cồn từ vỏ Thanh long liều 0,875 g/kg liều 1,75 g/kg giảm 50% 56% (tương ứng) khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý Trong nghiệm pháp dung nạp glucose, nồng độ glucose huyết tương lô uống cao chiết cồn từ vỏ Thanh long liều 0,875 g/kg Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 liều 1,75 g/kg khơng có khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với nhau; có khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô đối chiếu glibenclamid (giảm 47% 61%) có khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý (Bảng 3) Nghiên cứu Y học Như vậy, cao chiết cồn từ vỏ Thanh long thể tác dụng hạ đường huyết chuột bị gây đái tháo đường nghiệm pháp dung nạp glucose, yếu so với thuốc đối chiếu chưa đưa mức sinh lý Bảng Kết khảo sát tác dụng cao chiết cồn 45% từ vỏ Thanh long nồng độ glucose huyết tương chuột theo nghiệm pháp dung nạp glucose Lô thử nghiệm (n=8) Chứng sinh lý Cao TL liều 0,875 g/kg Cao TL liều 1,75 g/kg Nhóm Sinh lý Glibenclamid liều mg/kg Chứng bệnh lý Cao TL liều 0,875 g/kg Bệnh lý Cao TL liều 1,75 g/kg Glibenclamid liều mg/kg Cao TL: cao Thanh long # * Nồng độ glucose huyết tương ( mg/dL) Sau 30 phút dung nạp glucose Sau 120 phút dung nạp glucose 138,22 ±3,58 101,67 ±2,93 127,44 ±4,15 102,44 ±3,06 134,22 ±4,28 100,89 ± 2,79 114,44 ±2,98* 91,44 ± 2,54* (giảm 17% so với chứng sinh lý) (giảm 11% so với chứng sinh lý) 304,22 ± 5,58* 274,44 ± 6,00* (tăng 55% so với chứng sinh lý) (tăng 63% so với chứng sinh lý) *#$ *#$ 186,67 ± 6,99 138,67 ± 2,96 (giảm 39% so với chứng bệnh lý) (giảm 50% so với chứng bệnh lý) *#$ *#$ 174,78 ± 7,14 120,44 ± 6,81 (giảm 43% so với chứng bệnh lý) (giảm 56% so với chứng bệnh lý) # # 160,22 ± 10,27 106,89 ± 3,13 ( giảm 47% so với chứng bệnh lý) (giảm 61% so với chứng bệnh lý) p < 0,05 so với chứng sinh lý thời điểm p < 0,05 so với lô chứng bệnh lý thời điểm $ p < 0,05 so với lô đối chiếu thuộc nhóm bệnh lý Kết định lượng MDA gan thận Bảng Hàm lượng MDA gan thận lơ thí nghiệm Nhóm Sinh lý Bệnh lý Lô thử nghiệm (n = 8) Chứng sinh lý Cao TL liều 0,875 g/kg Cao TL liều 1,75 g/kg Glibenclamid liều mg/kg Chứng bệnh lý Cao TL liều 0,875 g/kg Cao TL liều 1,75 g/kg Glibenclamid liều mg/kg Hàm lượng MDA gan (nM/g protein) 35,36 ± 2,41 36,05 ± 3,85 35,77 ± 3,12 35,39 ± 3,85 59,89 ± 4,63* # 38,66 ± 5,41 # 38,36 ± 5,46 # 36,79 ± 3,72 Cao TL: cao Thanh long * p < 0,05so với lô chứng sinh lý Kết bảng cho thấy cao chiết cồn từ vỏ Thanh long liều 0,875 g/kg liều 1,75 g/kg sau ngày uống không ảnh hưởng hàm lượng MDA gan hay thận chuột bình thường Trong nhóm bệnh lý hàm lượng MDA (marker tiêu biểu tổn thương peroxy hóa gây gốc tự do) gan lô chứng tăng 69,4% hàm lượng MDA thận lô chứng tăng 27,6%, đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý, chứng tỏ có tổn thương oxy hóa tế bào # Hàm lượng MDA thận (nM/g protein) 166,12 ± 9,74 159,87 ± 9,82 160,89 ± 13,07 161,12 ± 11,17 211,99 ± 11,09* # 161,78 ± 11,24 # 163,76 ± 15,07 # 163,04 ± 9,12 p