Thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban) chứa nhiều hợp chất có giá trị như alkaloid, polyphenon, triterpenoid và acetogennin… Các hợp chất này có khả năng kháng khuẩn và kháng oxy hóa. Nghiên cứu này nhằm xác định khả năng gây độc tế bào ung thư của các cao chiết từ cây Thuốc Thượng.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 TÁC DỤNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CAO CHIẾT TỪ CÂY THUỐC THƯỢNG (PHAEANTHUS VIETNAMENSIS BAN) – ANNONACEAE Bùi Thanh Phong*, Lâm Bích Thảo**, Nguyễn Thị Ái Thuận***, Trần Cơng Luận**** TÓM TẮT Giới thiệu: Thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban) chứa nhiều hợp chất có giá trị alkaloid, polyphenon, triterpenoid acetogennin… Các hợp chất có khả kháng khuẩn kháng oxy hóa Nghiên cứu nhằm xác định khả gây độc tế bào ung thư cao chiết từ Thuốc Thượng Phương pháp: Các cao chiết Thuốc Thượng như: cao alkaloid toàn phần, cao cồn toàn phần, cao diethyl ether, cao chloroform, cao n – butanol cao nước xác định khả gây độc tế bào phương pháp SRB Các dòng tế bào ung thư sử dụng bao gồm: Các dòng tế bào ung thư: MCF-7 (ung thư vú), NCI-H460 (ung thư phổi), HepG2 (ung thư gan) Hela (ung thư cổ tử cung) Kết quả: Cao alkaloid toàn phần cho kết kháng tế bào ung thư cao nhất, giá trị IC50 với dòng tế bào ung thư MCF –7, NCI - H460, HepG2, Hela 26,71, 32,28, 11,68 31,19 µg/ml Bàn luận: Có thể sử dụng cao chiết alkaloid tồn phần tác nhân hỗ trợ điều trị ung thư tương lai ABSTRACT CYTOTOXIC ACTIVITY OF THUOC THUONG(PHAEANTHUSVIETNAMENSIS BAN) AGAINST CANCER CELL LINES Bui Thanh Phong, Lam Bich Thao, Nguyen Thi Ai Thuan, Tran Cong Luan * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 20 - No - 2016: 140 - 144 Background: Phaeanthusvietnamensis Ban(Vietnamese name: ThuocThuong) contains many compounds which have bioactivity such as alkaloids, triterpenes, polyphenols, andacetogenins… These compoundsshow high antibacterial and anticancer activities This research was conducted to determine the cytotoxicability of ThuocThuong extracts for cancer treatment Methods: The extracts of Phaeanthusvietnamensisincluded: alcohol total, fractionated extracts (diethyl ether, chloroform, n-butanol, water) and total alkaloid Sulforhodamine B colorimetric assay was used for cytotoxicity screening.The following cell lines were used in the assay: MCF –7 (breast cancer cell), NCI - H460 (lung cancer cell), HepG2 (liver cancer cell), Hela (cervical cancer cell) Results: The total alkaloid showed the highest activity with the IC50 values on cancer cell lines (MCF –7, NCI - H460, HepG2 and Hela) were 26.71, 32.28, 11.68 and 31.19 µg/ml, respectively Conclusion: The total alkaloid from Phaeanthusvienamensis showed cytotoxicity The compound could be used as a potential anticancer agent in the furture Keywords: Phaeanthusvietnamensis Ban, anticancer, antibacterial loài Thuốc Thượng (Phaeanthus ĐẶT VẤN ĐỀ vietnamensis Ban) Cây có tên khác Ở Việt Nam, chi Phaeanthus (họ Na) có * Khoa Dược – Đại học Quốc tế Hồng Bàng Khoa Dược – Đại học y Dược TP HCM Tác giả liên lạc: ThS Bùi Thanh Phong *** 140 ** Trung tâm Sâm Dược liệu Đại học Tây Đô ĐT: 0934188966 Email: phongbui86@gmail.com **** Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 Thuốc Mọi, Da Xà Lắc, Thuốc Dấu Cà Doong,… loài thực vật đặc hữu vùng Trung Trường Sơn(6) Cây mọc hoang tỉnh Thừa ThiênHuế (Phú Lộc), Quảng Nam-Đà Nẵng (Đại Lộc, Quế Sơn, Núi Thành, Duy Xuyên, Tiên Phước, Phước Sơn) Bộ phận dùng lá, vỏ thân vỏ rễ, dùng để điều trị nhiễm khuẩn(7) Cho đến nay, có số nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn phân tích alkaloid từ Thuốc Thượng(5,8) Trong nghiên cứu gần đây, chi Phaeanthus (họ Na) xem nguồn giàu hợp chất có hoạt tính sinh học (alkaloid, acetogenin, triterpen, polyphenol,…) Trong đó, nhóm acetogenin alkaloid hợp chất kháng ung thư tiềm Nghiên cứu nhằm xác định hoạt tính kháng ung thư cao chiết từ Thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban) ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Dược liệu bột khô Thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban) thu hái Bà Nà-Đà Nẵng Mẫu vật định danh lưu trữ Trung tâm Sâm Dược liệu TP Hồ Chí Minh Các dòng tế bào ung thư: MCF-7 (ung thư vú), NCI-H460 (ung thư phổi), HepG2 (ung thư gan) Hela (ung thư cổ tử cung) mua từ ATCC, Hoa Kỳ Tế bào fibroblast phân lập từ da bao qui đầu người, đại diện cho tế bào thường Các dòng tế bào ung thư fibroblast nuôi cấy bảo quản Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử -Bộ môn Di truyền-trường ĐH Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh Phương pháp nghiên cứu Phương pháp điều chế mẫu thử Alkaloid toàn phần: 100 g dược liệu làm ẩm amoniac 10% sau chiết kiệt Chloroform Acid hóa dịch chiết HCl 2% thu dịch nước Kiềm hóa dịch nước amoniac 10% Lắc dịch kiềm hóa với Nghiên cứu Y học Chloroform, cạn dịch Chloroform thu cắn alkaloid(2) Cao tồn phần cao phân đoạn: 200 g dược liệu chiết ngấm kiệt cồn 96% Thu dịch cồn thành dạng cao sệt, thu cao tồn phần Lấy nửa khối lượng cao tồn phần hòa vào nước, lắc phân đoạn với dung môi ether ethylic, cloroform, n – butanol Kết thu lấy loại cao chiết ether ethylic, cloroform, n – butanol cao nước lại Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay) Tác động gây độc tế bào xác định thử nghiệm sulforhodamin B (SRB)(1,3,4,9) Thử nghiệm dựa vào khả SRB, thuốc nhuộm liên kết với protein tế bào sau tế bào cố định acid tricloroacetic Lượng thuốc nhuộm liên kết phản ánh lượng protein tổng tế bào Trong thử nghiệm, tế bào nuôi đĩa 96 giếng mật độ thích hợp Sau 24 giờ, tế bào cảm ứng với cao chiết nồng độ khác hay với DMSO 0,25 % (đối chứng) 48 Sau tế bào cố định acid tricloroacetic 50% nhuộm với SRB 0,2 % SRB hòa tan Tris 10 mM đo mật độ quang bước sóng 492 nm 620 nm Phần trăm gây độc tế bào tính cơng thức: %I = (1 - ) x 100% Với: ODTN: Giá trị OD492-620 mẫu thử nghiệm ODC : Giá trị OD492-620 mẫu đối chứng IC50 xác định cáchvẽ đồ thị biểu diễn tỷ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ khảo sát chất cần thử nghiệm phầm mềm Excel Từ đồ thị, nội suy giá trị nồng độ cho tỉ lệ gây độc tế bào 50% cách tính phương trình đường thẳng qua điểm có tỉ lệ gây độc tế bào gần 50% (1 điểm có tỉ lệ gây độc tế bào nhỏ 50%, điểm lại có tỉ lệ gây độc tế bào lớn 50%), sau từ phương trình (có 141 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 dạng y = ax + b), y = 50 vào, suy giá trị nồng độ IC50 Chứng dương sử dụng camptothecin Do camptothecin có độc tính với dòng tế bào khác nên nồng độ camptothecin sử dụng với dòng tế bào khác Nồng độ camptothecin với dòng tế bào fibroblast, Hela, Hep G2, MCF-7, NCI-H460 2,5; 1,00; 0,07; 0,01; 0,01 (µg/ml) UV 254 nm KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết chiết cao Từ 100 g dược liệu thu 3,90 g alkaloid toàn phần Từ 200 g dược liệu thu 49,80 g cao tồn phần Hòa 24,90 g cao toàn phần vào nước, cho lắc phân đoạn với dung môi ether ethylic, cloroform, n – butanol thu nhận loại cao có khối lượng 7,36 g; 5,17 g; 4,80 g; 4,22 g UV 365 nm Dragendorff Hình Sắc kí lớp mỏng phân đoạn SKLM, hệ dung môi Chloroform: MeOH: NH3(8: 2: 0,2) (Từ trái qua: Cao toàn phần, cao ether, cao Chloroform, cao alkaloid tp, cao n-BuOH, cao nước) Khi soi đèn UV 254 nm, UV 365 nm nhuộm thuốc thử Dragendorff thấy cao chiết Thuốc Thượng có vết alkaloid rõ Với cao alkaloid tồn phần cao cloroform vết alkaloid nhiều Với cao n – butanol nhiều vết alkaloid, cao nước cho vết alkaloid phân cực Kết nghiên cứu khả kháng tế bào ung thư Kết khảo sát khả gây độc tế bào in vitro Bảng Tỷ lệ (%) gây độc tế bào dòng tế bào ung thư nồng độ 50,75 100 µg/ml Cao chiết Cao tồn phần Cao ether 142 Nồng độ (µg/ml) 100 75 50 100 75 50 Phần trăm (%) gây độc tế bào (Trung bình ± Độ lệch chuẩn) MCF-7 Hela NCI-H460 HepG2 47,29 ± 2,76 17,34 ± 2,57 19,59 ± 0,30 33,30 ± 3,92 34,80 ± 2,97 15,46 ± 5,24 24,12 ± 2,50 6,09 ± 3,32 - Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 Cao chiết Nồng độ (µg/ml) Cao n - butanol Cao nước Cao cloroform Cao alkaloid toàn phần Camptothecin 100 75 50 100 75 50 100 75 50 100 75 50 0,07 0,01 Nghiên cứu Y học Phần trăm (%) gây độc tế bào (Trung bình ± Độ lệch chuẩn) MCF-7 Hela NCI-H460 HepG2 45,32 ± 3,23 22,00 ± 2,01 28,73 ± 2,93 13,63 ± 2,31 8,36 ± 3,65 -1,09 ± 3,55 7,60 ± 2,88 8,22 ± 2,36 92,34 ± 2,79 85,21 ± 3,67 64,95 ± 1,47 84,38 ± 5,27 44,31 ± 3,74 63,66 ± 5,55 81,72 ± 3,53 92,89 ± 1,49 88,91 ± 2,58 91,04 ± 2,07 78,51 ± 1,93 74,35 ± 0,52 94,24 ± 0,44 60,83 ± 3,04 59,04 ± 1,18 63,88 ± 2,26 80,75 ± 1,97 - Ghi chú: -: không thực Do số cao làm chết 50% tế bào nồng độ thấp 100 µg/ml nên nghiên cứu tiến hành nồng độ 50, 75 100 µg/ml Với cao chiết làm cho 50% tế bào ung thư chết tiếp tục thí nghiệm để xác định IC50 Theo bảng trên, cao alkaloid toàn phần cho kết gây độc tế bào dòng tế bào ung thư khảo sát mạnh nhất, kế cao cloroform Điều cho thấy hoạt tính kháng ung thư Thuốc Thượng tập trung vào nhóm hợp chất alkaloid Từ kết trên, cao alkaloid toàn phần cao cloroform sử dụng để thực thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tăng trưởng 50% quần thể tế bào mẫu thử nghiệm so với đối chứng (IC50) dòng tế bào ung thư nêu dòng tế bào lành đối chứng nguyên bào sợi người (fibroblast) Thử nghiệm xác định IC50 cao chiết dòng tế bào ung thư Bảng IC50 (µg/ml) mẫu dòng tế bào ung thư tế bào fibroblast STT Tên Cao Alkaloid toàn phần Cao cloroform MCF-7 26,71 ± 1,37 37,40 ± 2,24 Hela 31,19 ± 2,40 55,10 ± 2,30 Hai cao chiết alkaloid toàn phần cao cloroform cho hiệu ức chế tế bào ung thư cao Cao cloroform chứa alkaloid hợp chất khác nên cho kết thấp alkaloid toàn phần, khả kháng ung thư alkaloid toàn phần mạnh 1,5 lần so với cao cloroform Kết chứng minh khả kháng ung thư thực chủ yếu nhờ vai trò alkaloid có Thuốc Thượng Alkaloid tồn phần cao cloroform cho kết ức chế tế bào ung thư cao với dòng tế bào Hep G2, kế dòng MCF – 7, dòng Hela Dòng tế bào NCI-H460 32,28 ± 1,84 56,53 ± 3,85 HepG2 11,68 ± 0,41 15,29 ± 1,76 fibroblast 71,50 ± 2,46 > 100 cuối dòng NCI – H460 Đồng thời cao chiết gây độc tế bào thường KẾT LUẬN Dịch chiết Thuốc Thượng cho khả ức chế tế bào ung thư Hela, Hep G2, MCF-7, NCI-H460, cao alkaloid tồn phần thể tác dụng mạnh Bên cạnh đó, khả gây độc tế bào lành tính nguyên bào sợi cao chiết thấp loại tế bào ung thư Do vậy, tiếp tục nghiên cứu sâu độc tính Thuốc Thượng thể động 143 Nghiên cứu Y học vật, tiến tới ứng dụng vào chế phẩm hỗ trợ điều trị ung thư hiệu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 TÀI LIỆU THAM KHẢO 144 Alley MC, Scudiero DA, Monks A et al (1988) Feasibility of Drug Screening with Panels of Human Tumor Cell Lines Using a Microculture Tetrazolium Assay Cancer Research, 48(3): 589-601 Hội đồng dược điển (2002) Dược điển Việt Nam IV Bộ Y tế, tr.120-200 Monks A, Scudiero D, Skehan P, Shoemake R, Paull K, Vistica D, Hose C, Langley J, Cronise P, Campbell H, Mayo J, Boyd M (1991) Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines Journal of National Cancer Institute, 11(83): 757-766 Nguyễn Thái Hoàng Tâm, Nguyễn Thụy Vy, Tất Tố Trinh, Nguyễn Thị Tuyết Giang, Hồ Huỳnh Thùy Dương, Nguyễn Ngọc Hạnh (2007) Chuẩn hóa thử nghiệm Sulforhodamine B (SRB) để xác định tính gây độc tế bào hợp chất tự nhiên Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống Nhà xuất khoa học kỹ thuật Quy Nhơn, tr.809-811 Nguyen Thi Nghia, Ivo V (1991) Alkaloids from leaves of Phaeanthus vietnamensis Fitoterapia 62(4): 315-318 Nguyễn Tiến Bân (2000) Thực vật chí Việt Nam, Tập – Annonaceae NXB Khoa học Kỹ Thuật, tr.45-67 10 Nguyễn Tiến Bân (2007) Sách đỏ Việt Nam – Phần II: Thực Vật NXB Khoa Học Tự Nhiên Công Nghệ, tr.370 Petr S, Nguyen Thi Nghia, Ivo V, Vilim S (1990) “A new bisbenzylisoquinoline alkaloid from Phaeanthus vietnamensis and its antibacterial activity” Heterocycles (Tokyo), 30(1): 205210 Scudiero DA, Shoemaker RH, Paull KD, Monks A, Tierney S, Nofziger TH, Currens MJ, Seniff D, Boyd MR (1988) Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines Cancer Res, 48: 4827-4833 Trần Công Luận, Huỳnh Thị Ngọc Lan, Bùi Thanh Phong, Đặng Ngọc Phái (2015) Tác dụng kháng khuẩn cao chiết từ Thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban) Tạp chí Y Học TP.HCM, tập 19, số 5, tr.165-168 Ngày nhận báo: 30/08/2016 Ngày phản biện nhận xét báo: 20/09/2016 Ngày báo đăng: 25/11/2016 ... dòng NCI – H460 Đồng thời cao chiết gây độc tế bào thư ng KẾT LUẬN Dịch chiết Thuốc Thư ng cho khả ức chế tế bào ung thư Hela, Hep G2, MCF-7, NCI-H460, cao alkaloid tồn phần thể tác dụng mạnh... gây độc tế bào in vitro Bảng Tỷ lệ (%) gây độc tế bào dòng tế bào ung thư nồng độ 50,75 100 µg/ml Cao chiết Cao tồn phần Cao ether 142 Nồng độ (µg/ml) 100 75 50 100 75 50 Phần trăm (%) gây độc tế. .. Theo bảng trên, cao alkaloid toàn phần cho kết gây độc tế bào dòng tế bào ung thư khảo sát mạnh nhất, kế cao cloroform Điều cho thấy hoạt tính kháng ung thư Thuốc Thư ng tập trung vào nhóm hợp