XÁC ĐịNH NGƯờI LÀNH MANG GEN BệNH TRONG GIA ĐÌNH BệNH NHÂN β THALASSEMIA

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh thalassemia gây thiếu máu tan máu bệnh thường gặp trẻ em Việt Nam bệnh đơn gen phổ biến giới Bệnh có hai biểu bật thiếu máu ứ sắt thể Trẻ bị bệnh thalassemia thường chậm phát triển thể chất, chưa có phương pháp điều trị khỏi bệnh, chủ yếu điều trị triệu chứng suốt đời Tại Việt Nam, tỷ lệ người mang gen bệnh phân bố nước khác tùy địa phương, nhóm dân tộc Đặc biệt, tỷ lệ mang gen bệnh cao dân tộc người như: Mơng (25%), Catu (14%), Tày (11%), Pako (8.33%) [1] Theo thống kê, nước quản lý khoảng 20.000 bệnh nhân, trung bình năm có khoảng 2.000 trẻ sinh bị bệnh Tổ chức y tế giới WHO xác định thalassemia vấn đề sức khỏe nghiêm trọng khuyến cáo nước Đông Nam Á nên chọn thalassemia ưu tiên di truyền người β-thalassemia đột biến gen β-globin, nằm cánh ngắn NST 11, gây giảm tổng hợp chuỗi β- globin Cho đến nay, có khoảng 200 đột biến tìm thấy gen β-globin Ở người Việt Nam, theo nghiên cứu M.L Saovaros Svasti cộng năm 2002cho thấy có đột biến gây 95% trường hợp β-thalassemia [2] Dựa vào biểu lâm sàng, bệnh β-thalassemia chia làm thể chính: thể nhẹ, thể trung gian, thể nặng Bệnh nhân thể nặng hay gọi thể Cooley, đồng hợp tử dị hợp tử kép hai đột biến khác bị thiếu máu nặng, có chất lượng sống thấp Bệnh nhân thể nhẹ dị hợp tử với đột biến gen β-globin, người lành mang gen bệnh thường khơng có biểu lâm sàng, thể phát triển bình thường, có thiếu máu nhược sắc cơng thức máu Những người kết hôn truyền gen bệnh cho cái, nguồn phát tán gen bệnh chủ yếu cộng đồng Bệnh chưa có phương pháp điều trị triệt để, liệu pháp gen ghép tế bào nguồn có bước đầu thành cơng nhiên cách tốn lúc thực Bệnh β-Thalassemia chẩn đoán xác định dựa vào đặc điểm lâm sàng xét nghiệm huyết học Các xét nghiệm di truyền phân tử xác định đột biến gen β-globin điều kiện cần thiết để khẳng định rõ thể bệnh, phát người lành mang gen bệnh chẩn đoán trước sinh nhằm hạn chế thai nhi bị bệnh biện pháp thiết yếu hữu hiệu nhằm giảm tỷ lệ mắc bệnh cộng đồng Kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR sử dụng rộng rãi để phát đột biến gen gây bệnh β-thalassemia có độ xác cao, giá thành rẻ phức tạp Ở Việt Nam việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử labo khác để xác định đột biến gen bệnh lý di truyền ngày khuyến khích mở rộng để giúp ích cho cơng tác chẩn đốn phòng bệnh Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Xác định người lành mang gen bệnh gia đình bệnh nhân β-Thalassemia” thực với mục tiêu: Xác định người lành mang gen β-globin dị hợp tử thành viên gia đình bệnh nhân β-thalassemia Mơ tả số đặc điểm huyết học người lành mang gen bệnh Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MỘT SỐ HIỂU BIẾT CƠ BẢN VỀ HỒNG CẦU, HEMOGLOBIN VÀ BỆNH β-THALASSEMIA 1.1.1 Hồng cầu Hồng cầu tế bào không nhân, soi tươi giống đĩa lõm hai mặt, màu vàng rạ, phiến kính nhuộm giemmsa, thấy hồng cầu hình tròn, màu hồng, nhạt màu Kích thước hồng cầu: 7-7,5 micromet, dày 2,3 micromet Thể tích hồng cầu: 90-100m3 Đời sống trung bình hồng cầu: 100-120 ngày Nơi sản sinh hồng cầu: tủy xương Nơi phân hủyhồng cầu: hồng cầu già bị phân hủy chủ yếu lách, tủy xương gan Hàng ngày có khống 0,85-1% tổng số hồng cầu già bị phân hủy (tan máu sinh lý) tỉ lệ tương tự hồng cầu non sinh để thay Nhiệm vụ hồng cầu vận chuyển oxy tới tổ chức, mô, tế bào thể thơng qua vai trò huyết sắc tố hay hemoglobin viết tắt Hb chứa hồng cầu [3] 1.1.2 Hemoglobin bình thường Định nghĩa: Hemoglobin thành phần chủ yếu hồng cầu, phân tử protein có sắc tố hem làm cho hồng cầu có màu đỏ Hemoglobin có khả kết hợp phân ly với oxy CO2 để vận chuyển khí thể Mỗi cấu trúc hemoglobin bao gồm bốn tiểu đơn vị polypeptid liên kết với liên kết như: liên kết ion, liên kết hydro, tương tác kỵ nước, lực Van-der-waals sắc tố hem tiểu đơn vị Mỗi nhóm hem có chứa nguyên tử Sắt tích điện dương (Fe +2) liên kết thuận nghịch với phân tử oxy Lúc cấu trúc hình thái hemoglobin thay đổi để thích hợp với việc liên kết vận chuyển oxy đến khu vực khác thể Cấu trúc hemoglobin gồm phần: Phần globin phần hem Phần hem: Hem phần tạo nên màu đỏ hồng cầu, có cấu trúc chung cho nhiều lồi Hem có cấu tạo vòng protoporphyrin ngun tử sắt hóa trị 2(Fe+II) [5] Nhân protoporphyrin gồm vòng pyrol gắn với qua liên kết allyl (-CH=), chứa thành phần methyl (-CH3), vinyl (CH=CH2), propionic (-CH2-CH2-COOH) Nguyên tử sắt nằm trung tâm, nhờ hai liên kết chặt chẽ với hai nguyên tử nitơ hai liên kết giả với hai nguyên tử nitơ khác Hình 1.1 Mơ hình cấu trúc phân tử hemoglobin người trưởng thành -Cấu trúc bậc hemoglobin [nguồn: vtv.vn] Đây cấu trúc không gian ba chiều phân tử hemoglobin: phân tử α màu xanh ngọc, hai phân tử β màu đỏ, nhóm hem màu xanh Phần globin: Globin có chất protein Ở người, globin cấu tạo bốn chuỗi polypeptid, giống đôi Mỗi chuỗi polypeptid gắn với hem Vì phân tử hemoglobin có hai đơi chuỗi polypeptid bốn hem có khả vận chuyển bốn phân tử oxy [4] Trong trình phát triển thể, loại chuỗi polypeptid có chuyển đổi, loại thay loại giai đoạn sống, loại chuỗi polypeptid ký hiệu chữ Hy Lạp α, β, , δ Tùy loại chuỗi polypeptide mà định loại hemoglobin khác Các loại hemoglobin sinh lý Sự tổng hợp chuỗi polypeptid thành phần hemoglobin sinh lý thay đổi qua thời kỳ lứa tuổi khác [4], [5], [6] Hình 1.2 Các loại hemoglobin người [7] Như thời kỳ đầu bào thai, chuỗi polypeptid , α,  tổng hợp chủ yếu, chuỗi  tổng hợp sớm nhanh chóng Sau tháng thứ chuỗi α  tổng hợp cà HbF tồn chủ yếu như thành phần Hb chủ yếu bào thai Sau đẻ chuỗi  giảm nhanh chóng nhường chỗ cho chuỗi β Vì sau đẻ HbF giảm nhanh chóng, thay vào lượng HbA1 tăng lên Đến cuối năm thứ HbF dạng vết, HbA1 đạt cao 95% Chuỗi δ tổng hợp chủ yếu thời kỳ sau đẻ, với lượng tăng dần đến tuổi trưởng thành Ở người lớn thành phần Hb loại HbA (97-99%) HbA2 (1-3%) Ở giai đoạn cuối bào thai, huyết sắc tố F (α2γ2) chiếm khoảng 80% Ở trẻ sơ sinh, huyết sắc tố F chiếm tỉ lệ cao, tỷ lệ giảm dần thay huyết sắc tố A Bảng 1.1 Các chuỗi hemoglobin theo lứa tuổi [7] Hb sinh lý Cấu trúc Thời kỳ xuất Hb Porland globin 22 Hb Gower1 22 Thai 2-3 tuần, có tháng đầu thai HbGower 22 Xuất có Hb Gower1 HbF 22 Bào thai tuần, Hb chủ yếu thai nhi HbA2 22 Thai nhi gần đẻ, Hb người bình thường HbA1 22 Bào thai tuần, Hb chủ yếu người bình thường Phơi thai 2-3 tuần HbF chiếm ưu máu bào thai, có lực với oxy cao HbA, cho phép hồng cầu bào thai vận chuyển lượng oxy thích hợp điều kiện phân áp oxy thấp môi trường thai nhi Khi đứa bé đời, phổi trở thành quan trao đổi khí, HbA thay cho HbF Khi đứa trẻ tháng tuổi, thay hoàn tất [8], [9], [10] Các chuỗi polypeptid có cấu trúc từ acid amin xếp theo trình tự chặt chẽ, cấu trúc không gian (cấu trúc bậc III, IV) quan quan trọng đảm bảo chức vận chuyển khí hemoglobin Các chuỗi  có 141 acid amin, chuỗi α, β,  có 146 acid amin Sự điều hòa tổng hợp chuỗi polypeptid globin thực gen điều hòa (regulator gen), theo quy trình phức tạp, gen nằm nhiễm sắc thể khác Gen điều khiển tổng hợp chuỗi α (gọi tắt gen α) nằm nhánh ngắn đôi nhiễm sắc thể 16 Còn gen điều khiển tổng hợp chuỗi β nằm nhánh ngắn nhiễm sắc thể 11 (11p15.5) [11] 1.1.3 Phân loại bệnh hemoglobin Bệnh hemoglobin nhóm bệnh di truyền phổ biến loài người Những thay đổi bệnh lý phần lớn khu trú phần globin phân tử hemoglobin, gây nên nhóm bệnh gọi bệnh hemoglobin xếp thành hai nhóm:  Nhóm hemoglobin bất thường: thay đổi cấu trúc chuỗi polypeptid phần globin Sự thay đổi acid amin, gây nên biến đổi cấu trúc chuỗi polypeptid, từ làm thay đổi tính chất lý, hóa phân tử hemoglobin gây bệnh hemoglobin Ví dụ: Bệnh HbE (acid amin vị trí thứ 26 chuỗi β-globin glutamin bị thay lysine) [12]  Nhóm thalassemia: Do thay đổi số lượng chuỗi globin, thiếu hụt loại chuỗi globin hai loại α β Nếu thiếu hụt chuỗi β gọi β-thalassemia Nếu thiếu hụt chuỗi α gọi α- thalassemia Trường hợp hai chuỗi α β bị thiếu hụt bình thường gọi α //β thalassemia [13] Cơ chế bệnh sinh bệnh thalassemia: Năm 1944 Valentin Neel cho rằng: Thalassemia bệnh di truyền gen lặn nhiễm sắc thể thường Những thay đổi gen kiểm soát tổng hợp hemoglobin đột biến điểm, đứt đoạn, trao đổi đoạn dẫn đến thay đổi số lượng chất lượng chuỗi polypeptide globin Bệnh thalassemia nhóm nguyên nhân có thay đổi số lượng chuỗi globin.Trong bệnh thalassemia có tượng chung thiếu hụt loại chuỗi polypeptid phần globin, gây thừa tương đối tuyệt đối loại chuỗi Nếu thiếu hụt chuỗi β gọi bệnh βthalassemia, chuỗi β giảm chuỗi α nối với β bị giảm chuỗi α dư tăng nối với chuỗi δ chuỗi γ Còn thiếu hụt chuỗi α gọi bệnh αthalassemia, chuỗi α-globin giảm, β-globin tăng nối với globin lại Hiện tượng xảy mức độ khác phụ thuộc vào thể bệnh, song hậu trình: - Hiện tượng thứ nhất: giảm tổng hợp hemoglobin Quá trình bệnh lý thứ hậu trực tiếp việc thiếu hụt tổng hợp phần globin Vì thiếu loại chuỗi polypeptid mà việc tổng hợp globin bị giảm Biểu hồng cầu nhược sắc tăng sinh hồng cầu non tủy Ở thể nhẹ cân chuỗi α β khơng nặng nề hậu giảm tổng hợp hemoglobin biểu rõ rệt thalassemia Ở người dị hợp tử biểu chủ yếu hồng cầu nhỏ nhược sắc tăng sinh hồng cầu non tủy - Hiện tượng thứ 2: cân hai loại globin Hiện tượng hậu thứ hai việc thiếu hụt loại chuỗi globin Việc thiếu hụt loại chuỗi globin gây dư thừa loại Trong β-thalassemia thiếu hụt chuỗi β gây dư thừa chuỗi α globin Trong α-thalassemia thiếu hụt chuỗi α gây dư thừa chuỗi β globin Trong bệnh β-thalassemia , chuỗi α dư thừa tạo nên hạt tủa rơi xuống màng hồng cầu nguyên sinh chất hồng cầu trưởng thành hồng cầu non tủy Đối với hồng cầu máu ngoại vi hạt tủa làm cho màng hồng cầu độ mềm dẻo, hồng cầu trở thành tế bào cứng đờ nên khó vượt qua màng lọc lách Mặt khác hạt tủa màng hồng cầu làm cho màng tăng diện tích tiếp xúc dễ bị tác nhân oxy hóa phá hủy màng hồng cầu Các tủa làm cho tính thấm màng hồng cầu thay đổi gây nên kali bên tế bào huyết tương Những tác hại hạt tủa làm cho hồng cầu bị vỡ sớm gây nên tượng tan máu [14] Trong tủy xương hạt tủa gắn lên nguyên sinh chất, màng hồng cầu non làm cho hồng cầu non chết trước trưởng thành Điều làm tăng sinh mạnh hồng cầu non tủy, gây biến dạng xương, tăng hấp thu sắt gây nhiễm sắt thể Hiện tượng hồng cầu non bị chết sớm không đến giai đoạn trưởng thành gọi tượng sinh hồng cầu không hiệu chế chủ yếu gây biến đổi lâm sàng huyết học bệnh nhi β-thalassemia thể nặng 10 Gen thalassemia Giảm tổng hợp chuỗi globin (β hoăc α) Hồng cầu nhược sắc Thừa chuỗi tương ứng (β hoăc α) Thể vùi (Màng hồng cầu) Thể máu Vỡ hồng cầu Cục tiểu cầu Tăng tạo bilirubin Tăng hấp thụ sắt Tăng sinh máu Tăng sinh hệ liên võng Tắc vi mạch Ứ sắt - Gan lách to Chậm lớn nhiễm trùng - Loãng xương - Biến dạng mặt Vàng Sỏi da mật loét Hình 1.3 Cơ chế hình thành triệu chứng lâm sàng thalassemia [7] 12 Nguyễn Khắc Hân Hoan (2007) Chẩn đoán di truyền phân tử bệnh β- 13 Thalasemia bệnh viện Từ Dũ, 121-127 Lý Thanh Hà, Ngô Thị Phương Mai, Dương Bá Trực, Nguyễn Thanh Liêm cs (2009) Áp dụng kĩ thuật ARMS-PCR chẩn đoán trước sau sinh bệnh β-Thalassemia bệnh viện nhi Trung Ương 14 Tạp chí nhi khoa (3-4), 155-160 Bùi Văn Viên, Dương Bá Trực, Nguyễn Công Khanh (1999) Nhận xét bước đầu sở di truyền phân tử mối quan hệ kiểu gen với mức độ thiếu máu thể tích hồng cầu bệnh HbE/b Thalasemia 15 Tạp chí Nhi khoa, Modell B, B.V (1984), Cellular pathology, The clinical Approach to 16 thalassemia, Crune-stratton C.Dode, A.B., F Bourdillon et al (1987) Haemoglobin disorders among Southeast Asian refugees in France Acta Heamatology, 78, 135- 17 136 Cooley TB, L.P (1925), A series of cases of splenomegaly in children with anemia and peculiar bone changes Transactions of the American 18 Pediatric Society;37:29–30 Bạch Quốc Tuyên, P.N.T., Đặng Đức Quý, Nguyễn Đình Lượng (1974), “Một số trường hợp huyết sắc tố bình thường phát bệnh viện Bạch Mai”, Cơng trình nghiên cứu huyết học truyền máu 1963- 19 1974, Nxb Y học 1974, Hà Nội Nguyễn Khắc Hân Hoan cộng (2011) Tầm soát chẩn đoán trước sinh đột biến gen thalassemia, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 73(2), 1-7 20 Trần Danh Cường cộng (2013) Chẩn đoán trước sinh bệnh thiếu 21 máu huyết tán β-thalassemia Y học Việt Nam, tháng (1), 156 - 158 Qamar-ur-Nisa et al (2011) Frequency of thalassemia trait in pregnant woman, Medical Channel, Vol 17, No1, 56-59 22 Ching-Tien Peng et al (2013) Distribution of thalassemias and associated hemoglobinopathies identified by prenatal diagnosis in Taiwan, Blood Cells, Molecules and Diseases, 51, 138-141 23 Fucharoen S et al (1992) Thalassemia in SouthEast Asia: problems and trategy for prevention and control Southeast Asian Journal Tropical Medical Public Health, 23(4), 647-655 24 Phạm Thanh Loan cộng (2013) Phát đột biến gen gây bệnh β-thalassemia kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR Luận văn Thạc sỹ 25 Anchalee Thedsawad, Sumalee jindadamrongwech, Suporn Chuncharunee, Punnee Butthep (2012) Multiplex ARMS-PCR Analysis for Nineteen β-Thalasemia Mutation Journal of Hematology 26 and Tranfusion Medicine, 22, 1-38 Urvashi Bhardwaj, Yao-Hua Zhang, Fred Lorey, Linda L.McCabe, Edward R.B McCabe (2005) Molecular Genetic Confirmatory from Newborn Screening Samples for the Common African-American, Asian Indian, Southeast Asian, and Chinese β-Thalasemia Mutations American journal of Hematology, 78, 249-255 27 Shu-Rern Chern, C.-P.C.(2000) Melecular prenatal diagnosis of Thalasemia in Taiwan International journal of Gynecology and Obstetric, 103- 106 28 Colah, R., A Gorakshakar, and A Nadkarni (2010) Global burden, distribution and prevention of β-Thalassemias and hemoglobin E disorders Expert Rev Hematol, 3(1), 103-117 29 Winnichagoon P, Furachroen S, Wilairat P, Fukumaki Y (1995) Mechanism of Thalasemia in Southeast Asia Southeast Asian J Trop Med Public Health, 26, 235-240 30 Zhang JZ, Cai SP, He X, Lin X (1988) Molecular basis of βThalassemia in South Chi Na Strategy for DNA analysis Hum Genet, 78, 37- 40 31 Shanthimala de Siva, C.A.F., A Premawardhena, S P Lamabadusuriya, T E A Peto, Gayathri (2000) Thalasemia in Sri Lanka: implications for future health burden of Asian populations The Lancet, 355, 786-791 32 Dương Bá Trực (1997) Một số kiểu gen β-Thalassemia người miền Bắc, Hội nghị chuyên đề tiến Thalassemia (Bản dịch Dương Bá Trực), 36-42 33 Nguyễn Đắc Lai, L.T.S., Thái Quý, Bạch Quốc Tuyên (1985) Sự lưu hành bệnh huyết sắc tố số dân tộc người miền Bắc miền Trung Việt Nam Y học Việt Nam, 16 - 21 34 Newton, C.R., et al (1989) Analysis of any point mutation in DNA The amplification refractory mutation system (ARMS) Nucleic Acids Res, 17(7), 2503-2516 35 Nguyễn Anh Trí, Nguyễn Thị Thu Hà (2010) Cập nhật chẩn đoán điều trị Thalasemia”, “Những ứng dụng di truyền sinh học phân tử số bệnh lý huyết học” Một số chuyên đề huyết học truyền 36 máu,(tập 3), Nhà xuất Y học, 203-212, 242-258 C., B.E (1982) Huyết sắc tố bệnh huyết sắc tố, Huyết học (tài liệu dịch Viện Huyết học truyền máu), Nxb Harwal, 125-138 37 Won, E.J., et al (2013) Amplification refractory mutation system-PCR is essential for the detection of chimaeras with a minor allele population: a case report J Clin Pathol 38 Old, J.M (2003) Screening and genetic diagnosis of haemoglobin disorders Blood Rev, 17(1), 43-53 39 Nguyễn Công Khanh, Dương Bá Trực, Lý Tuyết Minh, Lương Công Sĩ (1987) Sự lưu hành bệnh sắc tố số người dân tộc miền Bắc”, Y học Việt Nam, 4, 9-15 40 Nguyễn Công Khanh (1985) Một số đặc điểm lâm sàng huyết học bệnh β-Thalasemia người Việt Nam, Luận án Phó tiến sỹ khoa học Y dược, Trường Đại học Y Hà Nội 41 Filon D, Oppenheim A, Rachmilewitz EA, Kot R, Ba Truc D (2000) Molecular analysis of β-Thalasemia in Viet Nam Hemoglobin, 24, 99- 104 42 Eldor, A., et al (1993) A chronic hypercoagulable state and life-long platelet activation in β-Thalasemia major Southeast Asian J Trop Med Public Health, 24(1), 92-95 43 Tạ Thành Văn (2010) PCR số kỹ thuật sinh học phân tử, Nhà xuất y học, 28-119 44 Đỗ Trung Phấn (2013) Kỹ thuật xét nghiệm huyết học truyền máu ứng dụng lâm sàng Nhà xuất y học, tr352 45 Phạm Quang Vinh “Thiếu máu thiếu máu thiếu sắt” Bài giảng 46 huyết học truyền máu, 6, tr 82 B.Y Tế, (1975) Hằng số sinh học người Việt Nam, Nxb Y học Hà Nội PHỤ LỤC Quy trình tách chiết DNA từ máu toàn phần (phương pháp phenolchloroform)[18]  Thiết bị  Ống Eppendorf 1,5ml  Máy lắc  Máy ly tâm  Hóa chất  Các dung dịch đệm phosphat (PBS) pH: 7,4  Dung dịch phá vỡ hồng cầu RBC  Proteinase K  Phenol Chloroform Isoamyl(25:24:1)  Chloroform Isoamyl (24:1)  Ethanol 100% lạnh ethanol 0% lạnh  Giấy thấm  Dung dịch tách triết DNA khuôn mẫu: TE (Tris-EDTA)  Giấy thấm  Nước cất  Quy trình Bước 1: Phá vỡ hồng cầu  Cho vào ống Eppendorf 1,5ml:  0,5ml máu toàn phần  1ml dung dịch lysis buffer RBC  Invert (không votex)→để phút nhiệt độ phòng  Invert tiếp → ly tâm 4000v/phút/5’/4◦C  Bỏ dịch nổi, thu cặn  Lặp lại lần đến thu cặn trắng Bước 2: Phá vỡ bạch cầu  Cho tiếp vào ống Eppendorf 1ml dung dịch PBS  Invert → ly tâm 4000v/phút/5’/4◦C → bỏ dịch nổi, thu cặn  Cho tiếp vào ống:  600 μl dung dịch lysis buffer HD  15 μl proteinase K  μl Mecapto Ethanol 0,2%  Ủ 56◦C/1h (tan hết cặn) Bước 3: Tủa DNA  Cho thêm vào ống Eppendorf 500l μl dung dịch P:C:I(25:24:1)  Votex→ly tâm 15000v/p/10’/4◦C→dịch ống chia phân chia thành lớp→ thu dịch suốt lớp chứa DNA cho sang ống Eppendorf mới, bỏ lớp dịch phía  Cho thêm 500 μl dung dịch C:I (24:1)  Votex→ly tâm→15000v/p/10’/4◦C→thu dịch suốt lớp chứa DNA cho sang ống Eppendorf mới, bỏ lớp dịch phía  Cho thêm vào ống:  2,5V ethanol 100%  0,1V sodiumacetat 3M  Lắc đều, ủ qua đêm -20◦C  Sáng hôm sau:  Ly tâm 15000v/p/20’/4◦C→thu tủa, bỏ dịch  Cho thêm 1ml Ethanol 70%→ly tâm 15000v/p/20’/4◦C  Lặp lại lần  Thu tủa, bỏ dịch → để khơ tự nhiên→hòa tan tủa nước cất lần đệm TE Bước 4: Kiểm tra nồng độ độ tinh sản phẩm tách chiết DNA phương pháp đo mật độ quang máy Nano Drop bước sóng 260/280 (độ tinh khoảng 1,8-2,0 đạt yêu cầu  Bảo quản: Ở 4◦C thời gian ngắn; -20◦C thời gian dài Quy trình kỹ thuật ARMS PCR [18], [24]  Thiết bị  Máy ly tâm loại nhỏ  Máy PCR  Bể điện di  Hóa chất  Các cặp mồi (Primers)  DNA khuôn mẫu: TE (Tris-EDTA)  GoldTaq  Nước cất lần  Đệm tra mẫu: Gel Loading Buffer  Thạch điện di (electrophoresis agarose)  Dung dịch đệm điện di TAE  Ethidium bromide  Thang chuẩn DNA (DNA ladder)  Marker  Quy trình  Bổ sung hóa chất vào ống eppendorf 0.2ml  Nước cất lần  GoldTaq  Mồi chung  DNA khuôn  Các cặp mồi đặc hiệu với loại đột biến(mồi Wild Type mồi Mutant)  Tỷ lệ thành phần thiết kế để phản ứng xảy tối ưu nhất, tổng thể tích 20 μl  Sử dụng đầu pipet cho loại dung dịch nhỏ vào vị trí khác thành ống  Sau mix thành phần ống→ly tâm giây  Đặt ống PCR vào máy PCR, tạo chu trình nhiệt  Lấy ống khỏi máy PCR  Dùng μl sản phẩm PCR để chạy điện di gel agarose sử dụng thang chuẩn DNA phù hợp với kích thước gen đích  Phân tích kết dựa kích thước đoạn DNA biết trước, so sánh kết điện di với thang chuẩn DNA để biết đột biến thuộc loại Quy trình kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR  Thiết bị  Ống eppendorf 1,5ml  Thiết bị đốt nóng bể điều nhiệt  Vật liệu hóa chất  Ni tơ lỏng đá khô  DNA khuôn tinh chế  Mồi  Dung dịch đệm giải trình tự  Quy trình  Tinh chế sản phẩm PCR  Trộn 0,1-0,5μg DNA khuôn tinh chế với pmol mồi μl nước  đốt nóng 100C phút Chuyển sang nitơ lỏng đá khô phút để đông đá  Để tan nhiệt độ phòng, thêm 2μl đệm giải trình tự 10x để nhiệt độ phòng 20 phút để mồi gắn vào DNA khuôn  Tiến hành phản ứng giải trình tự theo dẫn nhà sản xuất máy  Phân tích kết MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MỘT SỐ HIỂU BIẾT CƠ BẢN VỀ HỒNG CẦU, HEMOGLOBIN VÀ BỆNH β-THALASSEMIA .3 1.1.1 Hồng cầu 1.1.2 Hemoglobin bình thường 1.1.3 Phân loại bệnh hemoglobin 1.1.4 Hậu bệnh thalassemia 11 1.1.5 Bệnh β-thalassemia 11 1.1.6 Chẩn đoán điều trị bệnh β-thalassemia 18 1.2 DI TRUYỀN HỌC BỆNH β-THALASSEMIA 21 1.3 GEN MÃ HÓA VÀ ĐỘT BIẾN GEN Β-GLOBIN GÂY BỆNH βTHALASSEMIA 23 1.3.1 Vị trí cấu trúc gen HBB .23 1.3.2 Các đột biến gây bệnh 25 1.4 MỘT SỐ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN .28 1.4.1 Kỹ thuật PCR 29 1.4.2 Kỹ thuật ARMS .31 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 33 2.1.1 Nhóm đối chứng 33 2.1.2 Nhóm nghiên cứu 33 2.2 DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 33 2.2.1 Dụng cụ máy móc .33 2.2.2 Hóa chất 34 2.3 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 35 2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .35 2.4.1 Mơ hình nghiên cứu .35 2.4.2 Nội dung nghiên cứu 36 2.5 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ .39 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 40 3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN DỊ HỢP TỬ GEN β-GLOBIN Ở NHÓM NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH BẰNG KỸ THUẬT ARMS PCR 40 3.1.1 Kết tách chiết DNA 40 3.1.2 Kết phát người lành mang gen bệnh kỹ thuật ARMS-PCR 41 3.1.3 Kết kiểm tra kỹ thuật giải trình tự gen .45 3.1.4 Tỷ lệ phát người lành mang gen bệnh kỹ thuật ARMS-PCR 48 3.1.5 Kết tỷ lệ phát người lành mang gen bệnh 51 3.2 MÔ TẢ ĐẶC ĐIỂM HUYẾT HỌC CỦA NHÓM NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH QUA CÁC CHỈ SỐ HUYẾT HỌC 52 3.2.1 Mơ tả mức độ thiếu máu nhóm người lành mang gen bệnh 52 3.2.2 Mô tả đặc điểm số huyết học dạng đột biến nhóm người lành mang gen bệnh 53 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 55 4.1 Về kết xác định đột biến gen kỹ thuật ARMS-PCR 55 4.2 Về kết xác định người lành mang gen bệnh 57 4.3 Về phân tích phả hệ .57 4.4 Về mô tả đặc điểm huyết học nhóm người lành mang gen bệnh qua số huyết học 58 KẾT LUẬN 61 KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các chuỗi hemoglobin theo lứa tuổi Bảng 1.2 Kiểu gen bố mẹ tỉ lệ bị bệnh hệ 22 Bảng 1.3 Một số kiểu đột biến gây β0, β+-thalassemia vàcác biến thể hemoglobin .26 Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu 38 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng ARMS-PCR xác định người mang gen bệnh 39 Bảng 3.1 Kết đo nồng độ độ tinh DNA .40 Bảng 3.2 Kết tỉ lệ dạng đột biến phát được nhóm người lành mang gen bệnh .50 Bảng 3.3 Tỷ lệ người lành mang gen bệnh nhóm bố mẹ 51 Bảng 3.4 Tỷ lệ người lành mang gen bệnh nhóm anh chị em ruột .51 Bảng 3.5 Mô tả mức độ thiếu máu dạng đột biến .52 Bảng 3.6 Mô tả đặc điểm số huyết học dạng đột biến .53 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ phát đột biến kỹ thuật ARMS-PCR 49 Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ dạng đột biến phát nhóm người lành mang gen bệnh 50 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Mơ hình cấu trúc phân tử hemoglobin người trưởng thành Cấu trúc bậc hemoglobin Hình 1.2 Các loại hemoglobin người .5 Hình 1.3 Cơ chế hình thành triệu chứng lâm sàng thalassemia .10 Hình 1.4 Bệnh nhân β-thalassemia với biểu biến dạng xương 19 Hình 1.5 Hồng cầu máu ngoại vi bệnh nhân thalassemia 20 Hình 1.6 Sơ đồ chế di truyền bệnh β-thalassemia bố mẹ mang gen dị hợp tử với đột biến 22 Hình 1.7 Mơ hình cấu trúc gen HBB 23 Hình 1.8 Quá trình tổng hợp phân tử β-globin gen HBB 25 Hình 1.9 Minh họa chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 30 Hình 1.10 Minh họa kỹ thuật ARMS-PCR 31 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu phát người lành mang gen bệnh β-thalassemia 35 Hình 2.2: Minh họa mồi vị trí gắn gen β-globin sử dụng ARMS-PCR 37 Hình 3.1 Hình ảnh điện di DNA tổng số mẫu phả hệ 03: β.49, β.50 phả hệ 04: β.114, β.115, β.116, β117 .41 Hình 3.2 Kết phát người lành mang gen bệnh phả hệ 22 mang đột biến đồng hợp tử Cd 17A>T .42 Hình 3.3 Kết phát người lành mang gen bệnh phả hệ 16 mang đột biến dị hợp tử kép Cd 17A>T//cd41/42(-TCTT) 44 Hình 3.4 Kết giải trình tự sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen A) Cd17A B)Cd41/42 (TCTT) 46 Hình 3.5 Kết giải trình tự phát người lành mang gen bệnh Cd41/42 (-TCTT) .47 Hình 3.6 Kết giải trình tự phát người lành mang gen bệnh Cd41/42 (-TCTT) tương ứng với trình tự acid amin thay đổi theo vị trí đột biến 48 ... đình bệnh nhân β- Thalassemia thực với mục tiêu: Xác định người lành mang gen β- globin dị hợp tử thành viên gia đình bệnh nhân β- thalassemia Mô tả số đặc điểm huyết học người lành mang gen bệnh 3... để xác định đột biến gen bệnh lý di truyền ngày khuyến khích mở rộng để giúp ích cho cơng tác chẩn đốn phòng bệnh Xuất phát từ thực tế trên, đề tài Xác định người lành mang gen bệnh gia đình bệnh. .. đột biến gen β- globin người lành mang gen, thành viên gia đình bệnh nhân Với kiểu đột biến đa dạng phong phú gen β- globin việc xây dựng quy trình phát người lành mang gen bệnh, chẩn đoán trước