Kỹ thuật sắc ký khí - khối phổ (gas chromatography/ mass spectrometry: GC/MS) được áp dụng rất hiệu quả trong chẩn đoán rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid trên thế giới nhưng chưa được triển khai tại Việt Nam. Nghiên cứu này nhằm ứng dụng và thẩm định phương pháp định lượng steroid niệu bằng kỹ thuật GC/MS tại Việt Nam.
Trang 1THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG STEROID NIỆU
BẰNGKỸ THUẬT SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ
Trần Thị Ngọc Anh * , Trần Thị Chi Mai **,*** , Trần Minh Điển***
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Kỹ thuật sắc ký khí - khối phổ (gas chromatography/ mass spectrometry: GC/MS) được áp dụng
rất hiệu quả trong chẩn đoán rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid trên thế giới nhưng chưa được triển khai tại Việt Nam Nghiên cứu này nhằm ứng dụng và thẩm định phương pháp định lượng steroid niệu bằng kỹ thuậtGC/MS tại Việt Nam
Phương pháp: Các steroid niệu được thủy phân nhờ enzym glucuronidase và arylsulphatase, tách chiết
rồi tạo dẫn xuất với methoxyamin và trimethylsilylimmidazol (TMSI), phân tách và định lượng các steroid trên máy GC/MS
Kết quả:Độ chính xác ngắn hạn CV đạt 1,01-7,72(%) ở mẫu nước tiểu bình thường và 0,78-9,2(%) ở mẫu
bệnh lý Độ chính xác dài hạn CV đạt 10,16-14,53(%) ở mẫu bình thường và 12,51-16,95(%) ở mẫu bệnh lý Giới hạn định lượng 0,05 - 0,16(μmol/L) ở phần lớn các sản phẩm chuyển hóa steroid Độ thu hồi của các sản phẩm chuyển hoá steroid đạt 90-115(%)
Kết luận: Quy trình kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS xây dựng được là chính xác và xác thực,
có thể sử dụng để chẩn đoán và theo dõi điều trị một số rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid
Từ khóa: steroid niệu, sắc ký khí khối phổ, rối loạn tổng hợp steroid, thẩm định phương pháp
ABSTRACT
VALIDATION OF URINE STEROID PROFILING BY GAS CHROMATOGRAPHY/MASS
SPECTROMETRY
Tran Thi Ngoc Anh, Tran Thi Chi Mai, Tran Minh Dien
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 21 - No 3 - 2017: 73 - 78
Backgrounds: This study aimed to develop and validate the urinary steroid profiling by gas
chromatography/mass spectrometry (GC/MS)
Methods: The urine samples are subjected to enzyme hydrolysis using β-glucuronidase/ arylsulfatase The
unconjugated steroids are extracted, derivatized using methoxyamine and trimethylsilylimmidazol (TMSI) The derivatives were separated and quantified on GCMS
Results: The short-term imprecision were 1.01-7.72(%) and 0.78-9.2(%) for the pooled normal urine and
pooled abnormal urine respectively, the long-term imprecision were10.16-14.54(%) and 12.51-16.95(%) for the pooled normal urine and pooled abnormal urine respectively The limits of quantitation were 0.05-0.16 (μmol/L) for most of steroid metabolites except α-Cortol The recovery percentages ranged from 90% to 115(%)
Conclusions: This method was accurate, precise and can be applied to the routine diagnosis and treatment
monitoring of patients with congenital adrenal hyperplasia due to various enzyme defects
Keys words: urinary steroids, GC/MS, abnormal steroidogenesis, method validation
* Bệnh viện HN Việt Đức, ** Trường ĐH Y Hà nội, *** Bệnh viện Nhi trung ương
Tác giả liên lạc: BS Trần Thị Ngọc Anh ĐT: 0904395444 Email: ngocanhbm@gmail.com
Trang 2ĐẶT VẤN ĐỀ
Định lượng các sản phẩm chuyển hoá của
steroid trong nước tiểu bằng sắc ký khí khối phổ
được sử dụng như một tiêu chuẩn vàng trong
chẩn đoán nhiều rối loạn sinh tổng hợp và
chuyển hoá hormon steroid(4) Kỹ thuật phân tích
steroid niệu bằng GC/MS đặc biệt phù hợp với
trẻ em vì mẫu nước tiểu không thâm nhập và có
độ nhạy, độ đặc hiệu cao(2) Phân tích steroid
niệu bằng GC/MS đã được xem như công cụ
dùng để chẩn đoán xác định tăng sản thượng
thận bẩm sinh (TSTTBS) từ hơn 35 năm qua
GC/MS dùng trong chẩn đoán các rối loạn sinh
tổng hợp và chuyển hóa hormon steroid bẩm
sinh(1,2,3), và được dùng trong chẩn đoán và theo
dõi các bệnh lý mắc phải của tuyến vỏ thượng
thận nhưkhối u lành tính hoặc ác tính, hội chứng
Cushing…(5,6) Hiện tại, ở Việt Nam các trường
hợp nghi ngờ TSTTBS được chẩn đoánsơ bộ dựa
trên xét nghiệm định lượng 17 hydroxy
Progesterone trong máu (17-OHP) bằng phương
pháp miễn dịch gắn enzyme (ELISA) Kỹ thuật
nàykhông thể loại bỏ hết phản ứng chéo và các
yếu tố nhiễu đặc biệt ở trẻ sơ sinh(4) Định lượng
17 OH Progesterone không xác định chính xác
nguyên nhân rối loạn tổng hợp steroid như thiếu
hụt enzyme 21-hydroxylase, 11β-hydroxylase,
17α -hydroxylase, 20-22 desmolase, 3 β-
hydroxysteroid dehydrogenase và 5α-reductase
nhưng GC/MS có thể chẩn đoán được nguyên
nhân này(7) Những ca bệnh khó thường phải gửi
mẫu phân tích ở nước ngoài nên cần nhiều thời
gian và kinh phí Việc áp dụng và triển khai kỹ
thuật phân tích định lượng steroid niệu bằng
GC/MS tại Việt Nàm là nhu cầu cần thiết và cấp
bách Vì vậy, đề tài này được tiến hành nhằm
mục tiêuxây dựng và thẩm định quy trình định
lượng steroid niệu bằng phương pháp sắc ký
khối phổ tại khoa Hóa sinh – Bệnh viện Nhi
Trung ương
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trang thiết bị và chất liệu nghiên cứu
Máy GC/MS (GC 7890A- MS 5975C) của
Agilent Cột sắc ký HP-5MSkích thước 30m x 0,25mm x 0,25 µm (Agilent)
Hoá chất: Chuẩn steroid của SKML, các steroid tinh khiếtvà chuẩn nội Androstanol của hãng Sigma Aldrich, enzymeglucuronidase/ sulphatase của hãngKura Biotec (Chi lê)
Trimethylsilylimmidazol (TMSI), hóa chất cần thiết khác của Merck đều có độ tinh khiết ở mức phân tích
Cột Bond Elut C18 của Agilent và các trang thiết bị khác cho phòng xét nghiệm như máy ly tâm, tủ lạnh, tủ sấy, thiết bị làm khô sử dụng khí
ni tơ…
Bệnh phẩm: Mẫu nước tiểu bình thường
được thu thập từ nước tiểu ngẫu nhiên của 10người bình thường không mắc bệnh lý tuyến thượng thận và mẫu nước tiểu bệnh lý được thu thập từ mẫu nước tiểu ngẫu nhiên của 10 bệnh nhân đã chẩn đoán và điều trị tăng sản thượng thận bẩm sinhtại khoa Nội tiết-chuyển hóa –di truyền.Mẫu được bảo quản ở -200C đến khi phân tích
Phương pháp nghiên cứu
Quy trình định lượng steroid niệu bằng kỹ thuật GC/MS
Chuẩn bị mẫu: Thủy phân các steroid liên
hợp trong mẫu nước tiểu cần phân tích bằng enzyme β-glucuronidase/ arylsulfatase ở 370C qua đêm Các steroid tự do được chiết tách bằng cột Bond- Elut C18 Sau đó tiến hành tạo dẫn xuất: đầu tiên là với methoxyamin ủ 1,5
±0,5 giờ ở 80oC, sau đó thêm TMSI và ủ 3,5 ± 0,5 giờ ở 110oC để tạo dẫn xuất silyl với tất cả các nhóm –OH Steroid được chiết tách bằng iso-octan và mẫu thu được dùng để phân tích trên hệ thống GC/MS
Phân tích trên GC/MS được tiến hành trên
GC 7890A – MS 5975C (Agilent), cột sắc ký HP- 5MS 30m x 0,25 mm id x 0,25 µm film thickness (Agilent) Mẫu được bơm bằng bộ bơm mẫu tự động Agilent 7693 Chương trình nhiệt độ lò từ 180oC đến 300oC trong vòng 30
Trang 3phút Tốc độ khí Heli qua cột là 1 ml/ phút
Các steroid rửa giải được phát hiện bằng phổ
khối theo phương pháp SIM (selected ion
monitoring) Các ion đặc hiệu cho mỗi steroid
được lựa chọn để xác định và định lượng mỗi
sản phẩm chuyển hóa steroid
Đường chuẩn được xây dựng bằng cách
chạy hỗn hợp chất chuẩn chứa một lượng các
steroid chuẩn đã biết và chuẩn nội Chuẩn được
phân tích trên GC/MS mỗi khi chạy mẫu thử
Sau khi đường chuẩn được thiết lập cho mỗi
steroid cần đo lường, định lượng các steroid
trong mẫu thử bằng phần mềm Chemstation Sử
dụng chuẩn nội để hiệu chỉnh sự mất mát trong
quá trình chuẩn bị mẫu
Các thực nghiệm thẩm định quy trình kỹ thuật
Dựa theo các hướng dẫn của Westgard(9)
bao gồm:
- Xác định độ chính xác: Xác định độ lặp lại
trong một lần chạy (độ chính xác ngắn hạn):
phân tích hai mẫu nước tiểu bình thường và
bệnh lý lặp lại 20 lần trong một mẻ chạy Xác
định độ tái lặp giữa các lần chạy (độ chính xác
dài hạn): phân tích mẫu nước tiểu bình thường
và bệnh lý lặp lại trong 20 lần phân tích khác
nhau (20 mẻ) Thu thập số liệu tính giá trị trung
bình, độ lệch chuẩn, CV% để đánh giá độ chính
xác ngắn hạn và dài hạn
- Xác định giới hạn định lượng: Tiến hành
pha loãngmẫu chuẩn steroid2, 4, 8, 16và 32 lần Mỗi mẫu được đo lặp lại 7 lần trong một lần phân tích Thu thập số liệu, tính giá trị trung bình, SD, CV% và xác định giới hạn định lượng cho từng chất
- Xác định độ thu hồi: Sử dụng nước tiểu
bình thường chia làm 2 mẫux 2ml, mẫu 1 thêm 0,1 ml dung dịch chuẩn Mẫu 2thêm0,1 ml nước cất Tiến hành phân tích steroid niệu bằng GC/MS ở hai mẫu trên Độ thu hồi tương đối được tính dựa vào lượng mẫu chuẩn thêm vào
đã biết so với mẫu nước cất với nồng độ sản phẩm chuyển hóa đo được trong mẫu phân tích giữa hai mẫu trên
Các vật liệu ngoại kiểm steroid được phân tích đồng thời để so sánh với giá trị trung vị và
độ lệch chuẩn của tất cả các phòng xét nghiệm tham gia chương trình ngoại kiểm giúp so sánh phương pháp, đánh giá độ đúng của phương pháp
KẾT QUẢ Thông số SIM
11 sản phẩm chuyển hoá steroid được trình bày theo thứ tự xuất hiện trên sắc ký đồ theo trình tự thời gian lưu tăng dần Chương trình chạy sắc ký 30 phút/mẫu
Bảng 1: Thông số thời gian lưu, ion định lượng, ion đích
(phút)
Ion định lượng (m/z)
Ion đích (m/z)
Trang 4Kết quả sắc ký đồ (hình 1) cho thấy nội
chuẩn A1 (Androstanol) có thời gian lưu là
13,44 phút Mỗi steroid tương ứng với một
đỉnh, 11 steroid trình bày trong bài báogồm:
1-Androsterone (A), 2-Etiocholanolone (E),
3-Prengandiol (PD), 4-Pregnantriol (PT),
6-Tetrahydrocortisol (THF), 7-Allo tetrahydrocortisol (Allo-THF), 8-α-Cortolone, 9- β-Cortol, 10-β-Cortolone, 11-α-Cortol
Hình 1: Sắc ký đồ tổng số của mẫu chuẩn phân tích
Độ chính xác của phương pháp
Bảng 2: Độ chính xác ngắn hạn của phương pháp
Nhận xét: độ chính xác ngắn hạn của các
steroid có CV từ 1,01 - 7,72(%) ở mẫu mẫu nước
tiểu bình thường và CVtừ 0,78- 9,2(%) ở mẫu
nước tiểu bệnh lý Giá trị trung bình ± SD của CV
ở mẫu bình thường là4,0 ± 2,2(%) và mẫu bệnh lý
là 4,7 ± 2,7(%) (X ± SD)
Nhận xét (bảng 3): Độ chính xác dài hạn của
các steroid có CV 10,16 - 14,53(%) ở mẫu nước tiểu bình thường và 12,51 – 16,95(%) ở mẫu nước tiểu bệnh lý.Giá trị trung bình± SD của CV ở mẫu bình thường là 12,85 ± 1,24(%) và mẫu bệnh
lý là 14,86± 1,4 (%) (X ± SD)
Trang 5Bảng 3: Độ chính xác dài hạn của phương pháp
Độ thu hồi của phương pháp
Bảng 4: Độ thu hồi của phương pháp
Sản phẩm
chuyển hóa
Lượng thu hồi μmol/L
Lượng thêm vào μmol/L
% thu hồi
Nhận xét: Độ thu hồi các sản phẩm chuyển
hóa steroid niệu từ 90% đến 115% Trung bình là
101,9 ± 8,4% (X ± SD)
Bảng 5: Giới hạn định lượng của phương pháp
Sản phẩm
chuyển hóa
Giới hạn định lượng (μmol/L)
CV(%)
Nhận xét: Giới hạn định lượng của phần lớn
các chất từ 0,05 đến 0,16(µmol/L), riêng
α-Cortol là 0,27(µmol/L)
BÀN LUẬN
Phân tích steroid niệu giúp chẩn đoán bệnh
lý rối loạn sinh tổng hợp và chuyển hóa hormon steroid được thực hiện từ những năm 1960(4) Tuy nhiên, kỹ thuật sắc ký khí khối phổ sử dụng ion chọn lọc (GC/MS-SIM) được sử dụng những năm gần đây nhằm phân tích các sản phẩm chuyển hóa của hormon steroid và tiền chất của các hormon đó Rất nhiều sản phẩm chuyển hóa của hormon và tiền chất trong nước tiểu được phát hiện, đến nay có hơn 100 sản phẩm được công bố Tuy nhiên, chỉ có một số sản phẩm chuyển hóa quan trọng cần được định lượng nhằm chẩn đoán các nhóm bệnh lý rối loạn chuyển hóa steroid riêng biệt Quy trình định lượng steroid niệu khác nhau tùy theo từng tác giả đã công bố về cách thức tiến hành, thời gian
và nhiệt độ tạo dẫn xuất(1,2,6,8) Chúng tôi đã thực hiện và thay đổi các điều kiện sao cho phù hợp với phòng xét nghiệm để đạt được kết quả tốt nhất.Quy trình sau khi xác định là phù hợp được tiến hành thẩm định: xác định độ chính xác, giới hạn định lượng và độthu hồi nhằm đánh giá sai
số ngẫu nhiên và sai số hệ thống
Bảng 1 cho thấy các sản phẩm chuyển hóa steroid được định lượng có giá trị CV trong một lần chạy 1,01-7,72 (%) ở mẫu nước tiểu bình thường và 0,78-9,2(%) ở mẫu bệnh lý Trong khi
ở bảng 2 cho thấy CV đạt 10,16-14,53 (%) và 12,51-16,95 (%) ở mẫu bình thường và bệnh lý
Trang 6tương ứng khi thực hiện ở 20 lần chạy khác
nhau Theo tác giả Angel O.K Chan, khi xây
dựng giá trị tham chiếu steroid niệu bằng
GC/MS tại Hồng Kông đã công bố độ chính xác
trong một lần chạy và giữa các lần chạy là
1,3-11,9(%) và 1,3-13,3(%)(2) Keiko Homma công bố
độ lặp lại trong một lần chạy ở mẫu nước tiểu
tổng hợp là 11 ± 6%(3) Như vậy độ chính xác
trong một lần chạy là tương tự độ lặp lại trong
nghiên cứu của Angel và tốt hơn của Homma
Độ chính xác qua nhiều lần chạy trong nghiên
cứu này không được tốt bằng nghiên cứu của
Angel Tuy nhiên, so với tiêu chuẩn về độ chính
xác chấp nhận được cho kỹ thuật phân tích
steroid niệu là CV ≤ 25% thì độ chính xác của
phương pháp được thẩm định trong nghiên cứu
này hoàn toàn có thể chấp nhận được(4)
Bảng 3 cho thấy tỷ lệ % độ thu hồi tương đối
của các sản phẩm chuyển hóa steroid niệu trong
khoảng 90-115 (%) Tác giả Keiko Homma khi
tiến hành xây dựng giá trị tham chiếu cho trẻ sơ
sinh tại Nhật Bản công bố công bố tỷ lệ thu hồi
các sản phẩm steroid niệu là 103 ± 12(%)tương tự
kết quả của chúng tôi 101,9 ± 8,4(%)(3)
Bảng 4 cho thấy giới hạn định lượng của các
sản phẩm chuyển hóa steroid niệu là rất tốt với
phần lớn các chất, giới hạn này thấp hơn
0,16µmol/L với các chất aldosterone,
etiocholanolone, pregnandiol, pregnantriol,
tetrahydrocortisone và tetrahydrocortisol,
cortolone Riêng α-Cortol có giới hạn định lượng
là 0,27µmol/L Giới hạn định lượng này cho
phép xác định các sản phẩm chuyển hóa steroid
niệu chính xác ngay cả với mẫu nước tiểu trẻ sơ
sinh rất loãng
Kết quả ngoại kiểm chỉ mới được thực hiện
từ tháng 4/2016, đến nay có 4 kết quả phản hồi
nên chưa đủ dữ liệu để tiến hành so sánh, đánh
giá độ xác thực của phương pháp(8) Tuy vậy, kết
quả độ thu hồi có thể sử dụng như một phương
pháp thay thế để đánh giá độ xác thực của
phương pháp khi chưa thể thực hiện so sánh
phương pháp (4)
KẾT LUẬN
Các thực nghiệm thẩm định quy trình kỹ thuật định lượng các sản phẩm chuyển hóa steroid niệu bằng sắc ký khí khối phổ cho thấy phương pháp được thực hiện có kết quả chính xác và xác thực, có thể sử dụng trong chẩn đoán và theo dõi điều trị các rối loạn chuyển hoá và sinh tổng hợp steroid
Lời cảm ơn: Chúng tôi xin cảm ơn TS Ronda Greaaves đã
hỗ trợ kỹ thuật, APFCB đã cung cấp kinh phí cho việc thực hiện đề tài, Ban Giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương đã cho phép triển khai đề tài
TÀI LIỆU THAM KHẢO
diagnosis of congenital adrenal hyperplasia in the newborn by Gas Chromatography/Mass Spectrometry analysis of random
urine specimens The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 87, pp 3682-3690
diagnosis of congenital adrenal hyperplasia and disorders of sex development: Experience of a urinary steroid referral centre
in Hong Kong Clinical Biochemistry 46: pp 327-334
Wantanabe K et al (2003) Reference values for urinary steroids
in Japanese newborn infants: Gas chromatography/Mass
spectrometry in selected ion monitoring, Endocrine Journal, 50:
pp 783-792
32-44
spectrometry (GC/MS) remains a preeminent discovery tool in clinical steroid investigations even in the era of fast liquid
chromatography tandem mass spectrometry (LC/MS/MS) J Steroid Biochem Mol Biol 121, pp 496-504
Haak.H.R (2015) Diagnosis value of urine steroid profiling in
the evaluation of adrenal tumor, Hormone Cancer 6: pp 168-175
Adrenal Hyperplasia, Genetic Steroid Disorders,Elsevier, San Diego,
CA
External quality assessment of urinary steroid profile analysis
Ann Clin Biochem 41: pp 474-478
analytical quality management for healthcare laboratories, Westgard Quality Corporation: pp 104-121
Ngày nhận bài báo: 28/11/2016 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 29/11/2016 Ngày bài báo được đăng: 15/05/2017