Xác định người lành mang gen bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne bằng kỹ thuật microsatellite - DNA

Loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy - DMD) là một trong những bệnh lý di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể (NST) giới tính X phổ biến nhất. Hiện nay chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu, trẻ mắc bệnh có biểu hiện yếu cơ tiến triển, mất dần khả năng đi lại.

Khoa học Y - Dược Xác định người lành mang gen bệnh loạn dưỡng Duchenne kỹ thuật microsatellite - DNA Lê Thị Phương, Trần Huy Thịnh, Trần Vân Khánh* Trường Đại học Y Hà Nội Ngày nhận 17/7/2019; ngày chuyển phản biện 25/7/2019; ngày nhận phản biện 28/8/2019; ngày chấp nhận đăng 20/9/2019 Tóm tắt: Loạn dưỡng Duchenne (Duchenne muscular dystrophy - DMD) bệnh lý di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể (NST) giới tính X phổ biến Hiện chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu, trẻ mắc bệnh có biểu yếu tiến triển, dần khả lại Phát người lành mang gen bệnh tư vấn di truyền giải pháp hiệu giúp ngăn ngừa giảm tỷ lệ mắc bệnh Việc thực kỹ thuật trực tiếp MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) giải trình tự gen dựa vào đột biến điểm bệnh nhân Tuy nhiên, trường hợp khó khăn để phát đột biến cấu trúc gen lớn kỹ thuật gián tiếp phân tích microsatellite - DNA áp dụng Đề tài thực (2018-2019) với mục tiêu áp dụng kỹ thuật microsatellite phát người lành mang gen bệnh DMD Nghiên cứu xác định 5/5 người mẹ 16/33 thành viên nữ phả hệ gia đình bệnh nhân DMD người lành mang gen bệnh Từ khóa: loạn dưỡng Duchenne, microsatellite - DNA, người lành mang gen bệnh Chỉ số phân loại: 3.5 Đặt vấn đề DMD bệnh lý rối loạn thần kinh hay gặp nhất, chủ yếu trẻ trai với tần suất mắc bệnh cao, tỷ lệ mắc dao động từ 10,71 đến 27,78 100.000 người [1, 2] Biểu lâm sàng mang tính chất tuần tiến, trẻ khả lại, tàn phế chết trước tuổi trưởng thành Bệnh di truyền lặn liên kết với NST giới tính X Đột biến gen dystrophin dẫn đến tồn vẹn protein dystrophin - protein đóng vai trò quan trọng để bảo vệ trình co gây nên bệnh [3] Có ba dạng đột biến gen dystrophin thường gặp: đột biến xóa đoạn gen dystrophin (60÷65%); đột biến điểm (25÷30%) đột biến lặp đoạn (5÷10%) [4] Những tiến y học nhằm điều trị bệnh DMD hai thập kỷ gần giúp nâng cao chất lượng sống kéo dài thời gian sống bệnh nhân Liệu pháp điều trị gen bệnh nhân DMD đem lại hy vọng to lớn cho người bệnh giai đoạn nghiên cứu thử nghiệm [5, 6], sàng lọc người mang gen bệnh chẩn đốn trước sinh bệnh lý DMD đóng vai trò quan trọng, sở khoa học cho cơng tác tư vấn di truyền, chẩn đoán trước sinh chẩn đoán tiền làm tổ (Pre-implantation genetic diagnosis - PGD) [7], nhằm đưa lời khuyên di truyền cho sản phụ gia đình, giảm tỷ lệ sinh mắc bệnh, tăng hiệu cơng tác phòng ngừa bệnh tật nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe cộng đồng Hiện nay, có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử áp dụng để phát trực tiếp đột biến gen dystrophin bệnh nhân DMD người lành mang gen bệnh kỹ thuật MLPA với độ xác cao, phát đột biến đoạn 79 exon hay kỹ thuật giải trình tự gen phát tồn đột biến điểm [8] Tuy nhiên, gen dystrophin có chiều dài lớn nên việc phát toàn đột biến gen nhiều thời gian kinh phí, ngồi ra, bệnh nhân DMD/loạn dưỡng Becker (BMD) chưa phát thấy đột biến gen dystrophin [9] Phân tích microsatellite - DNA phương pháp gián tiếp (linkage analysis) phát người lành mang gen dựa vào đoạn trình tự ngắn lặp lại liên tiếp (Short tandem repead - STR) để xác định allele đột biến với thời gian phân tích nhanh giá thành phân tích rẻ Ở Việt Nam, việc phát người lành mang gen bệnh DMD phương pháp gián tiếp thông qua phân tích microsatellite - DNA chưa áp dụng rộng rãi Xuất phát từ thực tế đó, nghiên cứu tiến hành với mục tiêu áp dụng kỹ thuật microsatellite - DNA để xác định người lành mang gen bệnh DMD Tác giả liên hệ: Email: tranvankhanh@hmu.edu.vn * 61(11) 11.2019 58 Khoa học Y - Dược Identification of carriers of Duchenne muscular dystrophy by microsatellite - DNA technique Thi Phuong Le, Huy Thinh Tran, Van Khanh Tran* Hanoi Medical University Received 17 July 2019; accepted 20 September 2019 Abstract: Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common genetic disorder associated with sex chromosome X Currently, there is no effective treatment; children with the disease show progressive muscle weakness, gradually losing their ability to walk Detecting the carriers and giving genetic counseling is the most effective solution to help reduce disease incidents and reduce morbidity This can be done with direct techniques such as Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) and sequencing of genes based on the mutations of patients However, in some cases that are difficult to detect mutations due to large gene structure, indirect techniques such as microsatellite - DNA analysis can be applied The study used the microsatellite - DNA technique and identified 5/5 mothers and 16/33 female members in the pedigrees of families which have DMD patients are carriers Keywords: carriers of DMD, duchenne muscular dystrophy, microsatellite - DNA Classification number: 3.5 Đối tượng phương pháp Đối tượng - bệnh nhân DMD quan hệ huyết thống xác định đột biến gen dystrophin - 38 thành viên nữ (mẹ, bà ngoại, chị em gái, chị em họ, bác gái, dì ) có huyết thống bên ngoại với bệnh nhân Các mẫu máu thu thập thực nghiên cứu Trung tâm Nghiên cứu gen - protein, Trường Đại học Y Hà Nội (20182019) Phương pháp Phương pháp nghiên cứu: thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu: - Tách chiết DNA: DNA tách chiết từ bạch cầu máu ngoại 61(11) 11.2019 vi bệnh nhân người nhà bệnh nhân (mẹ, chị gái) kit Promega Wizard® Genomic DNA Purification Kit, quy trình tiến hành theo hướng dẫn nhà sản xuất - Phân tích microsatellite - DNA: kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi có gắn huỳnh quang để khuếch đại vùng trình tự lặp lại ngắn (Short tandem repeat - STR) xác định kích thước chúng thơng qua điện di mao quản máy giải trình tự gen (automated DNA sequencer) Để xác định allele bệnh từ người mẹ truyền cho trai, nghiên cứu khuếch đại STR có tỷ lệ dị hợp tử cao quần thể người Việt Nam bao gồm: DSTR49, DSTR50, DXS1036, DXS1067, DXS890, DXS9907 Xác định kích thước STR dị hợp tử mẹ, đối chiếu với kích thước STR bệnh nhân để tìm allele bệnh allele lành Đối chiếu kết thành viên nữ khác gia đình bệnh nhân để xác định tình trạng mang gen thành viên Dựa vào kích thước màu sắc chia STR thành set để thực phản ứng multiplex PCR: set gồm STR: DXS890, DXS9907 DSTR49; set gồm STR: DSTR50, DXS1036 DXS1067 Thành phần phản ứng PCR set: 10x đệm PCR; 2,5 mM dNTP; 0,2 µl mồi; 0,5 unit Taq polymerase; 20 ng DNA H2O, tổng thể tích 20 µl Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR: 940C/30 giây; [940C/30 giây, 590C/30 giây, 720C/30 giây] x 35 chu kỳ; 720C/5 phút Sản phẩm khuếch đại PCR điện di hệ thống phân tích di truyền GenomeLab™ GeXP Genetic analysis system Hãng Beckman Coulter Kết phân tích phần mềm Fragments analysis máy Beckman coulter CEQ 8800 - Xác định đột biến gen dystrophin: kỹ thuật giải trình tự gen để xác định đột biến xố đoạn quy trình mơ tả trước [9]; kỹ thuật MLPA xác định đột biến gen bệnh nhân người lành mang gen bệnh thực quy trình mơ tả trước [10] Đạo đức nghiên cứu: bệnh nhân người nhà hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu Bệnh nhân hồn tồn có quyền rút lui khỏi nghiên cứu không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu Bệnh nhân người nhà bệnh nhân thông báo kết xét nghiệm gen để giúp cho bác sỹ tư vấn di truyền Các thơng tin cá nhân đảm bảo bí mật Kết Kết hợp kỹ thuật phân tích trực tiếp kỹ thuật phân tích microsatellite - DNA để xác định người lành mang gen bệnh DMD Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số MD1: Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số MD1 có trai cháu trai chị gái thứ bị bệnh DMD, giải trình tự gen xác định bệnh nhân bị đột biến c.6889C>T(p.Q2297X) exon 47 gen dystrophin, mẹ bệnh nhân chị gái thứ người lành mang gen bệnh, thành viên nữ lại khơng có đột biến (hình 1) 59 Khoa học Y - Dược c.6889C Người bình thường c.6889C>T(p.Q2297X) Chị gái II2 c.6889C>T(p.Q2297X) c.6889C>T(p.Q2297X) c.6889C Bệnh nhân II4 Mẹ bệnh nhân Chị gái II1 I1 c.6889C c.6889C c.6889C Chị gái II2 Cháu gái III1 Cháu gái III2 Hình1.1 Hình kếtgiải giải gen Hình Hình ảnh ảnh kết trình tự trình gen củatựphả hệ MD1.phả lành mang gen bệnh kỹ thuật trực tiếp giải trình tự gen MLPA hoàn toàn trùng khớp với kết kỹ thuật gián tiếp phân tích microsatellite - DNA Xác định người lành mang gen bệnh DMD kỹ thuật phân tích microsatellite - DNA Áp dụng quy trình xác định người lành mang gen bệnh kỹ thuật microsatellite - DNA cho thành viên nữ gia đình bệnh nhân DMD chưa xác định đột biến điểm bệnh nhân hệ MD1 Khikhuếch khuếch STR códịtỷhợplệtửdịcao hợp caothểtrên quần người Khi đại đại STR có tỷ lệ trêntửquần người Việtthể Nam với mẫu phả hệ MD1 xác định STR dị hợpđã tử xác người mẹ lần lượt4là: DXS890, ViệtcủaNam với cácđãmẫu củađược phả4hệ MD1 định STR dị DXS1067, DXS1036 DSTR50 Đối chiếu kích thước STR dị hợp tử người hợp tử người mẹ là: DXS890, DXS1067, DXS1036 mẹ với trai bị bệnh xác định allele đột biến người mẹ có kích thước DSTR50 Đốilàchiếu kích148, thước STR hợp tử người vớilà STR 170, 222, 242 vàcác allele bìnhdịthường có kích thước mẹ b 164, 246 Như người allele gái nhậnđột allele bệnh (170-222-148-242) con226, trai144, bị bệnh xácvậy, định biến Xngười mẹ có kíchtừ mẹ người lành mang gen bệnh, gái nhận allele bình thường X(164thước STR trênhồn lần tồn lượtbình 170, 148, allele bình 226-144-246) người thường.222, Kết xác242 địnhvà gái thứ mang gen bệnh, gái đầu, gái thứ164, 2226, cháu gái của246 bệnh nhân người thường có kích thước lầncon lượt 144, Nhưlàvậy, bình thường (hình 2) Kết hoàn toàn trùng khớp với kết kỹ thuật giải từ mẹ người gái nhận allele bệnh Xb(170-222-148-242) trình tự gen người lành mang gen bệnh, gái nhận allele bình thường X(164-226-144-246) người hồn tồn bình thường Kết xác định gái thứ mang gen bệnh, gái đầu, gái thứ cháu gái bệnh nhân người bình thường (hình 2) Kết hoàn toàn trùng khớp với kết kỹ thuật giải trình tự gen Kết phân tích microsatellite - DNA gia đình bệnh nhân mã số MD4: Phả hệ gia đình bệnh nhân MD4 có trai (III1) bị bệnh, bệnh nhân có bác trai cậu bệnh DMD, mẹ bệnh nhân (II2) bà ngoại bệnh nhân (I1) người dị hợp tử bắt buộc Thực phản ứng PCR khuếch đại STR xác định allele bệnh phả hệ có kích thước STR DXS890, DXS1067, DSTR49, DSTR50 tương ứng 174, 222, 242, 226; phả hệ có mẹ, bà ngoại bác gái bệnh nhân mang allele bệnh Xb(174-222-242-226) người lành mang gen bệnh, em gái bệnh nhân nhận allele lành từ người mẹ X(170, 214, 232, 248) người bình thường (hình 3) Hình Hình ảnh điện di STR: DXS1067 DSTR49 phả hệ MD4 X allele lành, Xb allele bệnh Hình Hình ảnh phả hệ gia đình bệnh nhân MD1 Gia đình bệnh nhân mã số MD2: Thực tương tự với phả hệ lại thu kết bảng Bảng Kết phát người lành mang gen bệnh DMD kỹ thuật microsatellite - DNA Gia đình MD2 có hai người trai bị bệnh Kết MLPA cho thấy bệnh nhân bị đột biến đoạn exon 8-15 gen dystrophin Mẹ bà ngoại người lành mang gen bệnh, hai dì bệnh nhân người bình thường Tiến hành phân tích STR tương tự với gia đình MD1 cho kết tương đồng phương pháp MLPA microsatellite - DNA Như vậy, kết phát người 61(11) 11.2019 60 Thành viên gia đình Mang gen bệnh Khơng mang gen bệnh Tổng số Mẹ bệnh nhân 5 Thành viên nữ khác 16 17 33 Tổng 21 17 38 Khoa học Y - Dược Kết bảng cho thấy, 5/5 người mẹ phát người lành mang gen bệnh, 16/33 thành viên nữ khác (gồm bà ngoại, em gái, chị gái, dì, bác gái, chị họ, em gái họ bệnh nhân) người lành mang gen bệnh, 17/33 thành viên người bình thường Bàn luận Bệnh DMD BMD gây nên đột biến gen dystrophin di truyền lặn liên kết NST giới tính X Mẹ người lành mang gen bệnh có xác suất sinh 50% trai bị bệnh 50% số gái người lành mang gen bệnh giống mẹ Đây bệnh di truyền có tiên lượng nặng, biểu lâm sàng mang tính chất tuần tiến, trẻ bị teo cơ, khả lại chết trước tuổi trưởng thành suy tim rối loạn hô hấp Hiện chưa có phương pháp điều trị bệnh hiệu nên việc phát người lành mang gen bệnh gia đình bệnh nhân tư vấn di truyền biện pháp hữu hiệu nhà khoa học đặt lên hàng đầu nhằm giảm thiểu nguy mắc bệnh phát tán gen bệnh cộng đồng [11, 12] Các xét nghiệm di truyền để xác định đột biến gen khơng dễ dàng thực kích thước lớn gen dystrophin, dạng đột biến vô đa dạng phức tạp Kỹ thuật MLPA cho phép khuếch đại lúc 79 exon với độ xác cao xác định 70% bệnh nhân DMD/BMD bị xóa đoạn lặp đoạn, 30% bệnh nhân lại có đột biến nhỏ đòi hỏi phải sử dụng thêm phương pháp khác giải trình tự Sanger Kỹ thuật giải trình tự gen hệ (next-generation sequencing NGS) kỹ thuật sinh học phân tử đại xác định đột biến 92% tổng số bệnh nhân DMD/BMD [13, 14] Những trường hợp không phát thấy đột biến điểm bệnh nhân rào cản lớn cho xác định người lành mang gen bệnh cấu trúc gen dystrophin lớn Khi đó, kỹ thuật phân tích gián tiếp dựa vào kích thước STR để việc xác định allele đột biến trở nên hiệu Nghiên cứu tiến hành kỹ thuật phân tích microsatellite - DNA để xác định người lành mang gen bệnh thông qua việc khuếch đại vùng trình tự lặp lại STR có tính đa hình cao quần thể người Việt Nam bao gồm: DSTR49, DSTR50, DXS1036, DXS1067, DXS890, DXS9907 Việc khuếch đại STR dựa nguyên tắc phản ứng PCR với mồi gắn huỳnh quang Sản phẩm sau khuếch đại điện di hệ thống điện di mao quản có độ phân giải cao, nhận diện màu huỳnh quang sản phẩm PCR, xác định độ dài (kích thước) STR Dựa vào Quy luật phân ly độc lập Mendel Quy luật di truyền liên kết với NST giới tính X, nghiên cứu phân tích kích thước STR dị hợp tử mẹ, đối chiếu với kích thước STR bệnh nhân để tìm allele bệnh allele lành Khi xác định allele bệnh, đối chiếu kết thành viên nữ gia đình bệnh nhân xác định tình trạng mang gen hay khơng mang gen thành viên Kết nghiên cứu xác định 5/5 người mẹ người lành mang gen bệnh, 16/33 thành viên nữ gia đình bệnh nhân người lành mang gen bệnh Kỹ thuật phân tích microsatellite - DNA hứa 61(11) 11.2019 hẹn phương pháp hữu hiệu để phát người lành mang gen bệnh DMD Việt Nam Kết luận Bằng kỹ thuật phân tích microsatellite - DNA, nghiên cứu phát 5/5 người mẹ 16/33 thành viên nữ phả hệ gia đình người lành mang gen bệnh DMD TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] J.K Mah, L Korngut, J Dykeman, et al (2014), “A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy”, Neuromuscul Disord., 24(6), pp.482-491 [2] C Barakat-Haddad, S Shin, H Candundo, et al (2017), “A systematic review of risk factors associated with muscular dystrophies”, NeuroToxicology, 61, pp.55-62 [3] J.M Ervasti (2013), Structure and Function of the DystrophinGlycoprotein Complex, Landes Bioscience [4] L Imbornoni, E.T Price, J Andrews, et al (2014), “Diagnostic and clinical characteristics of early-manifesting females with Duchenne or Becker muscular dystrophy”, Am J Med Genet A, 164A(11), pp.2769-2774 [5] D Duan (2015), “Duchenne muscular dystrophy gene therapy in the canine model”, Hum Gene Ther Clin Dev., 26(1), pp.57-69 [6] J.G Andrews, R.A Wahl (2018), “Duchenne and Becker muscular dystrophy in adolescents: current perspectives”, Adolesc Health Med Ther., 9, pp.53-63 [7] K.M Flanigan, D Dunn, A von Niederhausern, et al (2009), “Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort”, Hum Mutat., 30(12), pp.1657-1666 [8] K Bushby, R Finkel, D.J Birnkrant, et al (2010), “Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and pharmacological and psychosocial management”, Lancet Neurol., 9(1), pp.77-93 [9] Trần Vân Khánh, Trần Huy Thịnh, Đỗ Ngọc Hải (2016), “Xác định đột biến điểm bệnh nhân DMD kỹ thuật giải trình tự gen”, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 99(1), tr.1-7 [10] Trần Huy Thịnh, Trần Vân Khánh, Phạm Lê Anh Tuấn cộng (2015), “Ứng dụng kỹ thuật MLPA xác định đột biến gen dystrophin gây bệnh DMD/Becker”, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 96(4), tr.7 [11] L Bogue, H Peay, A Martin, et al (2016), “Knowledge of carrier status and barriers to testing among mothers of sons with Duchenne or Becker muscular dystrophy”, Neuromuscul Disord., 26(12), pp.860-864 [12] M.A Anaya-Segura, H Rangel-Villalobos, G Martínez-Cortés, et al (2016), “Serum levels of microRNA-206 and novel mini-STR assays for carrier detection in Duchenne muscular dystrophy”, Int J Mol Sci., 17(8), Doi:10.3390/ijms17081334 [13] M Okubo, N Minami, K Goto, et al (2016), “Genetic diagnosis of Duchenne/Becker muscular dystrophy using next-generation sequencing: validation analysis of DMD mutations”, J Hum Genet., 61(6), pp.483-489 [14] X Wei, Y Dai, P Yu, et al (2014), “Targeted next-generation sequencing as a comprehensive test for patients with and female carriers of DMD/BMD: a multi-population diagnostic study”, Eur J Hum Genet., 22(1), pp.110-118 61 ... MD1.phả lành mang gen bệnh kỹ thuật trực tiếp giải trình tự gen MLPA hoàn toàn trùng khớp với kết kỹ thuật gián tiếp phân tích microsatellite - DNA Xác định người lành mang gen bệnh DMD kỹ thuật. .. phân tích microsatellite - DNA Áp dụng quy trình xác định người lành mang gen bệnh kỹ thuật microsatellite - DNA cho thành viên nữ gia đình bệnh nhân DMD chưa xác định đột biến điểm bệnh nhân... kết kỹ thuật giải từ mẹ người gái nhận allele bệnh Xb(17 0-2 2 2-1 4 8-2 42) trình tự gen người lành mang gen bệnh, gái nhận allele bình thường X(16 4-2 2 6-1 4 4-2 46) người hồn tồn bình thường Kết xác định